全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 331~337 331
收稿 2013-10-16　　修定 2014-01-16
资助 北京林业大学国家理科生物学基地国家自然科学基金子
项目(J1103516)、国家自然科学基金(31170631)和国家
“863”计划(2013AA102703和2011AA100201)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: anxinmin@bjfu.edu.cn; Tel: 010-62336248)。
外源突变基因AP1M2转化毛白杨的研究
陈仲1,2,*, 王静澄3,*, 安新民1,2,**
北京林业大学生物科学与技术学院1林木育种国家工程实验室; 2林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京100083; 3中华
人民共和国环境保护部环境规划院, 北京100012
摘要: 为探究毛白杨开花调控分子机制并获得不飞絮毛白杨株系, 利用农杆菌介导法将显性负突变结构基因AP1M2转入毛
白杨中, 经PCR检测, 共获得阳性转化植株7株。通过RT-qPCR检测转基因植株中外源基因AP1M2表达量, 发现各株系间的
表达水平差异显著, 最高为内参的5.41倍, 最低为1.89倍。对转基因毛白杨中内源PtAP1和其他开花关键基因的表达量进行
检测, 发现内源AP1的表达受到抑制, 表达量明显下调; 其他开花关键基因LFY、AP3、PI、SEP3和FT1等的表达量也有不
同程度的降低, 而FT2表达量并没有明显变化。这些研究结果表明转AP1M2毛白杨中AP1、LFY、AP3、PI、SEP3和FT1的
表达受到明显抑制, 对毛白杨花发育将有一定影响。
关键词: 毛白杨; AP1M2; 遗传转化; 开花
Genetic Transformation of Populus tomentosa Carr. with the Foreign Mutant
Gene AP1M2
CHEN Zhong1,2,*, WANG Jing-Cheng3,*, AN Xin-Min1,2,**
1National Engineering Laboratory for Tree Breeding, 2Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental
Plants, Ministry of Education, College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083,
China; 3Chinese Academy for Environmental Planning, Ministry of Environmental Protection of the People’s Republic of China,
Beijing 100012, China
Abstract: In order to study the mechanism of flowering in Populus tomentosa and obtain sterile poplar, the
foreign mutant gene AP1M2 was transformed into P. tomentosa via the Agrobacterium-mediated method. The
positive results verified by PCR showed that seven transgenics lines obtained. RT-qPCR results showed that the
expression levels in seven transgenic lines were different. The highest level of expression was 5.41 times and
the lowest level was 1.89 times compared to the reference gene. The expression of AP1, LFY, AP3, PI, SEP3
and FT1 in transgenic poplars was down-regulated obviously, but the FT2 expression level was not changed.
These results suggested that the AP1, LFY, AP3, PI, SEP3 and FT1 were suppressed.
Key words: Populus tomentosa; AP1M2; genetic transformation; flowering
杨树在我国城乡园林绿化、人工造林、工业
用材、纸浆造纸以及生物质燃料等多个领域发挥
着极其重要的作用。近年来, 随着毛果杨(Populus
trichocarpa Torr. & Gray)全基因组测序工作的完成
(Tuskan等2006)和Phytozome数据库(Goodstein等
2012)的不断更新, 杨树已成为多年生木本植物分
子生物学研究的模式树种。但是, 其较长的童期
也成为育种工作和其他基础研究进行的障碍; 同
时, 成年杨树飞絮散粉问题也给环境和人们的生
活带来了一定影响。所以, 深入研究控制杨树从
营养生长向生殖生长转变的关键基因显得尤为重
要。此外, 对于开花关键基因的研究, 建立开花调
控网络也有助于阐述多年生木本植物开花调控的
分子机制。近年来, 科学家们已从杨树中克隆出
多个开花关键基因, 如LFY、FT、CO和CEN等
(Rottmann等2000; Hsu等2006, 2012; Mohamed等
2010; Zhang等2010), 并对它们的生物学功能进行
了较为深入的研究。
高等植物开花过程是一个非常复杂精细的调
控网络, 它受光周期途径、春化途径、自主途径、
赤霉素途径等内在和外在因素的共同影响(Baurle
和Dean 2006)。有研究表明, 在这个开花网络中,
植物生理学报332
APETALA1 (AP1)是处于该网络中心位置最重要的
枢纽(Kaufmann等2010)。在成花过程中, AP1具有
双重功能, 它既是花分生组织特征基因, 是花序分
生组织向花分生组织转换的重要标志; 同时它又是
花器官特征基因, 属于植物花发育ABC模型中的A
类基因 , 控制萼片和花瓣等花器官的正常发育
(Mandel等1992; Parcy等1998; Wagner等1999)。
近些年来, 基因工程技术迅猛发展, 已成为林
木育种的重要手段, 但利用转基因技术通过沉默
杨树开花关键基因, 抑制杨树飞絮的工作却鲜有
报道。显性负突变(dominant negative mutation,
DNM)是一种在蛋白水平上使基因沉默的手段, 它
利用突变的蛋白与野生型蛋白竞争, 抑制或阻断
内源蛋白的作用, 同时自身不行使功能(Sheppard
1994)。本研究采用AP1M2基因是拟南芥AP1基因
的显性负突变结构, 其氨基酸序列在MADS-box
domain发生突变。将e35Spro-AP1M2结构转化毛
白杨(Populus tomentosa Carr.), 得到转基因植株并
对转基因毛白杨外源AP1M2基因、内源PtAP1以
及其他内源开花关键基因FLOWERING LOCUS
T1&2 (FT1&FT2)、LEAFY (LFY)、PISTILLATA
(PI)、APETALA3 (AP3)和SEPALLATA3 (SEP3)的表
达变化进行研究, 从而达到抑制开花的目的, 以期
培育不飞絮杨树新品种并为阐明杨树开花调控的
分子机制奠定理论基础。
材料与方法
1 实验材料
用于遗传转化的受体植物毛白杨(Populus
tomentosa Carr.)雌株无性系TC1521无菌组织培
养苗取自北京林业大学林木育种国家工程实验
室。根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)
GV3101由本实验室保存。e35Spro-AP1M2重组
质粒载体由美国俄勒冈州立大学S t e v e n H .
Strauss教授馈赠, 对照载体质粒使用pART27, 载
体T区结构如图1所示。AP1M2是拟南芥AP1基因
的显性负突变结构, 其氨基酸序列及突变区域如
图2所示。
图1 e35Spro-AP1M2重组质粒T区结构
Fig.1 Schematic illustration of the T-DNA region of the e35Spro-AP1M2 vector construct
MAR: 核基质附着区; NOS-P: 胭脂碱合成酶基因启动子; NPTII: 新霉素磷酸转移酶II基因; NOS-T: 胭脂碱合成酶基因终止子; E9term:
豌豆rbcS基因终止子; e35Spro: 增强型花椰菜花叶病毒35S启动子。
2 DNM结构e35Spro-AP1M2转化毛白杨
毛白杨的遗传转化采用农杆菌介导的叶盘转
化法。将e35Spro-AP1M2重组质粒转化农杆菌
GV3101感受态细胞并培养于含利福平(30 mg·L-1)、
庆大霉素(25 mg·L-1)和壮观霉素(100 mg·L-1)的
YEB平板上, 28 ℃恒温暗培养36~72 h, 长出单菌
落, 对其进行PCR检测和酶切验证。将验证过的摇
至OD600=0.4~0.6并准备用于浸染。将剪成1~2 cm
2
的毛白杨叶片在分化培养基 (MS+2.0 mg ·L -1
6-BA+0.1 mg·L-1 NAA)上预培养3 d, 将预培养后的
叶片浸于菌液中侵染7 min并暗培养2~4 d, 最后转
接到筛选分化培养基(MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1
mg·L-1 NAA+20 mg·L-1 Kan+250 mg·L-1 Cef)培养至
不定芽分化。将不定芽转接到生根培养基(1/2MS+
0.4 mg·L-1 IBA+20 mg·L-1 Kan+250 mg·L-1 Cef), 将
生根的抗性植株继代扩繁, 用于后续检测。
3 转基因植株的PCR检测
转基因毛白杨叶片基因组D N A提取采用
CTAB法, 阳性对照为质粒DNA, 阴性对照为未经
转化的毛白杨基因组DNA。AtAP1M2基因特异性
引物见表1。PCR反应条件为: 94 ℃预变性5 min;
94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共
进行30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。PCR产物
用1%的琼脂糖电泳。
4 转基因植株的RT-qPCR分析
采用SV Total RNA Isolation System (Promega)
试剂盒提取转基因毛白杨幼嫩叶片的总RNA, 并
用A3500 Reverse Transcription System (Promega)试
陈仲等: 外源突变基因AP1M2转化毛白杨的研究 333
表1 PCR和RT-qPCR分析设计引物
Table 1 Oligonucleotide primers for PCR and RT-qPCR analysis
用途 基因 上游引物序列(5→3) 下游引物序列(5→3)
PCR AtAP1M2 TAGGATCCATGGGAAGGGGTAGG TAGAATTCTCATGCGGCGAAGCA
NPTII ATCAGGATGATCTGGACGAAGAG ATATCACGGGTAGCCAACGCTA
RT-qPCR PtACTIN GAGGGAAGCCAAGATAGAGC CGGAATCCACGAGACTACATAC
AtAP1M2 AGCAGAACCAAGGCCACAAT TCGAGATCATTCCTCATTGCCA
PtAP1 CAAGGAGAAGGAGAAAGCAC ATGTTCCAAAGCATCCAAGG
PtLFY AGTACATTAGCCCCTCCACATCG CCTCGTATTGAGTGCCCCACAG
PtPI TCTGGTAAGAGGCTGTGGGACG GGATAGGCTGCACGCGGAAT
PtAP3 GAAGCAAAACTAGAGGATCTACAGG TCAAGGAAGGCGAAGTTCAT
PtSEP3 GAAGCTTAAAGCACGTTATGAAGCC GTTGGGCTTGTTGTCTAGCGTACT
PtFT1 CTTTGGCCACGAAACTGTGT TTATCGCCTCCTACCACCAG
PtFT2 TGTGCTATGAGAGCCCAAGG TCAAGGTCTCCTTCCACCGG
剂盒合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq
(Takara)以cDNA为模板进行RT-qPCR, 以检测转基
因毛白杨外源AP1M2基因、内源PtAP1以及其他
内源开花关键基因PtAP1-1 (Potri. 008G098500)、
PtFT1 (Potri. 008G077700)、PtFT2 (Potri. 010G-
179700)、PtLFY (Potri. 015G106900)、PtPI (Potri.
005G182200)、PtAP3 (Potri. 002G028400)和
PtSEP3 (Potri. 003G169600)的表达情况, 特异性引
物序列如表1所示。RT-qPCR在OpticonTM (MJ
researchTM)检测仪中进行, 反应条件为95 ℃预变性
10 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火20 s, 72℃延伸15 s,
进行40个循环; 每个反应重复3次。
图2 AtAP1和AtAP1M2氨基酸序列比对
Fig.2 Alignment of deduced amino acid sequences of AtAP1 and AtAP1M2
AtAP1: 拟南芥AP1氨基酸序列; AtAP1M2: 拟南芥AP1显性负突变结构氨基酸序列; 横线表示MADS-box结构域和C-terminal结构域;
灰色框表示突变位点。
植物生理学报334
实验结果
1 e35Spro-AP1M2结构转化毛白杨
经过农杆菌侵染的毛白杨叶片暗培养2~3 d,
将其转移至筛选培养基中; 5~6 d培养后叶片开始
膨大; 约12 d后叶片伤口边缘形成愈伤组织和绿色
小芽点; 20~35 d后, 在切口愈伤处分化出不定芽
(图3-A), 再过7~10 d后不定芽高度达到1~2 cm。
将生长健壮的不定芽剪下, 转接到含筛选抗生素
的生根培养基中(图3-B), 部分不定芽在生根培养
基中14~21 d可以长出不定根(图3-C), 部分不定芽
白化或者死亡。
2 转基因毛白杨的PCR检测
CTAB提取毛白杨抗性植株的基因组DNA, 并
以此为模板进行PCR检测。结果(图4)表明 , 转
e35Spro-AP1M2的抗性植株扩增条带为780 bp, 空
载体对照pART27抗性植株NPTII基因扩增条带为
223 bp, 与对照质粒PCR产物相比长度一致, 初步断
定为阳性植株。其他植株未扩增出相应条带, 为假
阳性。最终PCR检测出转e35Spro-AP1M2的阳性植
株7株, 转空载体pART27阳性植株8株。
图3 毛白杨遗传转化过程
Fig.3 Genetic transformation of P. tomentosa
A: 侵染后分化出不定芽; B: 不定芽在含抗生素的生根培养基中筛选; C: 不定芽生根情况; D: 完整转基因植株的获得。
3 转基因毛白杨的RT-qPCR检测
为检测外源基因AtAP1M2在转基因毛白杨中
的表达, 采用SYBR Green法以毛白杨ACTIN基因
为内参, 在模板量一致的情况下进行实时荧光定
量PCR分析。结果如图5所示, 外源基因AP1M2在
转基因植株中都有不同程度的表达, 但表达水平
在各株系间有所差异, 株系11的相对表达量最高,
为内参的5.41倍, 株系2的相对表达量最低, 为内参
的1.89倍。
在分析外源基因AP1M2相对表达量的同时,
对毛白杨内源PtAP1和其他内源的开花关键基因
进行了相对定量分析。结果(图6)所示, 相对于野
生型毛白杨, 转e35Spro-AP1M2毛白杨中内源PtAP1
图4 转e35Spro-AP1M2结构毛白杨PCR检测
Fig.4 PCR identification of transgenic poplar
plants with e35Spro-AP1M2
A: 转e35Spro-AP1M2毛白杨; B: 转pART27空载体毛白杨。
M: DNA marker; P: 质粒对照; N: 野生型; 阿拉伯数字: 转基因毛白
杨株系。
图5 转基因毛白杨不同株系间AP1M2相对表达量分析
Fig.5 Relative expression analyses of
transgenic poplar with AP1M2
2、5、6、8、11、14和17: 不同转基因株系。不同小写字母
表示不同株系间具有显著性差异(P<0.05)。
陈仲等: 外源突变基因AP1M2转化毛白杨的研究 335
基因的相对表达量下降明显, 其他内源的开花关
键基因LFY、AP3、PI、SEP3和FT1等基因的相对
表达量也有不同程度的降低; 相反, 在转基因毛白
杨和野生型毛白杨中, FT2基因的相对表达量并没
有明显变化。
讨　　论
本研究采用的DNM方法具有快速、稳定、
抑制范围广等优点, 已有研究表明, DNM的抑制作
用有可能影响一个基因家族(Lagna和Hemmati-
Brivanlou 1997)。造成不同转基因株系外源基因
表达量p存在差异的原因有可能是外源基因插入
位点的不同或者拷贝数的不同(Butaye等2005)。
毛白杨内源PtAP1基因不但在花器官中表达, 也在
一些营养器官中表达。虽然PtAP1基因在营养器
官中的具体作用尚不清晰, 但是抑制内源PtAP1的
表达有可能影响其营养生长, 精细的调控机制还
需进一步研究。本研究通过检测转e 3 5 S p r o -
图6 转基因毛白杨中其他开花关键基因的相对表达量分析
Fig.6 Relative expression analyses of other flowering-related genes in transgenic poplar
野生型: 野生型毛白杨; 转空载体: 转空载体pART27毛白杨; 株系6和11: 转基因株系。不同小写字母表示不同株系间具有显著性差异
(P<0.05)。
植物生理学报336
AP1M2毛白杨植株中其他开花关键基因的表达水
平变化发现, 这些开花关键基因之间的相互调控
作用明显。内源PtAP1基因表达量下调说明其确
实受到了外源AP1M2的抑制。
在模式植物拟南芥中, AP1和LFY是重要的花
分生组织特征基因 , 它们共同控制着花的发端 ,
AP1处于LFY的下游, LFY的表达早于AP1, LFY对
AP1有正向调节作用, 同时它们形成一个正反馈调
节, 又能相互促进(Mandel和Yanofsky 1995; Weigel
和Nilsson 1995)。AP1可以激活B类基因AP3和PI
的表达, 从而决定花瓣和雄蕊; 同时AP3和PI的积
累反过来也可以负调控AP1的表达(Goto和Meye-
rowitz 1994; Sundstrom等2006)。AP1的高表达可
以抑制SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)、
AGAMOUS-LIKE (AGL24)、SUPPRESSOR OF
OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1)的表
达, 从而激活SEP3, SEP3与LFY相互作用激活B类
和C类基因促进花器官发育(Immink等2009; Liu等
2009)。FT是开花途径整合子, 植物体内外的开花
信号汇集于FT, FT蛋白通过韧皮部可以从叶片转
运到茎尖与FD蛋白共同作用, 促进花分生组织特
征基因LFY和AP1的表达(Abe等2005; Corbesier等
2007)。本研究中通过实时荧光定量检测发现, 内
源PtAP1受到抑制后 , PtFT1、PtLFY、PtPI、
PtAP3和PtSEP3的表达量都有所下调, 说明这些基
因间的调控关系与拟南芥开花调控网络类似。在
杨树中过量表达LFY的同源基因PTLF可以使一些
转基因株系呈现早花表型(Rottmann等2000); 将毛
白杨PtLFY基因的反向重复序列转入烟草, 得到的
转基因植株具有不开花或晚花表型(An等2011)。
有研究表明杨树FT1同源基因可以调控杨树开花
时间, 参与开花诱导和季节性生长(Bohlenius等
2006); 杨树FT2同源基因可能调控营养生长(Hsu
等2011), 本研究中内源PtAP1的下调并没有造成
PtFT2表达量的明显变化, 而PtFT1的表达量却出
现了明显的下调。
本研究结果表明, 在毛白杨中PtAP1可能对
PtFT1、PtLFY、PtPI、PtAP3和PtSEP3起负调控
作用; 但对于PtFT2没有明显的调节作用, 原因可
能是P t F T 2在调控生殖生长方面作用不大。
PtFT1、PtLFY、PtPI、PtAP3和PtSEP3这些基因
或是开花途径整合子, 或是花分生组织特征基因,
或是B类C类基因, 均属于调控开花时间和花器官
发育的关键基因, 它们的表达量受到不同程度的
抑制, 将会对毛白杨花器官的发育造成一定程度
的影响, 因此本研究对于利用基因工程手段获得
不育毛白杨具有重要意义, 为获得毛白杨不育新
品种, 解决杨树飞絮散粉问题奠定了一定基础。
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