全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 7 期, 2010 年 7 月 671
收稿 2010-03-01 修定 2010-05-31
资助 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08002-
011B)和河南省教育厅自然科学研究计划(2009A210012)。
* 通讯作者(E-mail: yongchunli71@yahoo.com.cn; Tel:
0 37 1-63 5 58 21 5)。
小麦富含亮氨酸重复(LRR)蛋白基因 TaLRI1的克隆及其特征分析
孟凡荣 1, 冉彩华 1, 刘浩 1, 陈雷 2, 李金花 2, 尹钧 2, 李永春 2,*
河南农业大学 1 生命科学学院, 2 国家小麦工程技术研究中心, 郑州 450002
提要: 在水分胁迫反应基因表达谱分析的基础上, 采用RACR技术, 从 ‘洛旱 2号 ’小麦中克隆了一个编码富含亮氨酸蛋白
的 cDNA全长, 命名为 TaLRI1。序列分析显示, TaLRI1的 cDNA全长为 2 657 bp (GenBank登录号为GU593320), 其中 5-
非翻译区 47 bp, 3-非翻译区1 314 bp, 开放阅读框 1 296 bp, 可编码431个氨基酸。进一步分析显示, TaLRI1基因编码的蛋
白具有典型的富含亮氨酸N末端保守域和富含亮氨酸的核酸酶抑制因子保守域, 该蛋白为弱酸性蛋白, 等电点为5.69, 无
明显的疏水 /亲水区域。三维结构预测显示, TaLRI1蛋白以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为骨架, 可形成弧状的螺线管结构
以及一对侧臂凸起。RT-PCR分析表明, 水分胁迫过程中, TaLRI1基因在根系中的表达量呈先升高后降低的趋势, 以胁迫
处理12 h的表达量最高, 推测该基因在水分胁迫反应过程中发挥重要功能。
关键词: 小麦; TaLRI1; 基因克隆; 序列特征
Cloning and Characterization of a Leucine-Rich Repeat (LRR) Protein Gene
TaLRI1 in Wheat (Triticum aestivum L.)
MENG Fan-Rong1, RAN Cai-Hua1, LIU Hao1, CHEN Lei2, LI Jin-Hua2, YIN Jun2, LI Yong-Chun2,*
1College of Life Sciences, 2National Engineering Research Centre for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,
China
Abstract: Based on our previous study on the water stress responsive transcriptomes in wheat, a full-length
cDNA, encoding a leucine-rich repeat (LRR) protein, was cloned via rapid amplification of cDNA ends (RACE)
technology from the wheat (Triticum aestivum) cultivar ‘Luohan 2’, which was termed as TaLRI1 with the
GenBank accession No. of GU593320. Sequence analysis showed that the full-length cDNA of TaLRI1 was
2 657 bp, which including 47 bp 5 UTR, 1 314 bp 3 UTR and 1 296 bp open reading frame (ORF) encoding 431
amino acid residues. The further analysis indicated that a typical LRR N-terminal domain and a LRR ribonu-
clease inhibitor (LRR_RI) domain was included in the deduced amino acid sequence of TaLRI1. The putative
TaLRI1 protein was acidulous with a pI of 5.69 and obvious hydrophobic or hydrophilic domains were not
found in it. The 3D structure prediction showed that the TaLRI1 was constructed by α-helixes, β-strands and
random loops, and could wrap around in a curved, right-handed solenoid with a pair of extended side arms. The
expression pattern of TaLRI1 in roots under water stress was analyzed via RT-PCR and the results showed that
the gene was gradually induced with the water-stress accumulation, while its expression level decreased after 12
h after water-stress treatment, which indicated that the TaLRI1 played important roles during the water-stress
responding in wheat.
Key words: wheat; TaLRI1; gene cloning; sequential characterization
干旱是影响作物持续高产稳产的主要逆境因
子之一, 关于作物水分胁迫反应分子调控机理的研
究是现代作物分子生物学领域的重要课题(Shinozaki
和 Yamaguchi-Shinozaki 2007; 王转等 2004)。研
究表明, 植物对水分胁迫的感知和调节机制非常复
杂, 涉及到许多胁迫反应相关基因的表达与调控(杨
洪强等 2001; Tardif 等 2007; Xiang 等 2007)。富
含亮氨酸重复(leucine-rich repeat, LRR)的蛋白是一
类包含由 20~29 个氨基酸组成的重复序列的蛋白,
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可形成由α-螺旋和β-折叠组成的规则螺线管空间
结构。自1985年首次报道人类LRR蛋白(Takahashi
等 1985)以来, 已经在动物、真菌以及植物中相继
发现了一批具有LRR的蛋白。研究发现, LRR的保
守域为包含 11个氨基酸残基的LxxLxLxx(N/C)xL
结构(其中, “ x ” 可以为任意氨基酸) (K ob e 和
Deisenhofer 1994), 该结构在蛋白互作及植物逆境
胁迫信号转导过程中发挥着重要的调节功能(Baker
等 1997; Vadassery 和 Oelmuller 2009)。我们在前
期分析小麦水分胁迫反应基因表达谱时, 发现了一
个受水分胁迫诱导的基因(TaAffx.99551.1)被注释
为编码 LRR 蛋白的基因(李永春等 2008)。为了进
一步分析该基因在小麦中的存在情况, 本文以探针
组的代表序列为基础, 通过RACE技术从小麦中克
隆了该基因的 cDNA全长(命名为TaLRI1), 并系统
分析了其编码蛋白的结构特性, 为进一步探讨小麦
TaLRI1 基因在逆境胁迫反应过程中的生物学功能
奠定了基础。
材料与方法
将 ‘洛旱 2号 ’小麦(Triticum aestivum L.)种子
在培养皿中水培至两叶一心期, 选取生长发育一致
的幼苗, 用 20% 的 PEG6000 进行水分胁迫处理。
剪取胁迫处理 0、0 .5、1 .0、2 .0、6 .0、12.0、
24.0 和 48.0 h 的根系, 迅速用液氮冷冻后保存于
-80 ℃备用。
总 RNA 提取采用 Trizol RNA 提取试剂盒,
RNA 纯化参照 Meng 等(2007)的方法进行。依据
Affymetrix小麦基因芯片探针组TaAffx.99551.1的
代表序列(GB: CA653329)设计特异性引物 GP1 (5
ATGATAACAGCACGGACAT 3)和 GP2 (5
TGTGGAGACGGTTGAGAGG 3), 通过RT-PCR技
术从‘洛旱2号’小麦中克隆到该基因的部分cDNA
片段, 并进行测序分析。根据克隆片段的序列信息
再设计嵌套引物 GP3 (5 GCCATTTGCGGAC-
AAGTTCA 3)、GP4 (5 GCTTGCCTTGGGTCG-
TTGATGA 3)、GP5 (5 CCATCATCAACGAC-
CCAAG 3)和GP6 (5 ATCAACGACCCAAGGCAAG
3)用于该基因 5 端和 3 端 cDNA 序列的克隆。5
和 3 RACE 试剂盒采用 TaKaRa 公司的产品, 具体
操作步骤根据试剂盒说明进行。引物组合情况为:
GP3和GP5分别与5和3 RACE试剂盒提供的Outer
Primer 组合进行扩增, 而 GP4 和 GP6 则与相应的
Inner Primer 组合。扩增 DNA 片段采用北京天为
时代DNA凝胶回收试剂盒回收后连接于pGEM-T
Easy 载体(Promega 公司)中, 并转化大肠杆菌
DH5α, 然后送北京博尚生物技术有限公司进行测
序分析; cDNA序列的初步分析、氨基酸翻译使用
DNAMAN 软件, 蛋白质一级结构以及三级结构分
析通过ExPaSy (http://www.expasy.org)分析(Arnold
等 2006), 二级结构的预测采用 PredictProtein (http://
www.predictprotein.org/)分析(Rost 等 2004)。
提取水分胁迫处理不同时间后的小麦根系
RNA, 反转录获得的 cDNA作为半定量RT-PCR分
析的模板。用于半定量分析的特异引物为 GP1 和
GP2。为防止扩增达到平台期, 分别进行 28、30
和 35 个循环的扩增, 最后选用 30个循环进行表达
特性分析。内标基因 Ac t i n 的扩增引物序列为:
Actin-1, 5 CAGCAACTGGGATGATATGG 3; Actin-
2, 5 ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT 3。
结果与讨论
1 小麦TaLRI1全长 cDNA的克隆和序列分析
采用 Affymetrix 小麦芯片中探针组 TaAffx.
99551.1 对应代表序列的特异引物 GP1 和 GP2, 通
过 RT-PCR 技术从 ‘ 洛旱 2 号 ’ 中克隆到了大小为
285 bp 的 DNA 片段, 测序分析显示克隆序列和代
表性序列(GB: CA653329)高度同源。用已克隆片
段设计的特异引物GP3和GP5分别与5和3 RACE
试剂盒提供的Outer Primer组合进行 5和 3 RACE
的Outer PCR扩增, 进一步以5和3 RACE的Outer
PCR 产物为模板, 分别进行 Inner PCR 扩增, 结果
发现5 RACE获得了约300 bp的特异片段, 3 RACE
获得了约 2 300、800 和 700 bp 的 3 个片段(图 1)。
将上述片段回收、克隆并测序后发现, 5 RACE获
得的 300 bp 片段和 3 RACE 获得的 2 300 bp 片段
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为LRR基因的 cDNA片段, 而 3 RACE获得的 800
和700 bp两个片段均为非特异扩增产物, 与该基因
无关。通过DNAMAN软件对获得的序列进行拼接
组装后获得了小麦 LRR 基因的 cDNA全长。序列
分析显示, 该基因的 cDNA全长为2 657 bp, 其中5
UTR (非翻译区) 47 bp、3 UTR 1 314 bp、ORF
(开放阅读框) 1 296 bp。通过 NCBI 进行的 Blastx
分析表明, 该基因编码蛋白与LRR蛋白的同源性较
高, 其中与小麦(GenBank 登录号为 ACY30448)、
水稻(Oryza sativa) (GenBank登录号为 ABA91654
和 ABA91652)的氨基酸序列相似性分别为 64%、
63% 和 62%, 表明克隆基因为编码富含亮氨酸蛋
白的基因, 命名为 TaLRI1 (GenBank 登录号为
GU593320)。
2 小麦TaLRI1编码蛋白质的一级结构特性分析
分析表明, TaLRI1基因的蛋白包含431个氨基
酸, 其中含量较高的氨基酸有 Leu (19.3%)、Ser
(11.1%)和 Gly (10.2%); TaLRI1 蛋白的分子式为
C2012H3276N560O623S16, 分子量为45.79 kDa, 理论等电
点为5.69, 负电荷氨基酸(Asp+Glu)总数为31, 正电
荷氨基酸(Arg+Lys)总数为 24; TaLRI1蛋白的半衰
期理论值为30 h, 不稳定参数为33.85, 属于稳定蛋
白。进一步分析发现, TaLRI1蛋白还包含多个翻译
后修饰位点, 包括 10个N糖基化位点(第 47、114、
图 1 TaLRI1 基因 5 RACE 和 3 RACE 的巢式 PCR 扩增
Fig.1 Inner PCR amplification for 5 RACE
and 3 RACE of TaLRI1 gene
M: DNA 分子量标准; 1: 5 RACE inner PCR 产物; 2: 3 RACE
inner PCR 产物。
图 2 TaLRI1 的疏水性分析
Fig.2 Hydrophobicity profile of TaLRI1
横坐标为编码蛋白的氨基酸顺序; 纵坐标为亲、疏水值, 0 值以上的部分表示疏水区域, 0 值以下的部分表示亲水区域。
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122、161、198、209、256、305、359、408
位氨基酸)、4 个蛋白激酶 C 磷酸化位点(第 18、
200、292、344 位氨基酸)、4 个酪蛋白激酶 II
磷酸化位点(第 53、227、344、413 位氨基酸)和
1 个酪氨酸激酶磷酸化位点(第 247 位氨基酸)。
采用 ProtScale 进行的疏水性 / 亲水性分析显
示: TaLRI1蛋白的亲水性最高分值为-2.34, 疏水性
最高分值为 2.86, 且疏水性 / 亲水性氨基酸分布比
较均匀, 没有明显的疏水或亲水区域(图 2)。
3 小麦TaLRI1编码蛋白质的高级结构特性分析
通过PredictProtein对小麦TaLRI1基因编码蛋
白的二级结构预测显示, 该蛋白可形成由 α- 螺旋
(占整个氨基酸序列的19.03%)、β-折叠(占13.46%)
和无规卷曲(占 67.52%)组成的特定结构(图 3)。
NCBI的保守域分析显示(图4), TaLRI1蛋白包
含有典型的富含亮氨酸 N 末端保守域(从第 47~87
位氨基酸)和 LRR 核酸酶抑制因子(LRR ribonu-
clease inhibitor, LRR_RI)保守域(从第140~349位氨
基酸)。LRR_RI 是一类能对细胞内核酸酶起抑
制作用的功能蛋白, 可以通过延缓细胞内RNA的
降解速度直接参与真核基因的表达调控。另外,
LRR_RI 保守域也是 GTPase 激活蛋白(GTPase-
activating proteins)的重要特征(Marchler-Bauer 等
2009), 而GTPase激活蛋白是调控G蛋白活性的重
图 3 TaLRI1 蛋白的二级结构预测
Fig.3 The predicted secondary structure of TaLRI1
H: α- 螺旋; E: β- 折叠; L: 无规卷曲。
图 4 TaLRI1 的保守域分析
Fig.4 Conserved domains of TaLRI1
植物生理学通讯 第 46 卷 第 7 期, 2010 年 7 月 675
要因子, 通过激活 G 蛋白自身的 GTPase 活性, 使
得 G 蛋白从激活态(GTP- 结合形式)转变为失活态
(GDP-结合形式), 在逆境胁迫信号转导过程中发挥
着重要的调控功能。
蛋白三级结构预测结果显示, TaLRI1可以形成
图 5 小麦 TaLRI1 的三维结构预测图
Fig.5 The predicted 3D structure of TaLRI1
A: 正视图; B: 侧视图; C: 俯视图。I: 典型螺线管空间结构; II: 螺线管呈弧状弯曲; III: β- 折叠; IV: α- 螺旋。
LRR 蛋白的典型螺线管空间结构(图 5), 而且由 α-
螺旋和β-折叠组成的螺线管呈弧状弯曲, 在螺线管
弧状弯曲的侧面及背面分别由β-折叠和α-螺旋构
成了 2 个柄状长臂, 双臂夹角约为 120° (图 5)。该
结构是否会赋予小麦TaLRI1新的生物学功能还有
待于进一步研究。
4 水分胁迫过程中TaLRI1基因的表达分析
半定量RT-PCR分析结果表明, 在 ‘ 洛旱 2号 ’
幼苗的根系中, TaLRI1基因在水分胁迫过程中随着
胁迫时间的增加其表达量逐渐增强, 胁迫处理12 h
的表达量达到最强, 但胁迫24 h的表达量又开始下
降(图 6)。可见, TaLRI1 与小麦水分胁迫反应密切
相关。关于该基因在水分胁迫信号转导及基因表
达调控过程中的具体生物学功能仍有待于进一步深
入研究。
参考文献
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