全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 312–316　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0639312
收稿 2015-12-04　　修定 2015-12-29
资助 国家自然科学基金(31300503和31460197)。
致谢 中国热带农业科学院橡胶研究所的康桂娟博士在文库构
建过程中给予的指导和帮助。
* 共同通讯作者(E-mail: wangmeng@hainu.edu.cn; qin-
bi126@163.com)。
巴西橡胶树胶乳均一化酵母双杂交cDNA文库构建
余海洋1, 张宇1, 王萌1,*, 覃碧2,*
1海南大学环境与植物保护学院, 海口570228; 2中国热带农业科学院橡胶研究所, 海南儋州571737
摘要: 以巴西橡胶树无性系‘热研7-33-97’胶乳为材料, 采用SMART® cDNA合成技术反转录合成cDNA第一链, 并通过LD-
PCR合成双链cDNA (ds-cDNA), 采用双链特异性核酸酶(DSN)对ds-cDNA进行均一化处理, 并经过CHROMA SPIN+TE-400
柱子去除短片段的cDNA, 纯化后的cDNA和线性化载体pGADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞构建均一化酵母双杂交
cDNA文库。结果显示: 均一化之前橡胶树胶乳cDNA片段分布较广, 丰度分布不均匀, 经DSN均一化处理和CHROMA
SPIN+TE-400柱纯化后, 小于500 bp的片段得到有效去除, 高丰度cDNA明显下降, 而且RT-PCR扩增结果显示, 均一化处理
后, 18S rRNA和β-actin两个管家基因的表达丰度均明显降低。最终获得初始文库的独立克隆为1.26×106 cfu, 文库滴度达到
3.23×107 cfu·mL-1, 重组率为87%, 平均插入片段大于1.0 kb。本研究构建了一个橡胶树胶乳均一化酵母双杂交cDNA文库,
为进一步研究天然橡胶生物合成途径及其调控的分子机制提供借鉴。
关键词: 巴西橡胶树; 胶乳; 酵母双杂交cDNA文库; 均一化
巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源, 天然橡
胶是通过切割橡胶树树干树皮中的乳管所得的胶
乳加工而成。天然橡胶的生物合成途径研究始于
20世纪50年代, 至今, 天然橡胶生物合成途径已基
本清楚, 但其调控的分子机制尚不清楚。采用酵
母双杂交技术构建巴西橡胶树胶乳均一化酵母双
杂交cDNA文库对克隆胶乳特异表达基因及其功
能鉴定、筛选与天然橡胶生物合成关键酶互作的
蛋白、研究天然橡胶生物合成途径及其调控的分
子机制具有十分重要的意义。
橡胶树胶乳主要是乳管细胞的细胞质
(Southorn 1960), 胶乳中表达丰度最高的是橡胶延
伸因子(rubber elongation factor, REF)和小橡胶粒
子蛋白(small rubber particle protein, SRPP) (Chow
等2007)。采用传统的cDNA文库构建方法, 常会导
致部分低丰度mRNA丢失或者筛选困难。均一化
cDNA文库(normalized cDNA library), 即某一特定
组织或细胞的所有表达基因均包含其中且含量大
致相等的cDNA文库, 该文库使所有的mRNA丰
度趋于一致, 降低高丰度表达基因, 有效富集低丰
度表达基因 , 降低冗余率。双链特异性核酸酶
(duplex-specific nuclease, DSN)是2002年在堪察加
拟石蟹(Paralithodes camtschaticus)体内发现的一
种热稳定的DSN (Shagin等2002), 该酶能够选择性
降解双链DNA和DNA–RNA杂交体中的DNA, 对
单链核酸分子几乎没有作用 , 已被成功地用于
cDNA均一化文库构建(张石柱等2007; 郑嫩珠等
2012; Zhulidov等2004)。与传统的均一化技术相
比, DSN均一化技术步骤少且操作简单, 效率高, 但
在橡胶树中鲜有使用此方法构建均一化cDNA文
库的报道。本研究采用SMART® cDNA合成技术
和DSN均一化技术构建巴西橡胶树胶乳均一化酵
母双杂交cDNA文库, 并对该文库质量进行分析和
评价, 以期为进一步利用酵母双杂交技术筛选天
然橡胶生物合成关键酶互作蛋白及其调控蛋白、
克隆天然橡胶生物合成调控相关基因提供借鉴。
材料与方法
1 材料
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll. Arg.)无
性系‘热研7-33-97’开割树, 种植于中国热带农业科
学院试验场实验基地。割胶后收集胶乳用于总
RNA提取。
2 方法
2.1 橡胶树胶乳总RNA提取与检测
胶乳总RNA参照Tang等(2007)的方法进行提
取。用微量分光光度计(Thermo Scientific Nano-
Drop 2000)测定RNA的纯度及浓度, 用1%的琼脂
糖凝胶电泳检测其完整性。
余海洋等: 巴西橡胶树胶乳均一化酵母双杂交cDNA文库构建 313
2.2 cDNA第一链合成
利用Make Your Own “Mate & Plate™” Library
System (Clontech Laboratories, Inc., USA; Clontech)
中的cDNA合成组分合成第一链cDNA, 引物为
CDS III Primer [5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGG-
CCGACATG-d(T)30VN-3′], 然后采用Advantage
®
2 Polymerase Mix (Clontech)试剂盒进行两轮
LD-PCR扩增获得双链cDNA (ds-cDNA), 具体步骤
参照试剂盒说明书进行操作 , 所用扩增引物为
5′PCR Primer (5′-TTCCACCCAAGCAGTGGTAT-
C A A C G C A G A G T G G - 3 ′ )和3 ′ P C R P r i m e r
(5′-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGG-
CGGCCGACA-3′)。获得的ds-cDNA经E.Z.N.A.® Gel
Extraction Kit (OMEGA Bio-tek Inc., USA)试剂盒进行
纯化, 步骤参照试剂盒说明书进行操作, 最后用无
菌的去离子水(ddH2O)进行洗脱回收ds-cDNA。
2.3 cDNA均一化及其效果检测
利用Duplex-specific nuclease (Evrogen JSC,
Russia)试剂盒进行cDNA均一化处理。2 μL ds-cD-
NA(约200 ng)加入2 μL杂交缓冲液[200 mmol·L-1
HEPES–HCl (pH 7.5), 2 mol·L-1 NaCl, 0.8 mmol·L-1
EDTA], 并用ddH2O补至8 μL, 98°C变性3 min, 68°C
杂交5 h; 之后加入2 μL经68°C预热的10×DSN mas-
ter buffer、9 μL ddH2O和1 μL DSN solution, 混匀
后68°C反应20 min; 然后加入10 μL 2×DSN stop
buffer和10 μL ddH2O, 混匀后68°C反应5 min以终
止反应, 获得均一化处理后的cDNA。
取DSN均一化后的cDNA再经两轮LD-PCR扩
增放大后, 用CHROMA SPIN+TE-400柱(Clontech)
纯化。过柱回收的产物与均一化之前的LD-PCR
扩增产物各取5 μL以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检
测, 同时取过柱回收的产物与均一化之前的LD-
PCR扩增产物各1 μL作为模板, 以两个管家基因
18S rRNA (正向引物: 5′-GCTCGAAGACGAT-
CAGATACC-3′; 反向引物: 5′-TTCAGCCTTGC-
GACCATAC-3′; 146 bp)和β-actin (正向引物:
5′-GATGTGGATATCAGGAAGGA-3′; 反向引物:
5′-CATACTGCTTGGAGCAAGA-3′; 120 bp) (Qin
等2015)进行RT-PCR扩增, 在20、25和30个循环后
各取20 μL扩增产物, 用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测
均一化效果。
2.4 cDNA文库构建
取过柱纯化后的20 μL ds-cDNA (约7 μg)和6
μL pGADT7-Rec (0.5 μg·μL-1)共转化Y187感受态
细胞, 感受态细胞制备和转化方法参照Yeastmaker
Yeast Transformation System 2 (Clontech)试剂盒说
明书进行操作, 在直径150 mm的SD/−Leu培养皿上
涂抹150 μL转化液(共100个培养皿)。在直径100
mm的SD/−Leu培养皿上分别涂抹1/10和1/100的稀
释转化液, 以检测转化的效率。培养皿在30°C条
件下倒置培养3~4 d至菌落出现, 然后在每个平板
中各加入5 mL冷冻培养基(YPDA/25%甘油), 将菌
落从平板上刮下来全部收集在无菌的三角瓶中,
共300 mL, 按每管1 mL分装至1.5 mL的微量离心
管中, 保存于−80°C冰箱。
2.5 文库库容和cDNA插入片段检测
取100 μL菌液分别按1 000、10 000和100 000
倍稀释后取100 μL涂布100 mm SD/−Leu平板,
30°C培养3~4 d, 待菌落长出来以后计算文库的滴
度, 文库滴度=(平板上克隆数×稀释倍数/涂板体
积)×菌液总体积。然后随机挑取平板上生长的单
菌落, 以pGADT7载体通用引物T7 (5′-TAATAC-
GACTCACTATAGGG-3′)和3′AD (5′-AGATGGTG-
CACGATGCACAG-3′)对其进行PCR扩增。扩增
程序为: 94°C预变性3 min; 94°C变性30 s, 55°C退
火30 s, 72°C延伸3 min, 循环数为30; 72°C延伸10
min。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测cDNA插入片
段的大小。
实验结果
1 总RNA提取
以巴西橡胶树‘热研7-33-97’的胶乳为材料,
提取总RNA, 经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如
图1所示 , 可观察到总RNA有18S rRNA和28S
rRNA两条带, 且28S rRNA的量约为18S rRNA的2
倍, 表明总RNA没有降解, 质量较好。进一步采用
分光光度计测定其含量与质量, 结果显示, OD260/
OD280=2.069, 总RNA的浓度为1 506 ng·μL
-1, 表明
总RNA的质量和纯度满足建库的要求。
2 ds-cDNA的合成
以2.0 μL总RNA反转录合成第一链, 然后经两
轮LD-PCR扩增后, 经电泳检测结果显示ds-cDNA
植物生理学报314
呈弥散状, 片段分布较广, 丰度不均匀, 中间有若
干较亮条带代表高丰度表达基因(图2)。以上结果
表明不同大小和丰度的mRNA都得到了有效的反
转录和扩增。
3 DSN均一化效果
ds-cDNA经DSN均一化处理后, 再次采用两
轮LD-PCR进行扩增放大, 所得产物用CHROMA
SPIN+TE-400柱纯化以去除小片段cDNA。过柱后
最终回收的产物经检测显示, 小于500 bp的片段基
本被去除, 如图2所示, 其中DSN均一化处理前的
ds-cDNA中代表高丰度基因的亮带消失, 呈现出一
条均匀的弥散条带, 且分布在500 bp以上, 表明高
丰度基因的丰度明显下降。分光光度计检测过柱
后最终回收的产物浓度为384 ng·μL-1。为了进一
步检测ds-cDNA经DSN均一化后对高丰度基因的
均一化效果, 采用两个管家基因18S rRNA和β-actin
分别对DSN均一化前以及均一化并过柱纯化后的
cDNA进行扩增检测, 结果如图3所示, 经扩增30个
循环后, DSN均一化处理后的cDNA中, 18S rRNA
和β-actin两个基因的表达丰度均明显低于均一化
之前。以上结果表明, 均一化处理有效地降低了
高丰度基因的水平, 过柱纯化后的cDNA质量良好,
cDNA的量足够构建一次文库, 可进一步用于文库
构建。
4 均一化酵母双杂交文库构建及质量评价
过柱纯化后的 d s - c D N A和线性化质粒
pGADT7-Rec共转化Y187感受态细胞, 转化后的菌
落生长情况如图4所示, 经统计和计算, 初始文库
独立克隆为1.26×106 cfu, 取收集后的文库菌液100
μL, 按1 000、10 000和100 000倍稀释后, 分别涂布
100 μL稀释液于100 mm SD/−Leu平板, 统计单克
隆数并计算文库滴度。结果显示, 所构建文库的
滴度为3.23×107 cfu·mL-1。从文库中随机挑取23个
阳性克隆, 以pGADT7载体通用引物T7和3′AD进
行PCR扩增检测插入片段大小, 结果如图5所示, 有
插入片段的阳性克隆为20个, 插入片段两端的载
体序列大约为200 bp, 去除载体序列后, 其中插入
片段≥1.0 kb的单克隆为14个, 插入片段≥0.7 kb的
单克隆为6个, 平均插入片段大于1.0 kb, 重组率的
计算方法为: 有插入片段的反应个数/反应总数
×100%。所得文库的重组率为87%。
图1 橡胶树胶乳总RNA电泳图
Fig.1 Total RNA of the latex of rubber tree
图3 均一化前后18S rRNA (A)和β-actin (B)表达丰度变化检测
Fig.3 Detection of 18S rRNA (A) and β-actin (B) abundance
in normalized and non-normalized cDNA
分别以均一化之前(1~3)和均一化之后并过柱纯化的(4~6)
cDNA为模板扩增18S rRNA (A)和β-actin (B), 1和4扩增20个循环, 2
和5扩增25个循环, 3和6扩增30个循环。
图2 均一化之后和均一化之前的cDNA检测结果
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of normalized
and non-normalized cDNA
M: DL2000 DNA Marker, 下同; 1: 均一化后cDNA; 2: 未均一
化cDNA。
余海洋等: 巴西橡胶树胶乳均一化酵母双杂交cDNA文库构建 315
讨　　论
高质量的酵母双杂交cDNA文库是筛选互作
蛋白的重要基础, 文库的质量对后续实验的成败
起关键作用。评价文库质量的参数主要有文库的
滴度、重组率、插入片段大小以及均一化效果。
在cDNA的合成过程中, LD-PCR的循环次数影响
所合成cDNA的大小以及基因在文库中的丰度(崔
红军等2008; 张爱香等2005)。本研究经过柱纯化
后的cDNA片段经电泳检测, 其范围在500 bp以上
均匀分布, 而且两个管家基因18S rRNA和β-actin的
扩增检测结果显示, 管家基因的表达水平明显低
于均一化之前, 表明LD-PCR反应条件是适合的。
均一化之前进行了两轮LD-PCR放大, 均一化之后
再经过两轮LD-PCR放大, 一方面减少起始总RNA
的使用量, 并保证了过柱纯化后有足够量的ds-cD-
NA用于文库构建, 另一方面使低丰度基因得到扩
大, 提高筛库获得低丰度基因的机率。根据试剂
盒说明书, 所构建的酵母双杂交cDNA文库的滴度
应该大于1×107 cfu·mL-1, 以保证文库的完整性与
覆盖度。本文采用Make Your Own “Mate &
Plate™” Library System与DSN均一化技术相结合
构建的均一化酵母双杂交cDNA文库, 高丰度基因
在均一化处理后明显降低, 文库的滴度为3.23×107
cfu·mL-1, 重组率为87%, 平均插入片段大于1.0
kb。从文库的鉴定结果来看, 本文所构建的文库
质量良好, 可为橡胶树胶乳特异表达基因的克隆
和功能研究以及研究天然橡胶生物合成的调控机
制提供参考。
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图5 均一化文库插入片段大小检测
Fig.5 Detection of the insert size of the normalized library
1~23: 随机挑选的23个文库单克隆PCR产物。
图4 均一化文库的菌落生长情况
Fig.4 Colonies of the normalized library
A: 取150 μL转化悬浮液涂布150 mm SD/−Leu平板的生长情况; B: 取100 μL 1/10转化悬浮液涂布100 mm SD/−Leu平板的生长情况; C:
取100 μL 1/100转化悬浮液涂布100 mm SD/−Leu平板的生长情况。
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rubber tree (Hevea brasiliensis Müll. Arg.)
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1College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China; 2Rubber Research Institute, Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract: In this study, the latex of rubber tree (Hevea brasiliensis) clone ‘Reyan 7-33-97’ was used as plant
material. SMART® cDNA synthesis technology was used to generate the first strand cDNA, and then long
distance PCR (LD-PCR) was used to amplify double-strand cDNA (ds-cDNA). The ds-cDNA was normalized
by duplex-specific nuclease (DSN). The normalized cDNA was purified by running CHROMA SPIN+TE-400
column to remove short cDNA fragments. The purified cDNA and linear vector pGADT7-Rec were co-trans-
formed into competent Y187 yeast cell to generate a normalized yeast two-hybrid cDNA library. The results
show that the cDNA of the latex of rubber tree was wide range of fragment sizes and with uneven abundance
before normalization. After normalized by DSN and purified using CHROMA SPIN+TE-400 column, cDNA
below 500 bp had been removed efficiently, and high abundance of cDNA had been reduced significantly.
Moreover, RT-PCR revealed that the transcripts of two housekeeping genes 18S rRNA and β-actin were
decreased significantly after normalization. The harvested library had 1.26×106 independent clones. The titer of
the library was up to 3.23×107 cfu·mL-1, the recombination rate was 87%, and the average insert size was more
than 1.0 kb. In this study, a normalized yeast two-hybrid cDNA library from the latex of rubber tree has been
successfully established, which provides a reference for studying natural rubber biosynthetic pathway and its
molecular regulation mechanism in rubber tree.
Key words: Hevea brasiliensis; latex; yeast two-hybrid cDNA library; normalization
Received 2015-12-04 Accepted 2015-12-29
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31300503 and 31460197).
*Co-corresponding authors (E-mail: wangmeng@hainu.edu.cn; qinbi126@163.com).