全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (11): 1707~1716　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0401 1707
收稿 2014-09-09　　修定 2014-10-14
资助 国家自然科学基金(31301789)和国家“863”计划(2012AA-
100104)。
* 通讯作者(E-mail: hxli@mail.hzau.edu.cn; Tel: 027-
87286867)。
番茄低温响应转录因子SlNAC41克隆及表达分析
刘辉1, 王涛涛2, 张俊红2, 欧阳波2, 李汉霞2,*
1中国热带农业科学院橡胶研究所, 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室, 海南儋州571737; 2华中农业大学园艺
林学学院, 园艺植物生物学教育部重点实验室, 武汉430070
摘要: NAC转录因子在调控植物生长发育、生物及非生物逆境应答中发挥着重要作用。前期, 我们通过对番茄幼苗在低温
胁迫下的基因表达谱进行分析, 发现Unigene SGN-U212711受低温诱导表达强烈。本研究从番茄中克隆了该基因, 命名为
SlNAC41, 其开放阅读框(ORF) 1 173 bp, 编码390个氨基酸, 蛋白N端具有典型的NAM结构域, 属于NAC转录因子家族成
员。预测SlNAC41蛋白分子量为43.5 kDa, 等电点为5.2。实时荧光定量PCR分析表明, SlNAC41在番茄各组织均有表达, 在
花中的表达量最高, 在红熟果中的表达量最低。低温、干旱、高盐、甲基紫精(MV)、脱落酸(ABA)及乙烯利(ETH)处理均
能诱导该基因的表达, 其中, 以低温和干旱诱导表达最为强烈。利用PLACE和PlantCARE对启动子序列进行预测分析发现,
SlNAC41启动子区含有大量响应光、病原菌侵染、激素、低温、脱水及盐胁迫的顺式作用元件。这些结果表明, SlNAC41
可能在番茄生物及非生物胁迫应答中发挥重要调控作用。
关键词: 番茄; NAC转录因子; 基因克隆; 表达分析; 非生物胁迫
Cloning and Expression Analysis of a Cold-Responsive Transcription Factor
SlNAC41 in Tomato
LIU Hui1, WANG Tao-Tao2, ZHANG Jun-Hong2, OUYANG Bo2, LI Han-Xia2,*
1Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2Key Laboratory of Horticultural Plant Biology,
Ministry of Education, College of Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract: NAC transcription factors play vital roles in regulating plant growth and developmental processes as
well as in response to biotic and abiotic stresses. In our previous study, Unigene SGN-U212711 was found to be
strongly induced by low temperature through analyzing the gene expression profiles of tomato seedlings under
cold stress. In this study, we cloned this gene (designated as SlNAC41) from tomato. SlNAC41 had an open
reading frame (ORF) of 1 173 bp encoding 390 amino acids with a typical NAM domain in its N-terminal, sug-
gesting that it belonged to NAC transcription factor family. The molecular weight and isoelectric point of
SlNAC41 protein was 43.5 kDa and 5.2, respectively. Quantitative real-time PCR analysis showed that
SlNAC41 was expressed in all tested tomato tissues, with the highest expression in flowers and the lowest
expression in mature red fruits. Expression of SlNAC41 was induced by cold, drought, salt, methyl viologen
(MV), abscisic acid (ABA) and ethephon (ETH) treatments, especially was strongly induced by cold and
drought stresses. Promoter sequence analyzed by PLACE and PlantCARE showed that there were many
cis-acting regulatory elements involved in response to light, pathogen infection, hormones, cold, dehydration
and salt stresses. These results suggest that SlNAC41 may play important roles in regulating biotic and abiotic
stress responses in tomato.
Key words: tomato; NAC transcription factor; gene cloning; expression analysis; abiotic stress
NAC (NAM、ATAF1,2和CUC2)转录因子是
植物特有的一类非常重要的转录因子。其蛋白N
端具有一个保守的约150个氨基酸组成的NAC结
构域, 含有A、B、C、D和E五个亚结构域; 蛋白C
端为转录调控区, 氨基酸序列具有高度的多样性,
具有转录激活或转录抑制活性(Nakashima等2012;
Puranik等2012; 李小兰等2013)。研究表明, NAC
植物生理学报1708
转录因子在植物生长发育中具有重要的调控作用,
包括植物顶端分生组织形成、次生细胞壁发育、
花器官发育、侧根发育和组织器官衰老等(陈秀玲
等2014; 杨晓娜等2014)。Hao等(2011)研究发现,
大豆GmNAC20基因通过改变生长素相关基因的表
达调控侧根的发育。在番茄、拟南芥、杨树等物
种中均发现超量表达某一NAC转录因子使转基因
植株变矮的现象(Zhong等2011; Dai等2012; 杨春文
等2012)。在拟南芥中超量表达白菜NAC转录因子
BrcCUC3发现, 转基因植株叶缘出现裂刻、主枝增
加(惠麦侠等2012)。NAC转录因子是植物次生细
胞壁发育的重要分子调控开关 (Wang和Dixon
2012)。拟南芥中已鉴定了一系列在次生细胞壁发
育过程中作为关键的调控因子的NAC转录因子。
如NST1、NST2、NST3/SND1、SND2及VND7等
(Zhong等2006; Mitsuda等2007; Hussey等2011;
Yamaguchi等2011)。
除参与植物生长发育调控外, NAC转录因子
在植物应答生物及非生物逆境中也发挥重要调控
作用。近年来, 利用超量表达、T-DNA插入突变
及RNAi等技术已从许多物种中分离鉴定了调控植
物非生物逆境抗性的NAC转录因子 , 如拟南芥
ANAC096 (Xu等2013)和ANAC013 (De Clercq等
2013)、水稻OsNAP (Chen等2014)、小麦TaNAC67
(Mao等2014)、大豆GmNAC30和GmNAC81
(Mendes等2013)、葡萄VvNAC1 (Le Henanff等
2013)等。逆境条件下, NAC转录因子的表达被激
活, 经转录、转录后和翻译后水平调控后, 形成具
有功能的NAC蛋白, 进而同启动子区的NAC识别
位点(NAC recognition sequence, NACRS)相结合,
从而调控相应基因的表达。许多逆境相关基因的
启动子区均含有NACRS, 如R2R2-MYB、GST、
RD29及CBF3基因等(Puranik等2012)。这些基因
直接行使功能或进一步调节下游其他逆境相关基
因的表达, 从而使植株抵御并适应不利的外界环
境。如大豆NAC转录因子GmNAC20在拟南芥中
超量表达后, 通过调控CBF/DREB-COR途径提高
了植株抗逆性(Hao等2011)。
全基因组分析发现, 番茄基因组中至少含有
102个NAC转录因子(陈秀玲等2014)。前期, 我们
利用基因芯片对抗寒和冷敏感番茄在低温胁迫下
的基因表达差异进行分析, 共发现18个NAC转录
因子受低温胁迫诱导。其中Unigene SGN-U212711
受低温诱导表达强烈(Liu等2012)。据此, 本研究
从番茄中克隆了该基因, 并分析了其编码蛋白质
序列的结构特征、进化关系及该基因在番茄不同
组织及非生物逆境胁迫处理下的表达模式, 以期
为进一步揭示该基因的生物学功能及调控机制奠
定基础。
材料与方法
1 植物材料与处理
本研究以栽培番茄(Solanum lycopersicum L.)
品种‘LA4024’为试验材料。选取籽粒饱满、大小
一致的种子, 催芽后播种于盛有混合基质(蛭石:珍
珠岩:园土=1:1:1)的72孔穴盘中。春季自然条件下
生长2周后, 单株移栽至含有等量混合基质的营养
钵内。生长3周后用于各种逆境胁迫处理。植株
置于4 ℃、光照强度150 μmol·m-2·s-1、光照时间
16 h·d -1的冷库中用于低温诱导处理; 植株洗去
基质并吸干水分后, 分散放在干燥的滤纸上, 置于
25 ℃, 相同光照强度及时间的环境中用于干旱诱
导; 植株根部浸于400 mmol·L-1 NaCl溶液中用于盐
胁迫诱导; 100 µmol·L-1 ABA、10 mmol·L-1乙烯利
(ETH)及100 µmol·L-1甲基紫精(MV)溶液(含0.1%
吐温-20)喷施叶面用于ABA、ETH及氧化胁迫处
理。各处理在0、1、3、6、12、24和48 h取第2片
叶经液氮速冻后–80 ℃保存, 用于RNA提取。每处
理时间点取6株混样。
6月初, 于同一天从6株‘LA4024’植株上分别
采集根、茎、嫩叶、成熟叶、衰老叶、花、绿熟
果和红熟果, 液氮速冻后–80 ℃保存, 用于RNA提
取。
2 总RNA提取、反转录及目标基因的克隆
各组织及诱导处理叶片总R N A提取采用
TRIzol法, 具体操作步骤参见Invitrogen公司TRIzol
试剂盒说明书。第一链cDNA的合成参照TaKaRa
公司的PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit
说明书进行。
根据Unigene SGN-U212711序列, 利用Primer
3 (http://primer3.ut.ee/)在线软件设计包含全长ORF
(open reading frame, 开放阅读框)的特异性引物(正
刘辉等: 番茄低温响应转录因子SlNAC41克隆及表达分析 1709
向引物序列: 5′-CATCTGTCTACCATGCGTCC-3′;
反向引物序列 : 5 ′ - C A A G TAT G TA G A A A C -
TAGAAAGGCA-3′)。以反转录cDNA第一链为模
板 , 通过PCR扩增目标基因 , 反应体系设置为 :
cDNA模板2 μL, 10×Ex Taq Buffer 2.5 μL, dNTP
(2.5 mmol·L-1 each) 2 μL, 上下游引物(10 μmol·L-1)
各0.5 μL, PyrobestTM DNA Taq (5 U·μL-1) 0.3 μL, 加
ddH2O至终体积25 μL。PCR反应程序为94 ℃预变
性5 min; 94 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸
1.5 min, 共设置30个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR
产物电泳回收纯化后连接到pMD18-T载体, 送公
司测序。
3 实时荧光定量PCR分析
根据测序结果设计SlNAC41实时荧光定量
PCR (qPCR)引物。正、反向引物序列分别为
5′-CGAAAGGGCAGCGTGATCT-3′和5′-CGTTAC-
CGCTAGTGTCTGGG-3′。以番茄EF1a作为内参
基因(Lovdal和Lillo 2009), 正、反向引物序列分别
为 5 ′ - C G T G G T TAT G T T G C C T C A A A - 3 ′和
5′-ACAGCAATGTGGGAAGTGTG-3′。qPCR在
Bio-rad CFX96荧光定量PCR仪进行, 20 μL反应体
系包含SYBR® Premix Ex Taq™ (2×) 10 μL, 正反向
引物各1 μL, 模板2 μL, 加ddH2O至终体积20 μL。
反应条件: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃ 10 s, 58 ℃ 30 s,
40个循环后进行熔解曲线分析, 以确定引物的特
异性。基因相对表达量的计算采用公式2-∆∆CT (Li-
vak和Schmittgen 2001)。
4 生物信息学分析
从番茄功能基因组数据库(http://ted.bti.cor-
nell.edu/)中获取Unigene SGN-U212711序列信息。
使用SoftBerry (http://linux1.softberry.com/berry.
phtml)及DNAMAN 4.0软件分析SlNAC41基因序列
的ORF, 并推导出基因编码的氨基酸序列。以
SlNAC41基因序列为探针, 对番茄基因组数据库
(SGN, http://solgenomics.net/, SL2.50)进行比对, 以
确定该基因在染色体上的位置 , 并获取该基因
gDNA序列。利用SoftBerry软件对gDNA序列外显
子和内含子构成进行分析。通过在线数据库NCBI
CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi)和Prosite (http://prosite.expasy.org/)预测
SlNAC41蛋白保守结构域; 用Compute pI/Mw
(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测蛋白等电
点和分子量; 用NetGlycate 1.0 (http://www.cbs.dtu.
dk/services/NetGlycate/)和NetPhos 2.0 (http://www.
cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在线软件预测蛋白糖
基化位点和磷酸化位点; 利用在线软件ProtScale
(http://web.expasy.org/protscale)预测SlNAC41氨基酸
序列的疏水性/亲水性; 蛋白跨膜结构域及亚细胞定
位情况分别采用在线软件TMHMM 2.0 (http://www.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和ProtComp v.9.0
(http://linux1.softberry.com/berry)进行; 通过NCBI
BlastP进行蛋白序列比对分析, 选择与SlNAC41蛋
白同源的其他植物NAC氨基酸序列利用MEGA6.0
软件中Neighbor-Joining算法构建系统进化树。
5 启动子区域顺式作用元件分析
以SlNAC41基因序列为探针, 对番茄基因组数
据库(SGN, SL2.50)进行比对, 获取该基因起始密
码子上游1 500 bp的启动子区序列。利用在线软件
PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/
webtools/plantcare/html/)和PLACE (http://www.dna.
affrc.go.jp/PLACE/)对启动子区的顺式作用元件进
行分析。
实验结果
1 SlNAC41基因克隆及序列分析
通过对番茄幼苗在低温胁迫下的基因表达差
异分析, 我们发现Unigene SGN-U212711在4 ℃处
理3 d后的表达显著上调(Liu等2012)。该Unigene
长1 322 bp, 通过SoftBerry在线软件进行基因预测,
发现SGN-U212711包含完整的ORF, 长1 173 bp。
为进一步验证该Unigene的可靠性, 在ORF的两端
设计特异引物 , 通过PCR从番茄品种‘LA4024’
cDNA中扩增出了与预期片段大小一致的条带(图
1)。测序结果表明, 该产物序列与SGN-U21271同
源性为100%。以测序序列作为探针, 在番茄基因
组数据库中进行比对分析, 发现该基因位于第4条
染色体61 857 677至61 853 024区段。该基因
gDNA序列包含5个外显子和4个内含子。根据该
gDNA序列预测的全长cDNA序列和编码的蛋白已
提交GenBank, 登录号分别为XM_004238178.1和
XP_004238226.1。我们扩增的序列与该全长cDNA
序列完全一致。在陈秀玲等(2014)对番茄全基因
植物生理学报1710
组NAC转录因子进行鉴定时, 将该基因命名为Sl-
NAC41, 本研究继续沿用该名。
SlNAC41编码390个氨基酸, 蛋白相对分子量
为43.5 kDa, 等电点为5.2。利用NCBI CDD数据库
对SlNAC41蛋白保守结构域进行分析发现, 该蛋白
N端具有一个典型的NAM保守结构域(图2)。该保
守结构域由98个氨基酸组成, 分布在第19~116位
氨基酸之间。由此推断, 番茄SlNAC41属于NAC家
族转录因子。利用Prosite对保守结构域预测发现,
SlNAC41除含有NAC保守结构域外, 该蛋白序列N
端还含有一个原核膜脂蛋白脂结合位点, 位于第
1~17位氨基酸区域, 其中, 第1~16位氨基酸为脂质
图1 番茄SlNAC41基因的PCR扩增
Fig.1 PCR amplification of tomato SlNAC41 gene
图2 SlNAC41 cDNA序列及其推导的氨基酸序列
Fig.2 SlNAC41 cDNA sequence and its deduced amino acid sequence
下划实线部分代表NAM结构域; 下划虚线部分为原核膜脂蛋白脂结合位点; △标识脂质化位点; □标识糖基化位点; ○标识磷酸化位
点; *标识终止密码子。
刘辉等: 番茄低温响应转录因子SlNAC41克隆及表达分析 1711
化信号肽区域, 第17位半胱氨酸为脂质化位点。
同时, SlNAC41蛋白还含有7个糖基化位点和47个
磷酸化位点。糖基化位点分别位于第63、77、
194、271、337、341和376位氨基酸。磷酸化位
点中包括35个丝氨酸磷酸化位点、9个苏氨酸磷
酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点(图2)。
TMHMM2.0分析结果表明, 该蛋白不含跨膜
结构域。ProtComp v.9.0亚细胞定位分析显示细胞
核的得分最高, 推测SlNAC41蛋白可能定位于细胞
核。ProtScale预测SlNAC41氨基酸序列的疏水性/
亲水性如图3所示。根据氨基酸分值越低亲水性
越强, 分值越高疏水性越强的规律, 可以看出, 多
肽链第305位具有最高的分值1.7和最强的疏水性;
第376位具有最低的分值–3.7和最强的亲水性。Sl-
NAC41大部分氨基酸具有亲水性, 推测该蛋白属
于亲水性蛋白。
2 SlNAC41转录因子的系统进化分析
利用NCBI BlastP进行氨基酸序列同源性分析
表明, SlNAC41与马铃薯一个功能未知蛋白(XP_
006367296.1)氨基酸同源性最高, 相似性达86%。
拟南芥中与SlNAC41同源性最高的NAC转录因子
为ANAC38, 相似性为52%。进一步利用MEGA6.0
软件将SlNAC41与通过NCBI BlastP获取的17种
NAC氨基酸序列构建系统进化树发现, 这些NAC
转录因子可明显的分为两大类。SlNAC41与马铃
薯、川桑、苎麻、葡萄、毛果杨、麻疯树和蓖麻
中的NAC转录因子归为一类。这些转录因子均属
于功能未知的蛋白, 这表明对于这一类NAC转录
因子的研究较少。另一番茄NAC转录因子NAC100-
like则与拟南芥ANAC11、ANAC28、ANAC38、
ANAC58、水稻OsNAC1及棉花GhNAC55等聚为
一类(图4)。
3 SlNAC41启动子区的顺式作用元件分析
利用SlNAC41基因序列对番茄基因组数据库
(SGN, release v2.50)进行比对分析, 获得起始密
码子上游1 500 bp的启动子序列。利用在线软件
PlantCare和PLACE对启动子序列进行顺式作用元
件分析, 结果表明, SlNAC41启动子序列中除含有
图3 番茄SlNAC41蛋白疏水性/亲水性预测
Fig.3 Predication of hydrophobicity/hydrophilicity of tomato
SlNAC41 protein
图4 SlNAC41与其他植物NAC蛋白的系统进化树分析
Fig.4 Phylogenetic tree analysis of SlNAC41 and other plant NACs
植物生理学报1712
大多数启动子具有的基本转录元件TATA-box和
CAAT-box外, 还存在大量与光响应、激素应答、
生物及非生物胁迫应答相关的顺式作用元件。其
中与光响应相关的顺式作用元件最多, 达8种48个,
包括-10PEHVPSBD (1个)、GATABOX (17个)、
GT1CONSENSUS (20个 )、AE-box (4个 )、
CATT-motif (1个)、GAG-motif (2个)、chs-CMA1a
(2个)和GT1-motif (1个)等元件(表1)。这些调控元
件的存在暗示SlNAC41基因的表达可能受光照调
控。SlNAC41启动子区还存在许多激素响应元件,
如赤霉素(GA)应答元件CAREOSREP1、GARE-
1OSREP1、GAREAT、MYBGAHV、GARE-motif
及WRKY71OS, 脱落酸(ABA)响应元件MYB1AT
和MYCCONSENSUSAT, 生长素应答元件ARFAT
和TGA-element, 水杨酸(SA)应答元件TCA-ele-
ment和WBOXATNPR1等(表1)。这些激素响应顺
式作用元件的存在表明SlNAC41基因在相应激素
信号转导过程中可能发挥重要作用。同时 , Sl-
NAC41启动子区域还存在许多与生物及非生物胁
迫应答相关的顺式作用元件, 其中与抗病相关的
顺式作用元件有6种28个, 包括10个WRKY71OS、
9个GT1GMSCAM4、5个WBOXATNPR1、2个
表1 SlNAC41启动子区顺式作用元件分析
Table 1 Analysis of cis-acting regulatory elements of SlNAC41 promoter
元件名称 元件核心序列 元件个数 元件功能
-10PEHVPSBD TATTCT 1 光调控、生理韵律
GATABOX GATA 17 光调节、组织特异表达
AE-box AGAAACAA 4 光响应元件
CATT-motif GCATTC 1 光响应元件
GAG-motif AGAGAGT 2 光响应元件
chs-CMA1a TTACTTAA 2 光响应元件
GT1-motif AATCCACA 1 光响应元件
GT1CONSENSUS GRWAAW 20 光和SA调控元件
ARFAT TGTCTC 2 生长素和油菜素内酯调控
CAREOSREP1 CAACTC 1 GA调控元件
GARE1OSREP1 TAACAGA 1 GA响应元件
GAREAT TAACAAR 3 GA响应元件
MYBGAHV TAACAAA 2 GA响应元件
GARE-motif TCTGTTG 2 GA响应元件
TGA-element AACGAC 2 生长素响应元件
TCA-element CAGAAAAGGA 1 SA响应
MYB1AT WAACCA 3 脱水及ABA应答元件
MYCCONSENSUSAT CANNTG 6 响应脱水、低温及ABA
WBOXATNPR1 TTGAC 5 抗病及SA应答
WRKY71OS TGAC 10 病原物及GA应答
BIHD1OS TGTCA 1 抗病反应
SEBFCONSSTPR10A YTGTCWC 2 病原物相关
ELRECOREPCRP1 TTGACC 1 应答病原菌激发子
GT1GMSCAM4 GAAAAA 9 病原菌及盐胁迫诱导表达
MYBCORE CNGTTR 6 脱水应答
ACGTATERD1 ACGT 2 脱水应答
CCAATBOX1 CCAAT 3 热激响应元件
CURECORECR GTAC 4 铜离子及氧化胁迫应答
WBOXNTERF3 TGACY 9 伤害应答
TC-rich repeats ATTTTCTTCA 3 防御及逆境响应
TAAAGSTKST1 TAAAG 5 保卫细胞特异性表达
AACACOREOSGLUB1 AACAAAC 1 胚乳特异性表达
OSE2ROOTNODULE CTCTT 2 器官特异性元件
ROOTMOTIFTAPOX1 ATATT 4 根特异性元件
刘辉等: 番茄低温响应转录因子SlNAC41克隆及表达分析 1713
SEBFCONSSTPR10A、1个BIHD1OS及1个EL-
RECOREPCRP1元件; 与非生物逆境应答相关的顺
式作用元件包括脱水响应元件ACGTATERD1、
MYB1AT和MYBCORE, 盐胁迫应答元件GT1GM-
SCAM4, 低温应答元件MYCCONSENSUSAT, 热
激响应元件CCAATBOX1, 氧化胁迫应答元件CU-
RECORECR及伤害诱导元件WBOXNTERF3等(表
1)。这些生物及非生物胁迫应答元件的存在暗示
SlNAC41可能在番茄应答生物及非生物胁迫中发
挥重要调控作用。除此之外, SlNAC41启动子区域
还含有一些组织特异性顺式作用元件, 如GATA-
BOX、GATABOX、AACACOREOSGLUB1、OS-
E2ROOTNODULE及ROOTMOTIFTAPOX1等(表
1)。这些顺式作用元件的存在可能决定了SlNAC41
在番茄各组织中的表达差异。
4 SlNAC41基因组织表达特性
qPCR分析结果表明, SlNAC41基因在番茄
根、茎、嫩叶、老叶、花、绿熟果和红熟果中均
有表达, 其中在花中表达量最高, 其次是成熟叶。
以老叶中的表达量为对照, 花和成熟叶中该基因
的表达分别为老叶的4.1和3.0倍。根、茎、嫩叶
和绿熟果中该基因的表达也略高于老叶。S l -
NAC41基因在红熟果中的表达量最低, 仅为老叶中
表达量的1/5。
5 逆境胁迫及激素处理下SlNAC41的表达特性
为明确SlNAC41在番茄逆境胁迫应答中的作
用, 我们利用qPCR分析了该基因在不同逆境胁迫
及相关信号分子处理下的表达谱(图6)。低温胁迫
下, SlNAC41的表达迅速提高。4 ℃低温处理1 h时,
该基因的表达较对照上调了5.0倍, 处理3 h时上调
了10.8倍, 并维持该水平至处理12 h; 随后该基因
的表达再次急剧上升, 处理24 h时上调了18.4倍, 此
后略有下降(图6-A)。SlNAC41对干旱的响应也十
分迅速, 植株脱水3 h时, 该基因的表达就上调了8.9
倍; 脱水12 h时, 该基因表达量达到最高, 为处理前
的11.4倍; 而后表达量持续下降, 但仍高于对照, 处
理48 h时 , 该基因表达量为处理前的4.5倍 (图
6-B)。SlNAC41受盐胁迫诱导表达的强度要比低
温和干旱处理弱很多。盐胁迫早期, 该基因的表
达上升较缓和, 处理6 h时仅上调了2.0倍; 之后该
基因的表达快速上升, 处理12 h时, 上调了4.7倍;
此后该基因的表达基本维持在这一水平(图6-C)。
ABA和ETH处理均能诱导SlNAC41表达, 相比较而
言, ETH诱导的强度更高些。两种处理条件下, Sl-
NAC41的表达均呈先升高后下降趋势(图6-D、
E)。ABA处理12 h时, SlNAC41的表达达到最大值,
为处理前的2.9倍; 此后逐步下降, 处理48 h时, 该
基因的表达基本恢复到处理前的水平(图6-D)。
ETH处理在24 h时SlNAC41的表达上升到最大值,
较处理前上调了6.6倍; 而后迅速下降, 但仍高于对
照, 处理48 h时, 该基因表达量为处理前的3.6倍(图
6-E)。MV诱导的氧化胁迫下, SlNAC41基因的表
达缓慢升高, 处理12 h时, 表达量达到最大值, 为处
理前的3.2倍(图6-F)。以上结果表明, SlNAC41基
因的表达受低温、干旱、高盐、氧化胁迫及逆境
相关信号分子ABA和ETH的诱导, 其中以低温和
干旱胁迫诱导表达最为迅速和强烈。
讨　　论
NAC转录因子是植物特有的一大类转录因
子, 对植物许多重要农艺性状起着关键的调控作
用, 包括生长发育、衰老、激素应答、生物及非
生物逆境应答等(Christiansen等2011)。全基因组
分析发现, 拟南芥、水稻、烟草及杨树基因组中
分别含有117、151、152和163个NAC转录因子
(Puranik等2012)。初步分析表明, 番茄基因组中至
少含有102个NAC转录因子(陈秀玲等2014), 其中,
18个受低温胁迫诱导(Liu等2012)。本研究克隆的
SlNAC41为其中受低温诱导表达较强烈的一个。
图5 SlNAC41在番茄不同组织的表达
Fig.5 Expression of SlNAC41 in different tomato tissues
植物生理学报1714
SlNAC41蛋白N端具有典型的NAM保守结构域,
表明该基因属于NAC转录因子家族。陈秀玲等
(2014)将番茄中的NAC转录因子划分为12个亚族,
SlNAC41属于第11亚族。系统进化分析表明, 与Sl-
NAC41亲缘关系较近的马铃薯、川桑、苎麻、葡
萄、毛果杨、麻疯树和蓖麻中的NAC转录因子均
属于功能未知的蛋白; 拟南芥中与SlNAC41序列
相似性最高的为ANAC38, 该基因的功能也尚不清
楚, 这表明SlNAC41是一功能未知的新基因。对Sl-
NAC41功能及调控机制的研究将有助于阐明该类
基因的生物学功能及调节机理。
已有研究表明, NAC转录因子在花发育中发
挥重要调控作用, 如拟南芥AIF (Shih等2014)、玫
瑰RhNAC100 (Pei等2013)、番茄SlNAM2 (Hendel-
man等2013)等基因。组织表达谱分析表明, Sl-
NAC41在番茄各组织中均有表达, 但表达丰度不
同, 其中在花中的表达量最高, 这表明SlNAC41可
能参与了番茄花发育调控。诱导表达分析表明,
SlNAC41表达受低温、干旱、高盐、氧化胁迫及
ABA和ETH诱导, 其中, 受低温和干旱诱导表达尤
为强烈, 这暗示SlNAC41可能在番茄低温和干旱胁
迫应答中发挥重要调控作用。蛋白亲水性/疏水性
图6 低温(A)、干旱(B)、高盐(C)、ABA (D)、ETH (E)及MV (F)胁迫下SlNAC41的表达模式
Fig.6 Expression patterns of SlNAC41 in response to cold (A), drought (B), salt (C), ABA (D), ETH (E) and MV (F) treatments
刘辉等: 番茄低温响应转录因子SlNAC41克隆及表达分析 1715
预测结果表明, SlNAC41蛋白具有较强的亲水性
(图3)。逆境胁迫条件下, SlNAC41大量表达可能会
增加细胞的保水能力, 从而减少细胞失水和防止
细胞脱水, 提高植株对非生物逆境胁迫的抗性。
此外, SlNAC41蛋白三级结构与水稻NAC转录因
子SNAC1三级结构模型相似, 暗示二者可能具有
相似的功能。SNAC1在水稻非生物逆境胁迫中起
着重要调控作用, 超量表达该基因能显著提高水
稻植株的抗旱和耐盐性(Hu等2006)。超量表达Sl-
NAC41能否提高番茄的非生物逆境抗性有待进一
步研究。
启动子区的顺式作用元件在决定基因的时空
表达特性中起着重要作用。在SlNAC41启动子区
含有大量激素、生物及非生物胁迫应答元件, 如
MYB1AT、MYCCONSENSUSAT、WBOXATNPR1、
WRKY71OS、GT1GMSCAM4、MYBCORE及
WBOXNTERF3等。SlNAC41受低温和干旱等诱导
表达可能与这些顺式作用元件的存在有关。MY-
B1AT和MYBCORE是MYB转录因子的结合位点,
WRKY71OS是WRKY转录因子的结合位点, MY-
CCONSENSUSAT是MYC转录因子的结合位点,
这些位点的存在暗示SlNAC41的表达可能受上游
MYB、MYC及WRKY转录因子的调控。拟南芥
中, MYCCONSENSUSAT元件是MYC转录因子
ICE1的结合位点, ICE1通过与CBF基因启动子区
的MYCCONSENSUSAT元件结合调控CBF途径相
关基因的表达 , 从而调控植株的抗寒性(Chin-
nusamy等2003)。据此, 我们推测SlNAC41可能受
番茄ICE1或类似ICE1蛋白的调控。低温胁迫下,
SlNAC41的表达持续上升, 且表达量很高, 这也暗
示该基因可能在番茄抗寒中发挥重要调控作用。
本项目组将通过基因工程技术验证该基因在番茄
非生物逆境应答中的功能, 并试图进一步揭示其
调控的分子机制。
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