全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (11): 1050~10561050
收稿 2012-09-17　　修定 2012-10-16
资助 国家自然科学基金(30971709)。
* 通讯作者(E-mail: hxw1969@scau.edu.cn; Tel: 020-
85287961)。
采用酵母双杂交技术研究OsRUS1与OsRUS2.1之间的相互作用
潘家强1, 侯学文1,2,*
华南农业大学生命科学学院1植物逆境生物学研究中心, 2植物功能基因组与生物技术重点实验室, 广州510642
摘要: 为了研究OsRUS1 (ROOT UV-B SENSITIVE 1)与OsRUS2.1 (ROOT UV-B SENSITIVE 2.1)之间是否具有相互作用以
及通过何种结构域相互作用, 采用酵母双杂交技术开展了如下工作。根据对OsRUS1与OsRUS2.1的DUF647结构域分布的
分析, 分别采用分子克隆技术将OsRUS1的4个不同片段[OsRUS1 (1~1 782)、OsRUS1 (1~504)、OsRUS1 (510~1 282)和Os-
RUS1 (1 188~1 782)]克隆到诱饵载体pGBKT7上, 并将OsRUS2.1的4个不同片段[OsRUS2.1 (1~1 317)、OsRUS2.1 (1~138)、
OsRUS2.1 (139~879)和OsRUS2.1 (880~1 317)]克隆到猎物载体pGADT7上, 酶切和测序结果表明诱饵和猎物载体构建成功,
读码框正确。将所构建的4个OsRUS1诱饵载体和4个OsRUS2.1猎物载体质粒依次转化酵母AH109, 研究转化AH109菌落在
营养缺陷型培养液SD-Trp-DO或SD-Leu-DO上的生长情况, 以及对报告基因ADE、HIS、MEL1和LacZ的激活情况, 表明它
们均没有对酵母菌株AH109产生毒性和自激活活性。再将4个OsRUS1诱饵载体和4个OsRUS2.1猎物载体的16种组合分别
共转化酵母AH109, 共转化菌株能在二缺营养缺陷板SD-Trp-Leu-DO上生长良好, 但不能在四缺营养缺陷板SD-Trp-Leu-
Ade-His-DO上生长, 也不能激活MEL1和LacZ报告基因。这些结果表明OsRUS1与OsRUS2.1之间没有直接的相互作用。
关键词: OsRUS; 酵母双杂交; 相互作用; 自激活
Study of Interaction between OsRUS1 and OsRUS2.1 by Yeast Two-Hybrid
Technology
PAN Jia-Qiang1, HOU Xue-Wen1,2,*
1Research Center of Plant Stress Biology, 2Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology, College of Life Sci-
ences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: Yeast two-hybrid technology was applied to study whether OsRUS1 interacts with OsRUS2.1, and
they interact through which domain. The four different length of OsRUS1 fragments [OsRUS1 (1–1 782), Os-
RUS1 (1–504), OsRUS1 (510–1 282), OsRUS1 (1 188–1 782)] were cloned into bait vector pGBKT7, and four
different length of OsRUS2.1 fragments [OsRUS2.1 (1–1 317), OsRUS2.1 (1–138), OsRUS2.1 (139–879), Os-
RUS2.1 (880–1 317)] were cloned into prey vector pGADT7, according to the distribution of DUF647 domain
in OsRUS1 and OsRUS2.1. These constructed vectors were confirmed by enzyme digestion and sequencing.
The four OsRUS1 bait vectors and four OsRUS2.1 prey vectors were transformed into yeast strain AH109, re-
spectively. The self-activation and toxicity of the plasmids to host yeast AH109 were analyzed by the expres-
sion of ADE, HIS, MEL1 and LacZ reporter genes and by culturing in auxotroph medium SD-Trp-DO or SD-
Leu-DO. Results showed that the eight constructed vectors had no self-transcriptional activity and not toxicity
to yeast strain AH109. Then 16 combinations of four OsRUS1 bait vectors and four OsRUS2.1 prey vectors
were cotransformed into yeast strain AH109, respectively. The transformed AH109 could grow well in aux-
otroph medium SD-Trp-Leu-DO, but could not grow in auxotroph medium SD-Trp-Leu-Ade-His-DO, and both
the reporter gene MEL1 and LacZ could not be activated. All these results showed that there was no direct inter-
action between OsRUS1and OsRUS2.1.
Key words: OsRUS; yeast two-hybrid; interaction; self-activation
UV-B是太阳光线的成分之一, 在强度较高时
对植物是一个逆境因子, 但在低强度时却是一个
重要的形态建成、生长发育的调控因子(Frohn-
meyer和Staiger 2003)。目前研究已经确认植物中
至少存在两条UV-B信号传导途径, 即UVR8依赖途
径和UVR8非依赖途径(Brown和Jenkins 2008)。经
潘家强等: 采用酵母双杂交技术研究OsRUS1与OsRUS2.1之间的相互作用 1051
过近年来的工作, UVR8依赖途径的研究取得了重
要进展 , 陆续鉴定出了UVR8、COP1、HY5、
HYH、RUP、CHS等成员(钱珊珊和侯学文2011;
Heijde和Ulm 2012), 并于近期确认UVR8即是UV-B
受体(Rizzini等2011)以及描述了UVR8感受UV-B
的机制(Christie等2012; Wu等2012)。但对UVR8非
依赖途径的研究进展却不大。Tong等(2008)、
Leasure等(2009)相继报道了ROOT UV-B SENSI-
TIVE1和2, 即AtRUS1与AtRUS2, 发现它们对极低
强度的UV-B感受有关, 参与拟南芥根的早期发育,
它们与UVR8依赖途径和UVR8非依赖途径的关系
如何, 目前尚不清楚。通过生物信息学分析, 发现
拟南芥基因组中有6个RUS基因, 它们的共同特点
是均具有一个功能未知的结构域DUF647。研究
发现rus1、rus2与双突变体rus1rus2的表型相同,
推测它们可能是以一个复合体起作用。酵母双杂
交的工作表明, AtRUS1与AtRUS2之间存在互作,
并且它们之间的互作是依赖于DUF647中的保守
氨基酸(Leasure等2009)。通过对水稻基因组的分
析, 在水稻基因组中也发现6个OsRUS基因, 且均具
有DUF647的未知功能结构域。水稻中OsRUS是否
也如拟南芥AtRUS一样感受极低强度的UV-B并与
根的早期发育有关？我们正在利用转基因技术进
行研究。OsRUS1与OsRUS2.1之间是否具有如
AtRUS1与AtRUS2之间的相互作用？在本研究中,
我们根据OsRUS1和OsRUS2.1中DUF647的分布情
况, 以4个OsRUS1不同片段构建诱饵载体, 4个Os-
RUS2.1不同片段构建猎物载体, 采用酵母双杂交
技术研究二者之间是否具有相互作用, 为OsRUS功
能的解析提供线索。
材料与方法
1 实验材料
酵母(Saccharomyces cererisiae Hansen) AH109
菌株、pGBKT7质粒、pGADT7质粒、阳性对照
质粒pGBKT7-53和pGADT7-T、阴性对照质粒
pGBKT7-Lam和pGADT7-T (美国Clontech公司)、
大肠杆菌[Escherichia coli (Migula) Castellani &
Chalmers] TOP10菌株以及已克隆的OsRUS1基因
pMD18-T-S-BamHI-1-OsRUS1 cDNA-1782-MluI、
OsRUS2.1基因pMD18-T-S-BamHI-OsRUS2.1 cD-
NA-1317-MluI由本校实验室保存; 其他试剂有YNB
和蛋白胨(Difco公司), SD-Trp-DO、SD-Leu-DO、
SD-Trp-Leu-DO和SD-Trp-Leu-Ade-His-DO (美国
Clontech公司), 酵母提取物(OXOID公司), DNA限
制性内切酶和T4 DNA连接酶(TaKaRa公司), Kod-
Plus-Neo DNA聚合酶和dNTPs (TOYOBO公司),
DS2000 Marker (东盛生物公司), DNA胶回收试剂
盒(普博欣生物公司), 2×power Taq PCR Mix (百泰
克生物公司), X-β-gal (美国BBL公司), X-α-gal (美
国GOLDBIO公司), PEG3350 (广州华奇盛生物公
司), 乙酸锂(天津科密欧有限公司), N,N-二甲基甲
酰胺(北京奇华盛生物公司), 二甲基亚砜(上海凌
峰化学试剂公司)以及Z buffer/X-β-gal液(现配现
用: 100 mL Z buffer, 0.27 mL β-巯基乙醇, 1.67 mL
X-β-gal原液)。
本实验所用引物名称及序列有OsRUS1 cD-
NA-EcoRI-1-F: 5′ AGAATTCATGTCCTCCTCG-
CAATCTCTCC 3′; OsRUS1 cDNA-BamHI-504-R: 5′
AGGATCCACCGGCCTTCTCCGCATC 3′; Os-
RUS1 cDNA-EcoRI-510-F: 5′ AGAATTCGTGC-
CGAGCTGGCTGC 3′; OsRUS1 cDNA-BamHI-
1282-R: 5′ GGGATCCTCTTTGACTGAAGGAA-
CTTGTCC 3′; OsRUS1 cDNA-EcoRI-1188-F: 5′
AGAATTCCAATCGATTCAGCTGAGGACACT 3′;
OsRUS1 cDNA-BamHI-1782-R: 5′ TGGATCCT-
TATGAAGGAGCATCTCCTATGC 3′; OsRUS2.1
cDNA-EcoRI-1-F: 5′ CGAATTCATGAACATACTC-
GAGAGGATAC 3′; OsRUS2.1 cDNA-BamHI-
138-R: 5′ AGGATCCTTACAGAGACTCTGCCG-
GCGT 3′; OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-139-F: 5′
GGAATTCAAAGTTATCCAAGATTCGAGAC 3′;
OsRUS2.1 cDNA-BamHI-879-R: 5′ TGGATCCG-
GAAACCTTTCCACTCTTGAT 3′; OsRUS2.1 cD-
NA-EcoRI-880-F: 5′ GGAATTCAGCCCAGCT-
GAGCTAAGATATCG 3′; OsRUS2.1 cDNA-BamHI-
1317-R: 5′ CGGATCCTCATAAAGCACTACC-
GCTGA 3′; Matchmaker 5 AD LD-insert screening
amplimer: 5′ CTATTCGATGATGAAGATACCCCA-
CCAAACCC 3′; Matchmaker 3 AD LD-insert screening
amplimer: 5′ GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAG-
TATCTACGATT 3′; T7 sequencing primer: 5′
植物生理学报1052
TAATACGACTCACTATAGGGC 3′。
2 实验方法
2.1 OsRUS1与OsRUS2.1基因DUF647结构域分析
及载体构建
采用http://smart.embl-heidelberg.de/网站上结
构域在线分析工具分析OsRUS1与OsRUS2.1结构
域分布情况, 以Primer Premier 5.0设计引物, 利用
分子克隆技术分别成功构建4个OsRUS1不同片段
诱饵载体和4个OsRUS2.1不同片段猎物载体。
2.2 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体转化
酵母AH109感受态及对宿主菌毒性检测
按Clontech公司酵母双杂交手册进行酵母
菌株AH109感受态制备。采用PEG/LiAc法依次
进行4个OsRUS1诱饵载体和4个OsRUS2.1猎物载
体的转化, 最后将8种转化菌菌液涂布在相应营
养缺陷板上筛选, 同时将AH109感受态菌液分别
涂布SD-Trp-DO和SD-Leu-DO板, 放入30 ℃恒
温箱静置培养2~3 d观察缺陷板上菌落生长情
况。3 d后分别挑取直径2~3 mm的4种OsRUS1诱
饵载体的AH109菌落接种于3 mL的SD-Trp-DO培
养液(含20 μg·mL-1的卡那霉素), 挑取直径2~3 mm
的4种OsRUS2.1猎物载体的AH109菌落接种于3
mL的SD-Leu-DO培养液(含25 μg·mL-1的氨苄青霉
素)中 , 30 ℃、250 r·min-1振荡培养过夜 , 检测
OD600是否大于0.8, 以此判断载体表达蛋白对宿
主菌AH109是否具有毒性。
2.3 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体对酵
母AH109转录自激活活性的检测
按Clontech公司酵母双杂交手册进行, 将4
种OsRUS1诱饵载体转化菌划线于SD-Trp-Ade-
His-DO板, 将4种OsRUS2.1猎物载体转化菌划线
于SD-Leu-Ade-His-DO板, 30 ℃恒温箱中静置培
养3~5 d, 观察生长情况以检测营养缺陷报告基
因ADE和HIS是否被激活。
取过夜摇菌培养的阳性对照菌液以及上述8
种转化酵母菌单菌落菌液2 mL于离心管中, 12 000
r·min-1离心15 s后弃上清, 将离心管在液氮中速
冻10 min, 取出使其自然融解约10 min, 再重复
操作一次, 加入50 μL现配的Z buffer/X-β-gal液,
30 ℃静置存放24 h染色, 以检测报告基因LacZ
的表达情况。
将含上述4种诱饵载体和4种猎物载体的AH109
转化菌以及含阳性和阴性对照质粒的AH109单菌
落, 分别划线于涂有100 μL X-α-gal液(4 mg·mL-1)
的直径10 cm的SD-Trp-DO板和SD-Leu-DO板, 30 ℃
静置培养3 d, 以检测报告基因MEL1的表达情况。
2.4 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体共转
化酵母AH109感受态及对宿主菌毒性检测
按Clontech公司酵母双杂交手册进行, 具体
为将阳性对照质粒、阴性对照质粒以及4种诱饵
载体与4种猎物载体按照两两搭配的16种组合采
用PEG/LiAc法分别共转化AH109感受态, 然后
将这些转化菌液和AH109感受态菌液一半涂二
缺板, 一半涂四缺板, 倒置放30 ℃恒温箱培养5 d
后, 观察转化和生长情况。毒性检测方法同2.2
节 , 只是将培养液换成SD-Trp-Leu-DO (含20
μg·mL-1的卡那霉素和25 μg·mL-1的氨苄青霉素)。
2.5 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体共转
酵母AH109菌落的PCR检测
按潘家强和侯学文(2012)的方法粗提共转
酵母菌株的质粒, 分别采用OsRUS1诱饵载体与
OsRUS2.1猎物载体上的特异引物进行PCR扩增,
琼脂糖凝胶电泳检测。
2.6 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体共转
酵母AH109菌落的转录激活活性的检测
方法同2.3节, 只是分别使用了四缺培养基SD-
Trp-Leu-Ade-His-DO及二缺培养基SD-Trp-Leu-DO。
实验结果
1 OsRUS1与OsRUS2.1结构域分布及相关载体构建
经SMART在线软件分析, OsRUS1开放阅读框
(ORF)全长1 782 bp, 结构域DUF647位于523~1 269
bp, OsRUS2.1开放阅读框(ORF)全长1 317 bp, 结构
域DUF647位于150~879 bp (图1)。根据这一分析
结果, 成功构建了4个OsRUS1不同片段的诱饵载体
pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1 cDNA-1782-BamHI、
pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1 cDNA-504-BamHI、
pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1 cDNA-1280-BamHI和
pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1 cDNA-1782-BamHI,
以及4个OsRUS2.1不同片段的猎物载体pGADT7-
EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI、pGADT7-
EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-138-BamHI、pGADT7-
潘家强等: 采用酵母双杂交技术研究OsRUS1与OsRUS2.1之间的相互作用 1053
EcoRI-139-OsRUS2.1 cDNA-879-BamHI和
pGADT7-EcoRI-880-OsRUS2.1 cDNA-1317-Bam-
HI。这些载体已被转化入宿主菌Y187中, 已表明
它们没有自激活活性及对Y187毒性。
2 OsRUS1诱饵载体、OsRUS2.1猎物载体转化酵
母感受态AH109及检测
涂布在SD-Trp-DO板的4种OsRUS1诱饵载
体转化菌液和涂布SD-Leu-DO板的4种OsRUS2.1
猎物载体转化菌液在培养3 d后都长出数百个菌
落, 而涂布在SD-Trp-DO板和SD-Leu-DO板的
AH109感受态菌液均无菌落生长 , 说明转化成
功。挑取菌落在对应的培养液上培养过夜后OD600
均在1.6以上,说明转化载体对菌株AH109没有毒
性; 划线在SD-Trp-Ade-His-DO板的4种OsRUS1
诱饵载体转化菌和划线在SD-Leu-Ade-His-DO
板的4种OsRUS2.1猎物载体转化菌均无菌落生
长, 表明上述8种载体都不能激活AH109的ADE
及HIS报告基因; LacZ显色法结果表明, 上述8种
载体都不能激活AH109的LacZ报告基因(图2);
MEL1显色法结果表明 , 上述8种载体也不能激
活报告基因MEL1 (图3、4), 说明构建的OsRUS1
诱饵质粒和OsRUS2.1猎物质粒不仅对宿主菌
AH109没有毒性, 而且也没有自激活活性, 可用
于后续蛋白互作的研究。
3 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体共转化
酵母AH109感受态
为了检测OsRUS1与OsRUS2.1之间是否有互
作以及通过哪个区域互作, 将上述构建的4个Os-
RUS1诱饵载体与4个OsRUS2.1猎物载体分别两两
配对共16个组合, 转化宿主菌AH109; 转化时设置
阳性对照与阴性对照。转化时将转化菌液和
AH109感受态菌液一半涂二缺板 , 一半涂四缺
板, 倒置放30 ℃恒温箱培养5 d后, 结果AH109
感受态菌液在二缺和四缺板上都不能生长, 说明
营养缺陷培养基的筛选压力很高, 未转化成功的
AH109酵母不能生长。阳性对照菌在二缺和四
缺板上都长有100个左右菌落, 生长情况差别不
大; 阴性对照菌在二缺板上长有近100个菌落, 在
四缺板上无菌落生长。4种诱饵载体与4种猎物
载体按照两两搭配的16种组合共转化AH109培
养5 d后, 在所有二缺板上都长有100多个菌落,
说明共转化AH109酵母成功, 而在所有四缺板上
都无菌落生长, 说明不同组合的OsRUS1诱饵蛋
白与OsRUS2.1猎物蛋白之间没有互作, 因而不能
激活AH109酵母体内的营养缺陷筛选的报告基因
ADE和HIS的表达, 所以不能在四缺板上生长。
图1 结构域DUF647在OsRUS1和OsRUS2.1中的分布图
Fig.1 The schematic map of DUF647 domain
in OsRUS1 and OsRUS2.1
图2 4种OsRUS1重组诱饵载体和4种OsRUS2.1重组猎物载体对AH109的自激活活性检测
Fig.2 The self-activation detection of four OsRUS1 bait vectors and four OsRUS2.1 prey vectors to AH109
用LacZ法检测。1: 阳性对照; 2: 含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1 cDNA-504-BamHI的AH109; 3: 含pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1 cDNA-
1280-BamHI的AH109; 4: 含pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1 cDNA-1782-BamHI的AH109; 5: 含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1 cDNA-1782-BamHI
的AH109; 6: 含pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-138-BamHI的AH109; 7: 含pGADT7-EcoRI-139-OsRUS2.1 cDNA-879-BamHI的AH109; 8:
含pGADT7-EcoRI-880-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI的AH109; 9: 含pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI的AH109。
植物生理学报1054
4 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体共转化
酵母AH109的PCR验证
根据野生型AH109及共转化OsRUS1诱饵载
体与OsRUS2.1猎物载体的酵母AH109在二缺板
上的生长表现情况来看, 对应的OsRUS1诱饵载
体与OsRUS2.1猎物载体已共转入AH109。为了
进一步确认这一结果, 我们挑选在二缺板上生长
的克隆, 粗提质粒后, 分别采用构建OsRUS1诱饵
载体与OsRUS2.1猎物载体上的特异引物进行
PCR扩增, 实验结果表明, 挑选的克隆均同时含
有对应的OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体扩
增条带(图5), 再次证明共转化成功。
5 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体共转化
对酵母AH109的毒性检测
分别挑取上述经验证的含OsRUS1诱饵载体
与OsRUS2.1猎物载体的AH109菌落, 在3 mL的
SD-Trp-Leu-DO (添加卡那霉素与氨苄青霉素)
的液体培养基中过夜培养 , OD 600均达到了1.6,
图3 SD-Trp-DO-X-α-gal板上4种OsRUS1诱饵载体对
AH109酵母的自激活活性检测
Fig.3 The self-activation detection of four OsRUS1 bait
vectors to AH109 on SD-Trp-DO-X-α-gal plate
用MEL1法检测。1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 含pGBKT7-
EcoRI-1-OsRUS1 cDNA-504-BamHI的AH109; 4: 含pGBKT7-
EcoRI-510-OsRUS1 cDNA-1280-BamHI的AH109; 5: 含pGBKT7-
EcoRI-1188-OsRUS1 cDNA-1782-BamHI的AH109; 6: 含pGBKT7-
EcoRI-1-OsRUS1 cDNA-1782-BamHI的AH109。
图4 SD-Leu-DO-X-α-gal板上4种OsRUS2.1猎物载体对
AH109酵母的自激活活性检测
Fig.4 The self-activation detection of four OsRUS2.1 prey
vectors to AH109 on SD-Leu-DO-X-α-gal plate
用MEL1法检测。1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 含pGADT7-
EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-138-BamHI的AH109; 4: 含pGADT7-
EcoRI-139-OsRUS2.1 cDNA-879-BamHI的AH109; 5: 含pGADT7-
EcoRI-880-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI的AH109; 6: 含pGADT7-
EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI的AH109。
图5 16种共转化OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体的酵母AH109菌落的PCR验证
Fig.5 The PCR verification of 16 yeast AH109 strains cotransformed by OsRUS1 bait vectors and OsRUS2.1 prey vectors
上部分是对OsRUS1诱饵载体片段扩增, 下部分是对OsRUS2.1猎物载体片段扩增。9: Marker DS2000; 1、2、3、4: 转化的诱饵载体
为pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1 cDNA-504-BamHI; 5、6、7、8: 转化的诱饵载体为pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1 cDNA-1280-BamHI; 10、
11、12、13: 转化的诱饵载体为pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1 cDNA-1782-BamHI; 14、15、16、17: 转化的诱饵载体为pGBKT7-EcoRI-1-
OsRUS1 cDNA-1782-BamHI; 1、5、10、14: 转化的猎物载体为pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-138-BamHI; 2、6、11、15: 转化的猎
物载体为pGADT7-EcoRI-139-OsRUS2.1 cDNA-879-BamHI; 3、7、12、16: 转化的猎物载体为pGADT7-EcoRI-880-OsRUS2 cDNA-1317-
BamHI; 4、8、13、17: 转化的猎物载体为pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI。
潘家强等: 采用酵母双杂交技术研究OsRUS1与OsRUS2.1之间的相互作用 1055
说明在AH109中共表达Gal DNA-BD-OsRUS1蛋
白不同片段融合蛋白及Gal DNA-AD-OsRUS2.1
蛋白不同片段融合蛋白对宿主菌的生长没有毒性,
可以进行下一步的实验。
6 OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎物载体共转化
对报告基因LacZ及MEL1的激活活性检测
综合共转化OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1猎
物载体的AH109菌落在二缺板及四缺板上的生
长情况, 说明它们之间可能没有互作, 不能激活
营养缺陷筛选的报告基因ADE及HIS的表达。随
后检测了对报告基因LacZ及MEL1的激活情况, 实
验结果表明, 除了阳性对照能激活报告基因LacZ
及MEL1的表达外, OsRUS1诱饵载体与OsRUS2.1
猎物载体的16种组合均不能激活报告基因LacZ
(图6)及MEL1 (图7)的表达, 说明OsRUS1与Os-
RUS2.1之间可能不存在直接的相互作用。
图7 16种OsRUS1诱饵载体和OsRUS2.1猎物载体组合共转
化对AH109的MEL1报告基因激活活性检测
Fig.7 The activation detection of 16 combinations of OsRUS1
bait vectors and OsRUS2.1 prey vectors
to AH109 MEL1 reporter gene
用MEL1法检测。0: 阳性互作对照; 9: 阴性互作对照; 其余编
号同图5中共转化诱饵载体与猎物载体的AH109菌株。
图6 16种OsRUS1诱饵载体和OsRUS2.1猎物载体组合共转化对AH109的LacZ报告基因激活活性检测
Fig.6 The activation detection of 16 combinations of OsRUS1 bait vectors and OsRUS2.1 prey vectors to AH109 LacZ reporter gene
用LacZ法检测。0为阳性互作对照, 其余编号同图5中共转化诱饵载体与猎物载体的AH109菌株。
讨　　论
细胞代谢、信号传导等生命过程涉及到蛋白
间的相互作用, 因此解析蛋白间的相互作用对了
解生命活动的机制意义重大(Immink和Angenent
2002)。在众多的研究蛋白间相互作用的技术中,
酵母双杂交系统具有高通量、技术难度不大、无
需制备特异抗体、以及准确率相对较高等优势。
自Fields和Song (1989)提出此项技术以来, 在筛选
与已知蛋白的候选互作蛋白或验证蛋白间的相互
作用等方面获得了大量应用(李志等2009; 孙丽静
等2012; Lee等2012; Wang等2012), 为蛋白功能的
解析提供了有用的信息。在前言中已经述及利用
酵母双杂交技术表明AtRUS1与AtRUS2之间存在
互作, 并且它们之间的互作是依赖于DUF647中的
保守氨基酸(Leasure等2009)。但在本研究中却未
发现OsRUS1与OsRUS2.1之间存在互作(图6、
7)。这一结果是否预示OsRUS与AtRUS在功能上
植物生理学报1056
具有不同？序列分析表明, AtRUS1与OsRUS1之间
的相似性约为56.7%, AtRUS2与OsRUS2.1之间的
相似性约为67.2%, 这表明OsRUS与AtRUS之间的
相似性不算太高, 这或许暗示它们之间功能不同
也是可能的。或者是由于酵母双杂交的技术缺陷
而未能真实揭示二者之间的互作？虽然酵母双杂
交功能强大、应用广泛, 但它也存在固有的技术
缺陷, 如它不能检测所有的蛋白与蛋白之间的相
互作用, 另外酵母毕竟是低等真核生物, 在其体内
表达的外源蛋白的翻译后修饰折叠加工成熟过程
与水稻细胞内的真实加工过程还是存在差异, 这
些都可能掩盖蛋白间真实的相互作用而获得假阴
性结果(Fields 2005; 马晶等2011)。为了克服这一
技术缺陷, 采用不同原理的研究蛋白互作的技术
(双分子荧光互补技术BiFC或免疫共沉淀等)开展
工作, 将会揭示蛋白间真实的互作情况, 这些也是
我们下一步的研究计划 , 以确认OsRUS1与Os-
RUS2.1之间是否存在互作。
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