全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 549
收稿 2009-01-09 修定 　2009-05-20
资助 国家自然科学基金(30 6 70 2 0 4)、科技部国际合作项目
( 2 0 0 6 D F B 6 3 4 0 0 ) 和 “ 十一五 ” 科技支撑项目
(2 006 BAD 07 A04 )。
* 通讯作者(E-mail: scuchenfang@yahoo.com.cn; Tel: 028-
8 5 4 1 7 2 8 1 )。
麻疯树中ADP核糖基化因子基因的克隆和表达
林凡荣, 秦小波, 朱勋路, 叶生亮, 高继海, 徐莺, 陈放*
四川大学生命科学学院 /生物资源与生态环境教育部重点实验室, 成都 610064
提要: 从麻疯树 cDNA文库中筛选到包含完整编码序列的 ADP核糖基化因子的 cDNA序列, 命名为 Jc-arf。其长度为 887
bp, 开放阅读框 546 bp, 推测的编码蛋白含 181个氨基酸残基, 具有典型的GTP结合蛋白家族的特点: P框(GLDAAGKT)、
G’框(DVGGQ)和G框(NKQDL)。序列分析显示, Jc-arf接近于人类ClassI型 arf基因, 其蛋白序列与多种植物ARF有很高
的同源性。半定量RT-PCR结果显示, Jc-arf的表达具有一定的组织特异性, 在花中最丰富。PEG、低温、NaCl胁迫下, Jc-
arf的表达受PEG和低温的诱导, 而对NaCl胁迫不敏感。
关键词: 麻疯树; ADP核糖基化因子; 表达; 胁迫
Cloning and Expression of an ADP-ribosylation Factor Gene in Jatropha curcas L.
LIN Fan-Rong, QIN Xiao-Bo, ZHU Xun-Lu, YE Sheng-Liang, GAO Ji-Hai, XU Ying, CHEN Fang*
Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University,
Chengdu 610064, China
Abstract: An ADP-ribosylation factor gene, named Jc-arf, was cloned from Jatropha curcas. The cloned cDNA
included a 546 bp complete open reading frame, which encoded a 181 amino acids peptid. This putative peptid
contained three motifs: GLDAAGKT, DVGGQ and NKQDL, which involved in the feature of GTP-binding
proteins. The alignment results showed Jc-ARF was high identity with many ARFs in other plants, and it was
similar to ClassI of human ARFs. The semi-quantitative PCR results showed that Jc-arf expression was the
highest in flowers. Further, the expression of Jc-arf could be induced in roots, stems and leaves by PEG, in
roots under cool stress. However, it seemed insensitive to the NaCl stress.
Key words: Jatropha curcas; ADP-ribosylation factor; expression; stress
ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,
ARF)是小G蛋白家族(RAS、RHO、RAB、ARF
和 RAN)的一员, 它们在生物体内起众多的生理作
用, 例如参与基因表达、细胞骨架重组装、微管
的形成以及囊泡和核孔运输机制等(王昕和种康
2005; Yang 2002)。
ARF蛋白可以激活霍乱毒素的ADP-核糖基转
移酶活性(Vernoud等 2003), 并由此得名。动物中
的研究表明, ARF蛋白在真核生物细胞的膜转运和
信号转导中起作用(D’Souza-Schorey和 Chavrier
2006), 可参与形成胞质溶性外被蛋白并将其运送到
囊泡出芽位点, 运输囊泡的 3种外被蛋白: COPI、
COPII和笼形蛋白的形成都与ARF家族密切相关
(Kirchhausen 2000)。拟南芥中的研究表明, ARF1
在内质网和高尔基体之间的小泡运输中起作用, 并
对维持高尔基体的正常形态结构起作用。
现在, 人们已从多种动物、微生物中分离出
arf基因, 从高等植物如水稻、马铃薯、拟南芥等
中也克隆到一些 arf基因。酵母中 arf (Stearns等
1990; Lee等 1994)的研究表明, arf1的破坏可导致
其生长缓慢和冷敏感, 而同时破坏arf1与arf2的突
变体则是致死的, 说明ARF在生物体中起作用。
麻疯树是大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属
(Jatropha)植物, 耐干旱和贫瘠的能力极强; 麻疯树
胚乳中含有大量的油脂, 近年来主要用于生物柴油
的研究和开发, 是一种极具开发潜力的多用途经济
作物(林娟等2004)。我们从已构建的麻疯树cDNA
文库中筛选出一个 arf基因, 对其进行了生物信息
学初步分析; 为了揭示 arf基因在麻疯树中的生理
作用, 本文用半定量RT-PCR的方法对不同组织中
Jc-arf基因的表达进行了初步分析, 同时也对不同
胁迫条件下该基因的表达进行了研究。
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材料与方法
以麻疯树(Jatropha curcas L.)根、茎、叶、
花、种子胚乳为材料。其中, 种子、花取自四川
西昌地区; 根、茎、叶取自本校实验室温室培养
的长出 4片真叶的麻疯树幼苗。用 4片真叶的麻
疯树幼苗进行胁迫处理, 30% PEG6000、500
mmol·L-1 NaCl每日浇灌至花钵底孔刚有液体渗出;
低温胁迫条件为: 白天12 h, 25 ℃, 光照强度为324
μmol·m-2·s-1; 夜晚 12 h, 2 ℃, 黑暗条件。分别处理
1、2、3 d 取根、茎、叶等组织材料液氮中保
存 。
按照文库说明书的步骤环化麻疯树胚乳cDNA
文库, 随机挑选单克隆, 利用 pBlueScript SK-质粒
插入片段两侧已知的引物: T7引物(5 GTAATAC-
GACTCCTATAGGGC 3)、SK引物(5 GATCC-
ACTAGTTCTAGAGCG 3)进行PCR扩增, 得到的扩
增结果经酶切检验确认无误后测序。利用软件
DNAMAN对获得的测序结果进行比对, 检测有无相
同的序列, 将检测结果在GenBank数据库中利用
Blastn、Blastx与其它生物的同源序列进行比对, 得
到一条与多种生物ARF序列相似的 EST序列。
得到的 Jc-arf基因用BLAST工具(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov)进行同源性搜索; 应用DNAMAN
软件进行同源核苷酸和氨基酸序列的多重比对; 用
DNAstar由核苷酸序列推断其氨基酸序列, 计算预
测蛋白的分子量、等电点的理论值, 分析氨基酸组
成等。
Jc-arf基因编码的推测蛋白产物用TMHMM、
TMpred预测其跨膜结构; 应用SignalP分析氨基酸
序列中是否存在信号肽; 采用PROSCAN寻找蛋白
修饰位点; 用 SOPMA预测二级结构; 用 SWISS-
MODEL预测三级结构。用Philip构建系统进化树。
以麻疯树 18S RNA为内部参照物, 用半定量
RT-PCR的方法对麻疯树中 Jc-arf基因的表达进行
检测。分别提取各试验材料的总 RNA, 用不含
RNase的DNaseI去除RNA中的基因组DNA, 再用
分光光度计测定其浓度, 并用DEPC水稀释至相同
浓度。分别以等量各组织的总 RNA为模板, 以
Oligo d(T)为引物进行反转录(按TaKaRa公司AMV
反转录酶操作说明书进行)。以等体积的反转录产
物为模板, 以 18S RNA的一对引物 18S-P1: 5
CAACCATAAACGATGCCGACC 3/18S-P2: 5
CAGCCTTGCGACCATACTCCC 3及Jc-arf的引物
RT-P1: 5 TGGTCAGGACAAGATTCG 3/RT-P2: 5
CTCAGCAGCATTCATAGC 3采用以下程序进行
PCR扩增: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃
30 s (循环); 72 ℃ 10 min, 其中 18S RNA扩增循环
为 26个, Jc-arf的扩增循环数为 30个。PCR结束
后, 分别取 3 μL产物 1%琼脂糖电泳检测, UV (美
国UVP公司)透射仪检测产物浓度。
结果与讨论
1 Jc-arf的 cDNA序列及蛋白质特征分析
序列分析表明, Jc-arf 的 cDNA序列长887 bp,
含有一个由 546 bp碱基组成的完整开放阅读框, 3
非翻译区长 280 bp, 5非翻译区长 61 bp (GenBank
登录号EU940696)。Jc-arf基因编码的推测蛋白产
物由 1 81 个氨基酸组成, 采用软件 DN AS ta r、
Protparam tool对其进行分析, 该预测蛋白含有 22
个碱性氨基酸(K+R)、23个酸性氨基酸(D+E), 等
电点( P I )为 6 . 7 6 5 , 为中性蛋白, 元素组成为
C928H1466N254O270S6, 不稳定系数为 32.18, 说明此蛋
白可以稳定的存在, 预测其蛋白分子量为20 652 Da,
这与其他生物的ARF蛋白的分子量是相近的。该
预测蛋白不含有信号肽, 无跨膜区。
Jc-ARF蛋白的修饰位点预测分析, 发现其含有
1个 N-糖基化位点(60NISF)、2个蛋白激酶 C磷
酸化位点(140TDK、147SLR)、2个酪蛋白激酶
II磷酸化位点(64TVWD、161 TSGE)、3个 N-豆
蔻酰化位点 ( 2 G L S F T K、2 4 G L D A A G、
165GLYEGL)、1个微体C端靶信号位点(179NKA)
和 1个ARF家族信号(151 RHWYIQSTCATSGEG
LYEGLDWL)。这与香蕉ARF蛋白的修饰位点类
型和数量是一致的, 同时也反映了ARF在植物进化
上的保守性, 而这些活性位点的基本功能都与膜质
运输和维持细胞器的完整性有密切关系。Jc-ARF
蛋白的二级结构预测表明, 其含有 38.12% α螺旋、
7.73% β折叠和 33.15%无规则卷曲。根据已知的
人类ARF1蛋白三维结构, 预测Jc-ARF蛋白的三级
结构(Arnold等 2006; Schwede等 2003; Guex和
Peitsch 1997) (图 1), 二者空间结构高度相似, 具有
ARF蛋白的突出特征: N末端都具有一个α螺旋, 并
且具有 2个相同的效应结构域 Switch1和 Switch2,
他们之间由 2 个折叠相连接( i n t e r s w i t c h ) ,
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Interswitch区的存在使ARF蛋白能够进行空间构
象的转换, 实现与GDP/GTP的结合, 从而完成非
活性、活性形式的相互转换, 这种构象的转换对
ARF蛋白功能的发挥可能有作用(Pasqualato等
2001)。
2 Jc-ARF蛋白的同源性分析及系统进化树的建立
选取胡萝卜等9种植物的ARF序列, 它们与Jc-
ARF同源性的结果(图 2)表明: 植物间的ARF序列
有很高的同源性, Jc-ARF与胡萝卜ARF002的同源
性高达 99.45%, 与拟南芥ARF3的同源性最低为
图 1 Jc-ARF蛋白的三维结构图(Arnold等 2006; Schwede
等 2003; Guex和 Peitsch 1997)
Fig.1 Three-dimensional structure of Jc-ARF protein
图 2 麻疯树ARF蛋白与其他植物ARF蛋白氨基酸序列比对
Fig.2 Alignment of the deduced amino acid sequence from Jc-ARF cDNA with the other ARF sequences
麻疯树 JcARF (登录号ACL67836); 胡萝卜DcARF002 (登录号ABB03801); 紫花苜蓿MsARF (登录号AAR29293); 豇豆VuARF
(登录号AAB91395); 陆地棉 GhARF (登录号 CAD12855); 毛白杨 PtARF (登录号AAR18698); 拟南芥 AtARF1 (登录号 AAA32729);
拟南芥 AtARF3 (登录号 CAA54564); 杨柳 SbARF (登录号 BAA24696); 水稻OsARF (登录号 AAT77289)。
60.99%, 与毛白杨的同源性为 77.95%, 其余都在
98%以上, 显示了其在植物进化上的保守性。它
们都存在 3个保守框 P框(GLDAAGKT)、G’框
(DVGGQ)和G框(NKQDL), 这三个框是GTP结合
蛋白家族中涉及GTP结合和水解所必需的。另外,
作为膜定位和ARF活性所需的2-甘氨酸豆蔻酰化
位点也很保守。
根据基因大小、氨基酸序列、系统发生以及
基因结构的异同, 人类基因组中的 6个 arf基因分
成3类(D’Souza-Schorey和Chavrier 2006), 即ClassI
(arf1~3)、ClassII (arf4~5)和 ClassIII (arf6) 。选
取了油棕、人、土豆、苜蓿等共 28种生物的ARF,
利用Philip软件构建了ARF蛋白的系统进化树, 发
现 Jc-ARF蛋白与胡萝卜ARF002的亲缘关系最近,
其次为陆地棉及拟南芥ARF2。与人类ARF聚类
时, 其与人类ARF1、ARF3等 ClassI类ARF的亲
缘关系更近, 而与人类 ARF4~6都较远, 根据 Jc-
ARF的氨基酸数目、序列, 我们认为, 本文所克隆
的 Jc-arf相似于人类 ClassI类 arf基因。
3 Jc-arf的组织特异性表达
为研究 Jc-arf在麻疯树中的作用, 我们对 Jc-
arf在麻疯树各组织器官中的表达情况进行了半定
量 RT-PCR分析。如图 4所示, Jc-arf在种子胚乳、
根、茎、叶、花中均有表达, 但表达有明显的组
织特异性: 在花中的表达量最高, 在胚乳、根、
茎、叶中表达差异不大。
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目前的研究表明, 虽然 arf在各物种中普遍存
在, 但组织特异性有较为明显的差异, 这可能是因
图 3 ARF蛋白的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of ARF proteins
图 4 Jc-arf 的组织特异性表达
Fig.4 Expression of Jc-arf in different organizes
为arf有很多种类, 而各类型的arf分别会在不同的
组织器官中起作用之故。Jc-arf在花中相对表达
量最高, 可能为花特异性表达。这与任茂智等
(2004)报道的棉花中 arf在花、蕾等组织中呈显著
优势表达的结果是一致的, 在花的发育过程中不仅
有物质的极性运输, 而且有细胞膜的形成、细胞壁
的扩展等过程, 这些过程均需要高尔基体以物质分
泌的形式参与, Jc-ARF可能在此过程中起作用
(Pimpl等 2003; Takeuchi等2002), 因此具有较高的
表达水平。同时, 我们的结果也显示 Jc-arf在根中
同样有所表达, 暗示其可能在根中也起某种作用,
Zhuang等(2005, 2006)对水稻ARF的研究就发现其
与根的发育过程有关。Jc-ARF蛋白是否也在麻疯
树的根发育中起作用仍需进一步的研究。
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4 不同胁迫诱导条件下 Jc-arf的表达
用半定量 RT-PCR的方法, 分析NaCl、PEG、
低温胁迫下, Jc-arf在根、茎、叶中表达量变化
的结果(图 5)表明: 在 PEG胁迫下, arf在根、茎、
叶中表达量均有明显上升, 并且随处理时间的延长,
arf在茎中的表达量最多增加3.2倍; 在低温胁迫下,
茎、叶中arf基因表达量无明显的变化; 在根中, 从
第 2天开始, arf表达量增加 1.5倍, 并在第 3天维
持高水平表达。NaCl胁迫条件下, arf在根中的表
达量随时间的推移反而下降, 在第 3天时, 只有正
常情况下的 64.7%; 在茎、叶中, arf的表达量在
第 1天有所增加, 而后逐渐降低至正常水平。
图 5 不同胁迫条件下 Jc-arf 的表达模式
Fig.5 Expression patterns of Jc-arf under different stresses
1: 处理 1 d; 2: 处理 2 d; 3: 处理 3 d。
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