全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1895~1900 doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0347 1895
收稿 2015-06-29 修定 2015-10-27
资助 农业部现代农业技术体系苹果专项资金(MATS)。
* 通讯作者(Tel: 029-87099217; E-mail: renxl@nwsuaf.edu.cn)。
苹果转录因子MdHB1自激活作用及其互作蛋白分析
刘艳利1, 姜永华1, 王豪杰1, 戚英伟2, 刘翠华1, 任小林1,*
1西北农林科技大学园艺学院, 陕西杨凌712100; 2宁夏大学农学院, 银川750021
摘要: 筛选苹果转录因子MdHB1的互作蛋白, 可以为研究苹果生长发育过程中各种信号分子网络提供线索和依据。本文
以苹果品种‘皇家嘎啦’为试材, 应用SMART技术构建酵母双杂交cDNA文库。分析MdHB1的转录活性区域并验证其对
Y2HGold的细胞毒性作用, 利用诱饵载体pGBKT7-MdHB1-N进行文库筛选, 获得了24个阳性克隆, 测序分析后得到9个无
重复的MdHB1互作蛋白, 其涉及光合作用、病虫害防御、逆境胁迫等过程。
关键词: 互作蛋白; 酵母双杂交文库; SMART技术; MdHB1
Self Activation and Interaction Protein Analysis of MdHB1 Transcription Fac-
tor in Apple
LIU Yan-Li1, JIANG Yong-Hua1, WANG Hao-Jie1, QI Ying-Wei2, LIU Cui-Hua1, REN Xiao-Lin1,*
1College of Horticulture, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi 712100, China; 2Agricultural College, Ningxia Universi
ty, Yinchuan 750021, China
Abstract: The screening of protein interactions with our target protein MdHB1 in apples provides clues and ev-
idences to the study of molecular network in growth and development. This experiment used ‘Royal Gala’ as
the testing material and SMART technology was used to construct the yeast two-hybrid cDNA library. We ana-
lyzed that MdHB1 protein had obvious self-activation activity, while the N-terminus of MdHB1 (excluding
with transcription activity of CS2 structure domain) had no self-activation activity and toxicity. The quality of
the library was tested and used for subsequent screening. Finally, we screened 9 positive dots using pGB-
KT7-MdHB1-N. Function annotation showed that these candidate interacting proteins were related to photo-
synthesis, defense reaction and resistance.
Key words: protein interactions; yeast two-hybrid library; SMART technology; MdHB1
苹果(Malus pumila Mill)是世界上主栽水果之
一, 生长发育过程中的胁迫和防御反应以及光合
作用决定着苹果的产量和品质。逆境胁迫, 如干
旱、极端温度、损伤等非生物胁迫和病虫害等生
物胁迫, 严重影响植物的生长发育及产量(张晶红
和那杰2014)。植物能够通过内源激素水平影响环
境应答反应途径, 从而形成复杂的信号转导网络
(杨剑飞等2014)。与胁迫反应相关的转录因子有
MYB类、WRKY类等 , 但是HD-Zip (home-
odomain-leucine-zipper)家族是植物界所特有的一
类转录因子, HD结构下游有一个与其紧密相连的
亮氨酸拉链结构(结构名称为 HALZ, 一般用 Zip表
示), Zip 部分作为二聚化功能基元。HD 结构包括
一个蛋白结构域和一个由 60 个氨基酸构成的保守
域, 是所有真核生物共有的转录因子结构。在拟
南芥中发现17个HD-Zip I亚家族成员, 其蛋白主要
参与植物对非生物和生物环境因子的逆境应答、
激素应答、光信号的应答以及器官发育等过程的
调控(亢键等2014)。
HD-Zip I中的基因表达规律复杂, 功能具有多
样性, 甚至有一些基因在功能上有重叠(Henriksson
等2009)。MdHB1基因属于HD-Zip I家族, 在苹果
富士的幼果和花中含量都较高。HD-Zip I家族成
员还参与苹果果实成熟过程, 在苹果品种‘富士’中
MdHB5基因的表达与乙烯释放量同步(亢键等
2014)。李兴亮(2014)从细胞信号转导的角度, 对
果实发育过程中乙烯信号起源的机制进行了探究,
推测MdSnRK2.4可以通过对MdHB1转录因子功能
域磷酸化修饰以调控MdHB1蛋白活性。前人研究
表明MdHB1可能参与苹果果实发育以及成熟衰老
植物生理学报1896
进程, 并响应多种激素信号。蛋白质组学研究方
法为研究果实发育以及调控分子网络提供了一个
新的视野(王清等2009)。本实验的前期研究发现
在果实不同发育阶段中MdHB1在幼果中的表达量
最高, 暗示MdHB1可能参与了苹果幼嫩果实和花
器官中其他相关基因表达的调控, 但具体机制尚
不清楚(朱敏等2014)。基于实验室前期已经克隆
到的苹果转录因子MdHB1的基因全长(于巧平等
2012), 本研究以苹果幼果果肉为材料, 用Clontech
公司的SMART技术构建cDNA文库。筛选与
MdHB1转录因子的互作蛋白, 通过对互作蛋白进
行生物信息学分析, 推测其在苹果生长发育过程
中可能具有的生物学功能, 为阐述苹果生长发育
过程中各种信号分子网络提供线索和依据。
材料与方法
1 试验材料
试验材料为花后70 d的‘皇家嘎拉’ (Malus domes
tica Borkh. cv ‘Royal Gala’), 采自西北农林科技大学
园艺场, 苹果采收后立即运回西北农林科技大学园
艺学院采后实验室, 并且分别取果肉和果皮冻于液
氮中, 标记后在–70 ℃下保存, 备RNA提取用。
文库构建试剂盒为Make Your Own “Mate &
Plate” Library System (Cat. No. 630490), PCR扩增
试剂盒采用Advantage 2 Polymer-ase Mix (Cat. No.
639201)和Matchmaker Insert Check PCR Mix2 (Cat.
No. 630497), Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Cat.
No. 630467)、Yeastmaker™ Yeast Transformation
System 2 (Cat. No. 630439)、Matchmaker™ Gold
Yeast Two-Hybrid System (Cat. No. 630489)酵母培
养基均购自Clontech公司。
2 方法
2.1 文库构建
采用张今今等(2003)的SDS-酚法提取苹果总
RNA。根据Make Your Own “Mate & Plate” Library
System (Cat. No. 630490)说明书将纯化后的RNA
反转录合成cDNA第一链, 再经LD-PCR扩增生成
cDNA第二链, 利用CHROMA SPIN TE-400 column
纯化cDNA, 去除小于400 bp的小片段后转入酵母
感受态细胞Y187, 制备酵母双杂cDNA文库。
2.2 MdHB1的转录激活区域分析及毒性检测
根据苹果MdHB1的cDNA全长序列 , 利用
Primer5.0软件设计MdHB1的N端和全长的基因特
异性引物(表1)并引入酶切位点后分别扩增MdHB1
的N端(不含CS2结构域)和全长(含CS2结构域)。
扩增产物经克隆、测序后, 分别与载体pGBKT7相
连, 获得pGBKT7-MdHB1-N和pGBKT7-MdHB1载
体。并根据酵母转化手册(Clontech, Cat. No.
630439)分别转化酵母Y2HGold 菌株, 涂布于SD/-
Trp、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固
体平板上30 ℃倒置培养3 d, 检测MdHB1的N端和
全长是否具有自激活和毒性作用。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物名称 序列(5→3) 限制性内切酶
MdHB S CGGAATTCATGATGGAGCCGGGCCG EcoRI
MdHB A CGGGATCCTTATGACCATCCCCACCAGTTCA BamHI
MdHB-N A CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGATGAGTGT BamHI
3 文库筛选及其互作蛋白生物信息学分析
将无自激活作用的诱饵质粒 p G B K T 7 -
MdHB1-N转化入感受态酵母Y2HGold中, 参照
Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System (Cat.
No. 630489)说明书 , 与1 mL文库菌液杂交(40
r·min-1, 30 ℃), 20 h之后取一滴杂交菌液, 显微镜
下观察杂交成功后, 将杂交酵母菌液涂布于60块
直径15 cm的SD/-Leu-Trp/X-α-Gal/Aba琼脂平板上,
于30 ℃孵箱中倒置培养3~5 d后, 挑取蓝斑菌落划
线培养QDO/X/(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal),
重复划线培养直至筛选获得蓝色单克隆。
根据酵母质粒提取试剂盒(Cat. No. 630467)说
明书提取阳性克隆质粒后转化大肠杆菌 DH5α, 提
交北京奥科生物公司测序。将测序结果在NCBI
刘艳利等: 苹果转录因子MdHB1自激活作用及其互作蛋白分析 1897
数据库进行 BLAST比对以便检索其生物功能。
实验结果
1 全长cDNA文库构建及评价
用SDS-酚法提取的总RNA分离纯化后(图
1-A), 18S rRNA和28S rRNA两条带清晰, 说明总
RNA质量好, 完整性好。RNA反转录后的cDNA呈
弥散状分布(图1-B), CHROMA SPIN TE-400柱子
过滤之前介于0.1~4.0 kb, CHROMA SPIN TE-400
柱子过滤之后短片段明显减少, 弥散介于0.3~4.0
kb之间, 集中分布在0.5~2.0 kb, Nanodrop分光光度
计检测浓缩后的cDNA浓度为0.60 g·L-1, 满足构建
cDNA文库的要求。
根据文库稀释液在固体培养基SD/-Leu所长
克隆数(图2-A和B), 按照Clontech说明书计算得文
库滴度为2.9×107 pfu·mL-1。随机挑取20个单克隆
进行PCR 扩增插入片段, 结果表明, 有插入片段的
单克隆是18个, 文库转化率率为90%, 其中插入片
段1.0 kb左右的片段3个, 最小的片段是250 bp, 片
段长度集中分布在500 bp左右(图2-C)。
2 MdHB1的转录激活区域分析以及毒性检测
分别构建pGBKT7-MdHB1-N (不含CS2结构
域)和pGBKT7-MdHB1诱饵表达载体。转化酵母
菌Y2HGold获得了含有pGBKT7-MdHB1-N、
pGBKT7-MdHB1的酵母。涂布于SD/-Trp、
SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体平板
上。结果发现, pGBKT7-MdHB1-N在SD/-Trp和
SD/-Trp/X-α-gal平板上都能长出菌落, 且菌落颜色
为白色(图3-C)。pGBKT7-MdHB1在固体培养基
SD/-Trp/X-α-Gal/AbA长出蓝斑, 表明MDHB1全长
约1 000 bp (含CS2结构域)有明显的自激活活性,
而约800 bp的MdHB1-N (不含CS2结构域)无自激
活活性(图3-C)。此外转化酵母(pGBKT7-MdHB1)
菌斑大小与转化酵母(pGBKT7)菌斑大小相当, 表
明融合蛋白对酵母Y2HGold 生长没有毒害(图3-A
和B)。
3 筛选文库验证
用诱饵MdHB1转录因子筛选本试验所构建的
cDNA文库, 经过共转化, 初步筛选得到24个阳性
单克隆, 这些阳性克隆在缺陷性培养基QDO/X/
(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)筛选情况如图4
所示。证明本文所构建的苹果cDNA文库是合格
的, 能够用来筛选苹果成熟期基因的互作蛋白。
4 互作蛋白生物信息学分析
将这24个阳性克隆扩繁提取质粒后, 转化大
肠杆菌DH5α, 进行测序并将序列在NCBI中进行
BLAST分析。序列比对分析结果(表2)筛选出了9
个无重复的互作蛋白, 它们参与胁迫响应、能量
代谢、抗逆和防御、光合作用等过程, 还有一个
未知蛋白。
图1 RNA (A)与LD-PCR cDNA (B)电泳检测
Fig.1 Electrophoresis detection of total RNA (A) and LD-PCR cDNA (B)
A中M: DL2000 DNA marker; B中M: DL15000 DNA marker; 1: 纯化后RNA; 2: 纯化前的dscDNA; 3: TE-400 column 纯化的dscDNA。
植物生理学报1898
图2 文库质量及插入片段鉴定
Fig.2 cDNA library quality and insert segments identification
A: 溶液A所长克隆数(稀释因子=10-2); B: 溶液B所长克隆数(稀释因子=10-4); C: 文库菌插入片段检测; M: DL2000 DNA marker; 1~20:
菌落编号。
图3 MdHB和MdHB-N的转录活性以及毒性检测
Fig.3 The transcription activity and toxity detection of MdHB and MdHB-N
A、B: pGBKT7-MdHB1的毒性检测; C: pGBKT7-MdHB1的自激活检测。
讨 论
本研究以全长MdHB1为诱饵筛选文库。作为
诱饵蛋白, 转录因子C末端的酸性氨基酸可能使其
存在自激活特性。Miyake等(2002)发现ABF1转录
因子C末端含有具有转录激活功能的CS1和CS2结
构, 其中含有30个氨基酸的CS2结构可独立激活下
游基因的转录和染色体复制。本实验中MdHB1全
长发生了自激活, 将CS2结构与MdHB1蛋白进行
氨基酸序列比对, 并没有查询到相似度很高的序
列。因此实验过程中, 将MdHB1转录因子C端可能
刘艳利等: 苹果转录因子MdHB1自激活作用及其互作蛋白分析 1899
存在的激活域CS2结构去除, 得到MdHB1-N (不含
CS2)序列。试验验证MdHB1转录因子自激活结构
域为C端的CS2结构。而MdHB1-N没有自激活作
用, 完全可以用于进一步的文库筛选。通过文库
筛选, 利用生物信息方法, 对筛选获得的候选互作
蛋白进行分析表明这些蛋白主要参与光合作用、
胁迫响应、能量代谢以及其他途径, 还有一个是
未知蛋白。实验室前期研究发现MdHB1启动子区
含有光响应元件(GATAGGA), 试验筛选获得的
LOC103440038为RNA聚合酶因子, 可以调节光合
体系的化学计量, 保持电子流和光合效率和谐稳定
(Hakimi等2000; Privat等2003)。Green和Durnford
(1996)发现LOC103437829参与光合作用。因此推
测MdHB1可能与这些蛋白共同参与光合作用。
此外MdHB1启动子的TC-rich repeats区域有防
御与胁迫反应位点。本实验筛选到的与生物胁迫相
关的蛋白有LOC103440403和LOC103 440484。
Gendra等(2004)发现蛋白LOC103440403可能与植
物的细胞死亡以及免疫反应抵御病原菌侵染等有
关, 参与防御反应。有相关报道CaGRP1与CaPIK1
表 2 MdHB1 互作蛋白的筛选结果
Table 2 Screening results of MdHB1 interaction proteins
基因 ID 基因注释 预测功能
LOC103414026 三角状五肽重复蛋白 在植物的生长发育、细胞器形成、细胞质雄性不育的育性恢复、RNA的编辑
加工、细胞核与细胞器之间信号传递、逆境防御等方面具有重要作用
LOC103440038 RNA聚合酶因子 基本蛋白调节光系统的化学计量, 从而维持稳定的电子流和光合效率
LOC103440484 抗病相关蛋白 可控制特异病原物识别位点, 激活后续防御反应
LOC103419882 脱水相关蛋白 响应干旱、冷害、盐胁迫、脱落酸刺激
LOC103440403 甘氨酸丰富-RNA结合蛋白 可能与植物的细胞死亡以及免疫反应抵御病原菌侵染有关, 可能参与防御反应
LOC103409404 甘油醛-3-磷酸脱氢酶B 催化剂作用、参与卡尔文循环磷酸化途径
LOC103437829 叶绿素a-b结合蛋白P4 参与光合作用
LOC103423192 未知蛋白 功能未知
LOC103401859 氧甾醇结合相关蛋白 参与囊泡运输、细胞脂质代谢和细胞信号转导
图4 筛选到的MdHB1互作蛋白阳性克隆
Fig.4 The screened positive clones of MdHB1 interaction proteins
QDO/X/(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)培养基。
互作通过抑制活性氧积累调节CaPIK1诱导的细
胞死亡和防御反应 ( K i m等2 0 1 5 )。抗病蛋白
LOC10 3440484在植物抗病中可控制特异病原物
识别位点, 激活后续防御反应(Xiao等2001)。本
研究获得的与非生物胁迫相关的蛋白有LOC-
103414026和LOC103419882。在植物的生长发
育、细胞器形成、细胞质雄性不育的育性恢复、
RNA的编辑加工、细胞核与细胞器之间信号传
递、逆境防御等方面都离不开三角状五肽重复蛋
白LOC103414026。Yu等(2009)发现在水稻上缺了
三角状五肽重复蛋白的突变体会黄化。蛋白
LOC103419882能响应干旱、冷害、盐胁迫、脱落
酸的刺激(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki 1993)。
前人研究发现在向日葵、拟南芥的发育过程中
HaHB-4 (HD-Zip I)可能参与调控一些抗旱相关基
因的表达, 在特定的发育阶段, HaHB-4的表达受到
干旱和ABA的诱导(Dezar等2005a, b)。油菜的
BnHB6基因明显地与参与到对不同的生物与非生
物胁迫的相应的防御反应通路中的基因有一定的
联系(Yu等2005)。因此进一步推测MdHB1在苹果
植物生理学报1900
的防御和胁迫反应过程中有重要作用, 还待验证。
本实验还筛选到了与能量代谢有关的蛋白,
LOC103409404参与卡尔文循环与糖酵解(Brink-
mann等1989), LOC103401859被认为属于一种新
型蛋白质家族, 参与囊泡运输、细胞脂质代谢和
细胞信号转导(Lehto和Olkkonen 2003)。LOC-
103423192为一种未知蛋白, 对它的结构进行分析
预测有谷胱甘肽结合位点(Soranzo等2004)。前期
研究表明HD-Zip I基因可能参与到对胁迫应答或
植物发育中的不同的植物激素信号转导的响应中
(亢键等2014)。综合以上结果推测MdHB1或许参
与物质代谢或转运, 或许参与抗逆胁迫, 光合作用
等多条信号传导通路, 形成网络调控苹果生长发育
及逆境过程, 具体功能有待进一步的挖掘。由于酵
母双杂假阳性较高, 而且以MdHB1为诱饵, 通过酵
母双杂交进行互作筛选的研究还未见报道, 再确认
互作之前, 还需要BiFC或Pull-down等技术进行验
证, 为进一步研究MdHB1的功能提供线索。
参考文献
亢键, 姜永华, 王豪杰, 杨艳青, 任小林(2014). 苹果果实HD-ZiP I
转录因子亚家族基因鉴定及表达分析. 西北农业学报, 23 (9):
160~165
李兴亮(2014). 苹果果实发育及成熟进程中乙烯发生的信号转导机
制[学位论文]. 北京: 中国农业大学
王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平(2009). 果实蛋白质组学研究的实验
方法. 植物学报, 44 (1): 107~116
杨剑飞, 王宇, 杨琳, 李玉花(2014). 光敏色素互作因子PIFs是整合
多种信号调控植物生长发育的核心元件. 植物生理学报, 50
(8): 1109~1118
于巧平, 尹明安, 任小林, 姜永华(2012). 苹果ACO1转录因子
MdHB1基因的克隆及其真核表达载体的构建. 西北农林科技
大学学报(自然科学版), 40 (10): 154~160
张今今, 王跃进, 王西平, 杨克强, 杨进孝(2003). 葡萄总RNA提取
方法的研究. 果树学报, 20 (3): 178~181
张晶红, 那杰(2014). 植物逆境胁迫耐受性启动子的研究进展. 植物
生理学报, 50 (6): 707~710
朱敏, 尹明安, 叶红红, 任小林(2014). 苹果ACO1基因及转录因子
MdHB1基因的表达模式. 食品科学, 35 (23): 166~170
Brinkmann H, Cerff R, Salomon M, Soll J (1989). Cloning and se-
quence analysis of cDNAs encoding the cytosolic precursors of
subunits GapA and GapB of chloroplast glyceraldehyde-3-phos-
phate dehydrogenase from pea and spinach. Plant Mol Biol, 13
(1): 81~94
Dezar CA, Fedrigo GV, Chan RL (2005a). The promoter of the sun-
flower HD-Zip protein gene Hahb4 directs tissue-specific ex-
pression and is inducible by water stress, high salt concentrations
and ABA. Plant Sci, 169 (2): 447~456
Dezar CA, Gago G.M, Gonzalez DH, Chan RL (2005b). Hahb4, a
sunflower homeobox-leucine zipper gene, is a developmental
regulator and confers drought tolerance to Arabidopsis thaliana
plants. Transgenic Res, 14: 429~440
Gendra E, Moreno A, Albà MM, Pages M (2004). Interaction of the
plant glycine-rich RNA-binding protein MA16 with a novel nu-
cleolar DEAD box RNA helicase protein from Zea mays. Plant J,
38 (6): 875~886
Green BR, Durnford DG (1996). The chlorophyll-carotenoid proteins
of oxygenic photosynyhesis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol
Biol, 47: 685~714
Hakimi MA, Privat I, Valay JG, Lerbs-Mache S (2000). Evolutionary
conservation of C-terminal domains of primary sigma70-type
transcription factors between plants and bacteria. J Biol Chem,
275 (13): 9215~9221
Henriksson E, Olsson A, Johannesson H, Johansson H, Hanson J,
Engstrom P, Soderman E (1995). Homeodomain leucine zipper
class I genes in Arabidopsis. Expression patterns and phyloge-
netic relationships. Plant Physiol, 139: 509~518
Kim DS, Kim NH, Hwang BK (2015). Glycine-rich RNA-binding
protein1 interacts with receptor-like cytoplasmic protein kinase1
and suppresses cell death and defense response in pepper. New
Phytol, 205 (2): 786~800
Lehto M, Olkkonen VM (2003). The OSBP-related proteins: a novel
protein family involved in vesicle transport, cellular lipid metab-
olism, and cell signaling. BBA-Mol Cell Biol, 1631 (1): 1~11
Miyake T, Loch CM, Li R (2002). Identification of a multifunctional
domain in autonomously replicating Sequence-Binding Factor
1 required for transcriptional activation, DNA replication, and
gene silencing. Mol Cell Biol, 22 (2): 505~516
Privat I, Hakimi MA, Buhot L, Favory JJ, Mache-Lerbs S (2003).
Characterization of Arabidopsis plastid sigma-like transcription
factors SIG1, SIG2 and SIG3. Plant Mol Biol, 51 (3): 385~399
Soranzo N, Sari Gorla M, Mizzi L, De Toma G, Frova C (2004). Or-
ganisation and structural evolution of rice glutathione S-transfer-
ase gene family. Mol Genet Genomics, 271 (5): 511~521
Xiao S, Ellwood S, Calis O, Patrick E, Li T, Coleman M, Turner JG
(2001). Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thali
ana mediated by RPW8. Science, 291 (5501): 118~120
Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1993). The plant hormone ab-
scisic acid mediates the drought-induced expression but not the
seed-specific expression of rd22, a gene responsive to dehydra-
tion stress in Arabidoposis thaliana. Mol Gen Genet, 238 (1-2):
17~25
Yu QB, Jiang Y, Chong K, Yang ZN (2009). AtECB2, a pentatrico-
peptide repeat protein, is required for chloroplast transcript accD
RNA editing and early chloroplast biogenesis in Arabidopsis
thaliana. Plant J, 59 (6): 1011~1023
Yu SW, Zhang LD, Zuo KJ, Tang DQ, Sun XF, Tang KX (2005).
Brassica napus L. homeodomain leucine-zipper gene BnHB6
responds to abiotic and biotic stresses. J Integr Plant Biol, 47 (10):
1236~1248