全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 7 期, 2010 年 7 月 653
收稿 2009-12-13 修定 　2010-05-05
资助 东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验
室开放课题、东北林业大学林木遗传育种黑龙江省重
点实验室开放课题和黑龙江省青年科学技术专项资金项
目(Q C06C044 )。
致谢 Stefan Hohmann 教授(Göteborg University, Sweden)馈
赠酵母菌株 W 3 0 3 -1 A。
* 通讯作者(E-mail: yangcp@nefu.edu.cn; Tel: 0451-82190006)。
西伯利亚蓼中 PsMnSOD 基因的克隆及其抗逆性检测
付畅 1 , 刘关君 2,3, 张恒 1, 杨传平 2,3,*
1 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨 150025; 东北林业大学林学院 2 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验
室, 3 林木遗传育种黑龙江省重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 采用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了锰超氧化物歧化酶基因PsMnSOD的 cDNA (GenBank登录号FJ848572)。长
为 792 bp的 PsMnSOD cDNA序列含有编码 234个氨基酸的 705 bp的开放读码框、57 bp的 5非翻译区和 30 bp的 3非翻
译区。构建了PsMnSOD基因的酵母表达载体 pYES2-PsMnSOD并将其转化到野生型酵母菌株中。分析PsMnSOD基因在
酵母中的表达对酵母SOD酶活性的影响及其对盐胁迫、PEG胁迫、高温和低温胁迫下抗逆性影响的结果表明, PsMnSOD
基因在酵母中表达后酵母SOD酶活性提高, 酵母对盐渍、PEG、高温和低温等非生物胁迫的抗逆性也增强。
关键词: 西伯利亚蓼; 锰超氧化物岐化酶; 抗逆性
Cloning and Identification of Stress Resistance of Superoxide Dismutase Gene
PsMnSOD from Polygonum sibiricum Laxm
FU Chang1, LIU Guan-Jun2,3, ZHANG Heng1, YANG Chuan-Ping2,3,*
1College of Life Sciences and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025, China; 2Key Laboratory of Ministry of
Education for Forestry Tree Genetic Improvement and Biotechnology, 3Key Laboratory of Heilongjiang Province for Forestry Tree
Genetic Improvement, School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: In this research, PsMnSOD cDNA (GenBank No. FJ848572) was isolated from Polygonum sibiricum
by RACE technology. The nucleotide sequence of PsMnSOD cDNA is 792 bp containing an open reading frame
of 705 bp encoding 234 amino acids, with a 5 untranslated region of 57 bp and a 3 untranslated region of 30 bp.
The PsMnSOD gene yeast expression vector pYES2-PsMnSOD was constructed and transformed into wild
yeast strain. The effects of PsMnSOD gene expression on superoxide dismutase activity and resistance to
abiotic stress including salt, PEG, high temperature and low temperature of yeast were determined. The results
indicated that expression of PsMnSOD gene in yeast improved superoxide dismutase activity and resistance
ability to abiotic stress including salt, PEG, high temperature and low temperature.
Key words: Polygonum sibiricum; manganese superoxide dismutase; stress resistance
一般来说, 植物抵御逆境胁迫的抗性与抗氧化
酶的活性密切相关(Jithesh 等 2006)。在活性氧胁
迫下, 植物感受ROS信号后能够激活转录因子并使
其结合到抗氧化酶基因启动子的抗氧化元件
(antioxidant responsive element, ARE)上, 介导抗氧化
酶基因表达, 于是清除活性氧的能力加强(Scandalios
2005)。超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,
SOD)是抗氧化酶之一, 能将 O2－· 转化为 H2O2, 再由
过氧化物酶将H2O2分解为H2O和O2。超氧化物歧
化酶可以分为Cu/Zn SOD (以Cu和Zn为辅助因子,
在植物中定位于细胞质和叶绿体中)、Mn SOD (以
Mn为辅助因子, 在植物中定位于线粒体和过氧化物
酶体中)和 Fe SOD (以 Fe 为辅助因子, 在植物中定
位于叶绿体中) 3种类型(Jithesh等2006)。Mn SOD
在维持活性氧的平衡中起作用(Kim 等 2008)。迄
今已从大豆、棉花、藏边大黄、荷花、葡萄、
小麦、烟草、马蹄莲、拟南芥、小盐芥和白花
柽柳等多种植物中分离到 MnSOD 基因的编码序
列。植物转 MnSOD 基因后 Mn SOD 活性增强, 抗
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 46 卷 第 7 期, 2010 年 7 月654
盐渍、干旱、寒冷和氧化胁迫的能力提高(Bowler
等 1991; McKersie 等 1993; Van Camp 等 1994;
Tanaka 等 1999; Kornyeyev等 2001; Wang等 2004;
覃鹏等 2004; 陈莉等 2008)。此外, 作为盐生植物
的西伯利亚蓼耐盐碱性很强, 可在盐碱地的碱斑中
心生长, 是分离抗逆基因和研究植物抗逆机制的良
好植物材料。本文从西伯利亚蓼中分离得到锰超
氧化物歧化酶基因PsMnSOD, 将其转入酵母中表达
后对其抗逆性进行了鉴定。
材料与方法
以从黑龙江省肇东市以南2 km处的盐碱地碱
斑处采取的西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm)
的地下茎为试材, 在温室中以草炭土为培养基质, 将
地下茎切段后扦插, 以淡水栽培, 进行扩繁培养。
当幼苗长至 4~5 片真叶时进行盐胁迫处理, 以 3%
NaHCO3 分别胁迫处理幼苗 2 h、6 h、12 h、1 d、
2 d 和 3 d 后, 取质量相同的幼苗叶片并将其混合。
后用液氮速冻并贮于-80℃下保存, 用于 RACE 扩
增。
PsMnSOD基因编码区克隆时, 从经3% NaHCO3
处理的西伯利亚蓼叶片cDNA文库中筛选MnSOD
基因的 EST 片段。根据此 EST 序列设计 5 RACE
引物MnSOD 及巢式引物MnSOD N (表 1)。以 3%
NaHCO3处理过的西伯利亚蓼幼苗叶片为材料, 用
SDS法提取RNA并用DNA酶 I去除基因组DNA。
按照SmartTM RACE cDNA Amplification Kit说明书
操作, 将 RNA 反转录成 5 RACE cDNA。PCR 反
应条件为: 94 ℃预变性 1 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30
s, 72 ℃ 1 min, 36 个循环; 72 ℃延伸 5 min。用胶
回收试剂盒(Promega产品)回收PCR产物后将其与
pGEM-T 载体(Promega)连接后再将连接产物转化
TOP10 感受态细胞, 经 Amp 抗性、蓝白斑反应和
菌落 PCR 筛选到阳性克隆。送上海生物工程技术
服务有限公司测序, 重组质粒命名为 pPsMnSOD。
分析PsMnSOD的氨基酸序列, 采用ClustalX1.8
软件进行序列比对, 用Mega4 软件生成进化树。
构建 PsMnSOD 基因表达载体和转化酵母时,
根据PsMnSOD 基因cDNA编码区的序列设计并合
成一对引物SOD-F和SOD-R (表1), 以pPsMnSOD
DNA作为模板, 扩增PsMnSOD 基因编码区并将其
亚克隆到 pMD19-T Simple 载体上, 阳性重组质粒
命名为 pT-PsMnSOD。用限制性内切酶 BamHI 和
EcoRI从pT-PsMnSOD质粒上切下PsMnSOD基因
的编码区 DNA 片段, 将其插入到 pYES2 载体的
BamHI/EcoRI 位点, 得到 PsMnSOD 基因的酵母表
达载体 pYES2-PsMnSOD (图 1)。将 pYES2-
PsMnSOD 和 pYES2 分别转化野生型酵母菌株
W303-1A, 以 SOD-F 和 SOD-R 为引物经菌落 PCR
鉴定酵母阳性转化子W303-1A (YES2-PsMnSOD),
表 1 基因克隆与表达载体构建所用引物序列
Table 1 The sequences of primers used in gene cloning and yeast expression vector constructing
名称 引物序列(5 → 3) 限制性内切酶酶切位点
MnSOD AACCCATATTCGAGACTTTATTACC
MnSOD N TTGTAAATACGAGGGCGATGC
GAL1-F ATTTTCGGTTTGTATTACTTC
GAL1-R GTTCTTAATACTAACATAACT
SOD-F CGCGGATCCCGTTCTCCACCAAAAGGCTA BamHI
SOD-R CCGGAATTCATTTGTAAATACGAGGGCG EcoRI
图 1 PsMnSOD 基因酵母表达载体 pYES2-PsMnSOD 的图谱
Fig.1 Map of PsMnSOD gene yeast expression vector of pYES2-PsMnSOD
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以 pYES2 载体的引物 GAL1-F 和 GAL1-R 鉴定
W303-1A (pYES2)。
酵母菌预培养时, 将酵母菌株 W303 -1A、
W303-1A (pYES2)和W303-1A (pYES2-PsMnSOD)
分别涂平板活化。挑取单菌落接种至5 mL SG-ura
液体培养基中, 30 ℃下以转速为200 r·min-1 的摇床
振荡培养24 h, OD600值达到0.2~1.0。取含有3×105
个细胞的培养液转接至YPG液体培养基中, 至总体
积为 5 mL。30 ℃下振荡培养 12 h 得到预培养物,
OD600 值介于 0.2~1.0。
按李合生(2000)书中方法检测盐胁迫下酵母菌
SOD 活性时, 取含有 1.2×106 个细胞的预培养物转
入 20 mL YPG 培养基中。于 30 ℃下以 200 r·min-1
的转速用摇床培养 36 h。取 10 mL 菌液于离心管
中, 以 13 400×g 离心 5 min后收集菌体沉淀并用液
氮研磨。按每克湿菌体 10 mL 的比例加入提取缓
冲液(50 mmol·L-1磷酸缓冲液, pH 7.8, 1%聚乙烯吡
咯烷酮), 在冰浴中研磨后于 4 ℃下以 10 000×g 离
心 20 min, 取上清液即 SOD 粗酶液。以能抑制反
应 50% 的酶量为 1 个 SOD 酶活单位, 用 U 表示。
SOD 活性 =(A0-AS)/(0.5A0·V1· 酶蛋白含量), 式中
SOD活性为 1个酶活单位 ·毫克 -1 (U·mg-1), A0为对
照管的光吸收值, AS 为样品管的光吸收值, V1 为测
定的粗酶液用量(mL), 酶蛋白含量单位为mg·mL-1。
分析转化 PsMnSOD 基因的酵母菌的抗逆性
时, 取含有 1.2×106 个细胞的预培养物转接至 YPG
液体培养基中, 至总体积为 20 mL。按以下条件
处理: (1) NaCl胁迫: YPG液体培养液中的NaCl浓
度分别为 0.4 和 0.6 mol·L-1, 于 30 ℃下振荡培养。
(2) PEG胁迫: YPG液体培养液中的PEG6000的浓
度分别为 0.2 和 0.3 g·mL-1, 于 30 ℃下振荡培养。
(3)高温胁迫: 将YPG液体培养液分别置于30 ℃ (对
照)、40 ℃和 50 ℃下振荡培养。按上述条件培
养 24 h后, 测定OD600值, 比较酵母菌株的生长量。
(4)低温胁迫: 取含有 1.2×106 个细胞的预培养物转
接至YPG液体培养基中, 至总体积为5 mL, 于30 ℃
下培养12 h后获得预培养物(OD600值介于0.2~1.0),
将其稀释至OD600=0.5后取10 μL稀释的预培养物,
向其中加入 0.1 mL 无菌水, 在 4 ℃条件下培养酵
母菌 24 h, 在YPG 固体平板上划线培养, 将平板置
于 30 ℃下培养 48 h 后记录并比较试验结果。
结果与讨论
1 PsMnSOD基因 cDNA及编码区的克隆
根据西伯利亚蓼文库中获得的PsMnSOD基因
的EST序列, 采用5 RACE引物MnSOD及MnSOD
N扩增得到800 bp左右的PsMnSOD基因的5端序
列 cDNA 片段。测序后得到 792 bp 的 cDNA 序列
(GenBank 登录号 FJ848572)。采用 NCBI 的 ORF
Finder 软件从获得的序列中查找 ORF, PsMnSOD
基因的开放读码框为 705 bp, 编码 234 个氨基酸,
5 非翻译区为 57 bp, 3 非翻译区为 30 bp。以西
伯利亚蓼PsMnSOD cDNA为模板, 利用引入BamHI
和 EcoRI 酶切位点的 PsMnSOD 基因特异性引物
(SOD-F和SOD-R)对PsMnSOD的开放读码框进行
PCR扩增, 克隆后经测序分析证实该扩增片段与预
期的 PsMnSOD 基因开放读码框一致。
2 PsMnSOD 基因的生物信息学分析
BlastX 分析表明, PsMnSOD 基因编码的氨
基酸序列与 Mn 超氧化物歧化酶匹配最佳。经过
ProtParam计算蛋白质的分子量为 26.1 kDa、理论
等电点值为 7.13。采用NCBI的BlastP在蛋白质保
守区数据库(conserved domain database, CDD)分析
表明, PsMnSOD 与 Sod_Fe_C、Sod_Fe_N 以及
SodA 匹配。从第 30 个氨基酸至第 227 个氨基酸
共 198 个氨基酸与 SodA 匹配最佳, 该区域与超氧
自由基转变为过氧化氢及分子氧、无机离子的运
输及代谢相关。在 Genbank 蛋白质数据库中选取
大豆(Glycine max, ABQ52658)、棉花(Gossypium
hirsutum, ABA00455)、藏边大黄(Rheum australe,
ABI35908)、荷花(Nelumbo nucifera, ABA10483)、
葡萄(Vitis vinifera, ABX79342)、小麦(Triticum
aestivum, AAX68501)、烟草(Nicotiana plum-
baginifol ia , P11796)、马蹄莲(Zantedeschia
aethiopica, AAC63379)、拟南芥(Arabidopsis tha-
liana, AAC24832)、小盐芥(Thellungiella halophila,
ABL75952)和白花柽柳(Tamarix androssowii,
AAS77885)等植物的 MnSOD 氨基酸序列与西伯
利亚蓼 PsMnSOD进行序列比对(图 2)。PsMnSOD
与藏边大黄锰超氧化物歧化酶匹配最佳, 一致性为
88%。PsMnSOD 与大豆、棉花、荷花、葡萄、
小麦、烟草、马蹄莲、拟南芥、小盐芥和白花
柽柳等植物 MnSOD 的一致性分别为 72%、75%、
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77%、75%、72%、80%、69%、74%、75%
和 77%。不同植物来源的 MnSOD 的多序列比对
结果表明, MnSOD C 端的保守性很高, 但 N 端的
保守性很低。N 端 13~39 氨基酸位置上的序列差
异最大, 可能与信号肽的剪切位点有关。在相似性
比较结果的基础上构建MnSOD基因的系统发育树
(图 3), 在比较的物种中, PsMnSOD 与藏边大黄
MnSOD 的亲缘关系最近。
图 2 西伯利亚蓼和其它 11 种植物 MnSOD 的氨基酸序列比对
Fig.2 Alignments of MnSOD amino acid sequnces between P. sibiricum and other 11 plants
* 代表保守的氨基酸。
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图 3 植物 MnSOD 氨基酸序列的分子进化树
Fig.3 Molecular phylogenic tree of the amino acid sequences of plant MnSOD
图 4 PsMnSOD 基因在酵母菌中的表达
对酵母菌 SOD 活性的影响
Fig.4 Effect of expresssion of PsMnSOD gene
on SOD activity in yeast strains
1: 野生型酵母菌株; 2: 转空载体菌株; 3: PsMnSOD 转化菌株。
3 PsMnSOD 基因在酵母中的表达对酵母 SOD 活
性的影响
以转化 pYES2 空载体的酵母菌株 W303-1A
(pYES2)和野生型酵母菌株 W303-1A 为对照测定
YPG 诱导培养的酵母菌株 W303-1A (pYES2-
PsMnSOD)的SOD活性的结果显示, 在非胁迫条件
下, PsMnSOD基因转化菌株的SOD活性高于转化
空载体的酵母菌株和野生型酵母菌株(图 4)。
表明, (1)在非胁迫条件下于 30 ℃生长时, 野生型
酵母菌株和转空载体菌株的生长量极为接近, 而
PsMnSOD转化菌株的生长量比野生型菌株(或转空
载体菌株)高 6% (图 5-C)。 (2)在 NaCl胁迫条件下,
野生型酵母菌株、转空载体菌株和PsMnSOD转化
菌株的生长均受到抑制, 野生型菌株和转空载体菌
株的生长量极为接近, 而PsMnSOD转化菌株在0.4
和 0.6 mol·L-1 NaCl 胁迫下的生长量比对照分别高
11% 和 17% (图 5-A)。表明PsMnSOD转化菌株抗
NaCl 胁迫的能力高于野生型菌株和转空载体菌
株。(3)在 PEG 胁迫条件下野生型酵母菌株和转空
载体菌株的生长量极为接近, 两者均受强烈地抑制,
而 PsMnSOD 转化菌株在 0.2 和 0.3 g·mL-1 PEG 胁
迫下的生长量比对照分别高 26%和 12% (图5-B)。
表明PsMnSOD基因在酵母中表达后酵母菌对PEG
的抗性提高。(4)在高温胁迫条件下, 野生型酵母菌
株、转空载体菌株和 PsMnSOD 转化菌株的生长
均受到抑制。在 40 ℃和 50 ℃胁迫下, 野生型菌
株和转空载体菌株的生长量极为接近, 而PsMnSOD
转化菌株的生长量比对照分别高26%和19% (图5-
C), 表明PsMnSOD转化菌株抗高温胁迫的能力高
于野生型酵母菌株和转空载体菌株。(5)在 4 ℃低
温胁迫条件下, 野生型酵母菌株和转空载体菌株的
生长明显受抑制, 而 PsMnSOD 转化菌株仍可长出
较多菌落(图5-D), 显示PsMnSOD基因在酵母中表
达后酵母菌株的抗寒性明显提高。
4 转入 PsMnSOD 基因后的酵母菌的抗逆性分析
对PsMnSOD转化菌株进行抗逆性分析的结果
植物生理学通讯 第 46 卷 第 7 期, 2010 年 7 月658
图 5 不同胁迫条件下野生型酵母菌株、PsMnSOD 转化菌株和转空载体菌株的生长
Fig.5 Growth of W303-1A, W303-1A (pYES2-PsMnSOD) and W303-1A (pYES2) under various stressed conditions
A: NaCl 胁迫; B: PEG 胁迫; C: 高温胁迫; D: 低温胁迫; 1: 野生型酵母菌株; 2: PsMnSOD 转化菌株; 3: 转空载体菌株。OD600 值
用平均数 ±s (n=3)表示。
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