全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 7期，2010年 7月724
麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析
苟春宝, 王勇, 喻川, 陈放, 魏炜 *
四川大学生命科学学院, 生物资源与生态环境教育部重点实验室, 成都 610064
提要: 根据麻疯树MIPS基因序列, 设计特异性的巢式引物, 运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5端侧翼序列, 序列
分析显示含有多个胁迫应答相关元件, 如ABRE、HSE等。以该序列为基础, PCR扩增得到 5个 5端不同长度的缺失片段,
分别插入 pBI221载体置换 CaMV 35S启动子, 构建的表达载体在 PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达, 检测
GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现, 分离到的MIPS基因侧翼序列 5端不同缺失片段都能启动GUS报
告基因表达, 启动活性最高的是WQ1区(−565 bp), 核心区位于 −565~−449 bp。在 100 μmol·L-1 ABA诱导下启动活性增强,
但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大, 比未处理时提高41.4%。
关键词: 麻疯树; MIPS基因; 启动子; 原生质体; 瞬时表达
Isolation of MIPS Gene Promoter from Jatropha curcas L. and Activity Analy-
sis of Transient Expression in Tobacco Protoplast
GOU Chun-Bao, WANG Yong, YU Chuan, CHEN Fang, WEI Wei*
Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu
610064, China
Abstract: Using nested primers specific for the sequences of Jatropha curcas MIPS gene, the MIPS gene 5-
flanking sequences were obtained by TAIL-PCR. Some stress response elements were found by sequence
analysis, such as ABA-responsive element (ABRE) and heat stress responsive element (HSE). Five different 5-
end deletion fragments of the MIPS gene 5-flanking sequences were amplified by PCR, and they were inserted
into the plant transient expression vector pBI221 to replace CaMV 35S promoter respectively. The expression
vectors were transferred into tobacco leaf protoplasts by PEG-mediated transient expression and the different
promoter activities were quantitatively estimated using GUS report gene. The results demonstrated that the
isolated 5-end different deletion fragments of MIPS gene could initiate GUS reporter gene expression in a
tobacco leaf protoplast transient expression system. The GUS activity of WQ1 area (−565 bp) was the highest
and the core area was located between −565 bp and −449 bp. The activity was increased by ABA (100 μmol·L-1)
treatment, but the increase in GUS activity of different segments was not the same. GUS activity was increased
by 41.4% in WQ1 area, when compared with the control.
Key words: Jatropha curcas; MIPS gene; promoter; protoplast; transient expression
收稿 2010-01-19 修定 　2010-06-18
资助 “十一五 ”科技支撑项目(2006BAD07A04)和四川省 “十
一五 ” 支撑项目(2007BAD50B00)。
* 通讯作者(E-mail : wwxfbxw@gmail. com; Tel : 02 8-
8 5 4 1 0 6 7 2 )。
肌醇 -1-磷酸合成酶(myo-inositol-1-phosphate
synthase, MIPS)可催化 6-磷酸葡萄糖转化为肌醇 -
1-磷酸, 是真核生物中肌醇生物合成的限速步骤
(Majumder等 1997)。肌醇作为一种重要的渗透保
护物质不仅是植物细胞中磷元素的主要贮存形式,
而且在信号转导、保护植物免受外部逆境伤害、
激素贮存与运输等方面都起到重要作用。麻疯树
MIPS基因(JcMIPS)与麻疯树在逆境胁迫处理下的
抗性相关, 其表达受到干旱、盐胁迫、低温以及
ABA诱导, 但对不同逆境胁迫的响应程度有所不同,
表明JcMIPS基因的表达有其特殊的调控机制(魏炜
等未发表资料)。至今已有 60多个来自不同物种
的MIPS同源基因序列得到了分离和鉴定(Majumder
等2003), 但对MIPS基因启动子结构与功能的研究
鲜有报道。因此, 分离 JcMIPS基因的启动子, 寻
找调控 JcMIPS基因表达的关键元件, 分析其对
JcMIPS基因表达的调控机制具有重要意义。
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期，2010年 7月 725
本文根据 JcMIPS基因序列(GenBank登录号
EF185781), 设计特异性的巢式引物, 与5个随机兼
并引物组合, 采用 TAIL-PCR法两次步移获得了
JcMIPS基因的启动子序列。以此全长序列为基
础, PCR扩增得到 5个 5端不同缺失片段, 再分别
插入 pBI221载体置换其原有的花椰菜花叶病毒
(cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S启动子, 在
PEG介导下将重组表达载体转入烟草叶片原生质
体中瞬时表达, 检测GUS报告基因的活性, 从而验
证 JcMIPS启动子活性, 分析该启动子的核心功能
元件, 了解 JcMIPS基因抗性调节的相关机理。
材料与方法
麻疯树(Jatropha curcas L.)种子(采自四川省西
昌地区)在含蛭石的营养钵中培养, 待长出真叶后用
于DNA提取。烟草(Nicotiana tabacum, 品系为
NC98)无菌苗由本实验室保存并繁殖。表达载体
pBI221及大肠杆菌TOP10菌株, 由本实验室保存。
pMD19-T载体、内切酶 PstI和 XbaI、T4连接酶、
Taq DNA聚合酶及相应的反应缓冲液、dNTPs均
购于日本TaKaRa (中国大连)公司; DNA凝胶回收
试剂盒购自北京 TIANGEN生物公司。
根据 JcMIPS序列, 在开放阅读框内靠近ATG
处设计 3个特异性的巢式引物 JcSP1、JcSP2和
JcSP3, 再参照 Liu等(1995, 1998)方法设计 5个随
机简并引物AD1~AD5 (表 1)。用 CTAB法提取麻
疯树叶片基因组DNA作为模板, 3个特异性巢式引
物与 5个随机简并引物组合进行 TAIL-PCR扩增,
反应程序见表 2。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产
物大小。TAIL-PCR扩增获得的特异片段用DNA
凝胶回收试剂盒回收后, 与pMD19-T载体连接, 转
化大肠杆菌TOP10感受态细胞, 涂铺于LB (Amp+)
平板。菌落 PCR鉴定的阳性克隆送 Invitrogen (上
海)公司测序。根据测序所得序列, 在其 5端再设
计 3个特异性的巢式引物 JS1、JS2和 JS3, 与 5个
随机简并引物AD1~AD5组合, 以麻疯树叶片基因
组DNA为模板, 进行 TAIL-PCR扩增。扩增产物
的电泳检测、胶回收及测序同上所述。将两次步
移获得的序列进行拼接, 得到 JcMIPS启动子全长
序列。使用 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.
ugent.be/webtools/plantcare/html/)工具, 在线分析
JcMIPS启动子序列特征。
以 JcMIPS启动子全长序列为基础, 设计不同
的上游引物(有PstI酶切位点), 与下游引物(有XbaI
酶切位点)组合, 以麻疯树叶片基因组DNA为模板,
PCR扩增 JcMIPS启动子 5端不同的缺失片段:
WQ1、QS1、QS2、QS3、WQ2。PCR反应程
序为: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 min
(循环 30次); 72 ℃ 5 min。扩增产物的电泳检测、
胶回收及测序同上所述。
用限制性内切酶PstI和XbaI分别双酶切载体
pBI221和 JcMIPS启动子5端不同的缺失片段。胶
回收pBI221载体大片段和JcMIPS启动子5端不同
的缺失片段, 用 T4连接酶连接后转化大肠杆菌
TOP10感受态细胞, 涂铺于 LB (Amp+)平板。菌
落 PCR鉴定阳性克隆, 提取质粒进行双酶切鉴定,
以获得 5 个重组表达载体: pBWQ1、pBQS1、
pBQS2、pBQS3、pBWQ2。这样就将 pBI221上
的 CaMV 35S启动子替换为 JcMIPS启动子, 以分
析其驱动 GUS报告基因表达的活性。
烟草叶片原生质体的制备参照文献(Negrutiu
等 1987; 印莉萍和祁小廷 2005)。酶解液的组成
为: 1% (W/V)纤维素酶 R-10、0.5% (W/V)离析酶
R-10、10 mmol·L-1 CaCl2·2H2O、0.7 mmol·L-1
NaH2PO4·2H2O、0.5 mol·L-1甘露醇、5 mmol·L-1
无水吗啉乙磺酸(MES), 用 1 mol·L-1 KOH调 pH至
表 1 PCR反应所用到的引物
Table 1 Primers for PCR reactions
引物 序列
JcSP1 5 TAACCCCAGCGGTGAGAGTAGAAC 3
JcSP2 5 TACATGGATATCAGTCCTAAATTCG 3
JcSP3 5 CACAGAGTGAATCTCATCATCCG 3
JS1 5 GTAGTGGAAATGTTGGTGACAGTGA 3
JS2 5 GAGGGTGAAATGATTGACTGAGGA 3
JS3 5 GCGAGTAAAGGTGCGTGGAATA 3
AD1 5 NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT 3
AD2 5 NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA 3
AD3 5 (A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA 3
AD4 5 TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA 3
AD5 5 AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG 3
WQ1F 5 AACTGCAGTTACCCTCGTCGTGGAT 3
QS1F 5 AACTGCAGCATTTCACCCTCTCCA 3
QS2F 5 AACTGCAGCAATCAAAACAAAAC 3
QS3F 5 AACTGCAGCCTACCTATTTTACAC 3
WQ2F 5 AACTGCAGCAAAGTGTGTGGCAAA 3
R 5 GCTCTAGATTTTCTTTAAAATGCGA 3
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期，2010年 7月726
5.6。原生质体计数参考侯岁稳和贾敬芬(2002)的
方法。用荧光素双醋酸盐(FDA)对原生质体染色,
鉴别其活力。
质粒 pBI221 (阳性对照)、5个重组质粒在
40% (W/V) PEG4000介导下转入烟草叶片原生质
体, 转化过程及转化后原生质体的悬浮培养参照文
献(Negrutiu等 1987; 印莉萍和祁小廷 2005)进行。
需ABA处理的原生质体, 待转化后原生质体预培养
2 h, 再加入ABA (终浓度为100 μmol·L-1)诱导培养过
夜。参照印莉萍和祁小廷(2005)方法回收培养过夜
的原生质体, 提取GUS粗酶液进行荧光定量检测。
用 Bradford法测定粗酶提取液蛋白含量。以 pmol
(4-MU)·mg-1 (蛋白)·min-1为单位计算酶活性。
实验结果
1 麻疯树总DNA的质量分析
经测定, CTAB法提取的麻疯树叶片总DNA,
OD260/OD280接近1.8, 说明提取的麻疯树总DNA质
量好, 可作为 PCR模板。
2 TAIL-PCR法扩增JcMIPS启动子序列
第1次步移进行3轮PCR扩增后, JcSP3与AD2
引物组合三扩有较亮的条带(图1), 回收并测序后获
得长 566 bp的序列。第 2次步移, JS3与AD5引
物组合三扩有较亮的条带(图2), 回收并测序后获得
长 792 bp的序列。
3 JcMIPS启动子全长序列的获得与分析
将两次步移获得的序列拼接后(去除中间重叠
部分), 获得了翻译起始密码子ATG (将ATG中的
A定义为 +1位)上游 1 265 bp的 JcMIPS 启动子序
列(图 3 )。使用 P l a n t C A R E 在线分析( h t t p : / /
bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/
html/), 观测到JcMIPS启动子包含核心启动子元件
(core promoter element)及特异顺式作用元件。通
过网站(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.
html)在线分析, 推测位于 −136 bp处的腺嘌呤A为
JcMIPS 启动子转录起始位点。研究表明, 高等植
物的启动子具有一些保守的功能元件(例如TATA-
表 2 克隆 JcMIPS基因启动子序列的 TAIL-PCR反应参数
Table 2 The parameters of TAIL-PCR used to amplify the promoter of JcMIPS gene
反应 程序编码 循环数 参数
第 1次 1 1 92 ℃, 3 min; 95 ℃, 1 min
2 5 94 ℃, 30 s; 62 ℃, 1 min; 72 ℃, 2 min
3 1 94 ℃, 30 s; 25 ℃, 3 min; 在 3 min内升到 72 ℃; 72 ℃, 2 min
4 1 5 94 ℃, 30 s; 62 ℃, 1 min; 72 ℃, 2 min; 94 ℃, 30 s; 62 ℃, 1 min; 72 ℃,
2 min; 94 ℃, 30 s; 44 ℃, 1 min; 72 ℃, 2 min
5 1 72 ℃, 5 min
第 2和第 3次 6 1 95 ℃, 5 min
7 1 2 94 ℃, 30 s; 60 ℃, 1 min; 72 ℃, 2 min; 94 ℃, 30 s; 60 ℃, 1 min; 72 ℃,
2 min; 94 ℃, 30 s; 44 ℃, 1 min; 72 ℃, 2 min
5 1 72 ℃, 5 min
图 1 第 1次步移 TAIL-PCR扩增结果
Fig.1 Amplification results of the first walking TAIL-PCR
图 2 第 2次步移 TAIL-PCR扩增结果
Fig.2 Amplification results of the second walking TAIL-PCR
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期，2010年 7月 727
box和 CAAT-box), 能够调控基因的转录。TATA-
box与双链的解链有关, 是RNA聚合酶转录起始的
必要条件。在 JcMIPS启动子中位于翻译起始位点
ATG上游−166~−160 bp处, 找到了具有典型TATA-
box特点的序列结构(TATA[A/T]A[A/T])。另一个
在真核生物中常见的保守元件 CAAT-box与 RNA
聚合酶的结合有关, 主要控制着转录起始的频率, 其
保守序列为GC[C/T]CAATCT。在 JcMIPS启动子
中 −217~−214 bp处存在类似结构, 且这两个保守
盒之间的距离为 40~80 bp, 比较符合文献报道(李
杰等 2006)中两者的通常距离。此外, 该序列还存
在多个胁迫应答元件(表 3), 如与ABA诱导相关的
元件(ABA-responsive element, ABRE)、热激应答
元件(heat stress responsive element, HSE)、MYB
结合位点(MYB binding site, MBS)、光信号应答元
件G-box和 Sp1、发育相关元件GCN4_motif (胚
乳)和 CAT-box (分生组织)。魏炜等(未发表资料)
研究表明, JcMIPS基因的表达受到干旱、盐胁
迫、低温以及ABA诱导, 且对不同逆境胁迫的响
应程度有所不同。这些胁迫应答元件的存在, 与
JcMIPS基因应答于多种胁迫的特点相一致, 表明本
文克隆的JcMIPS启动子可能是一个与逆境胁迫相
图 3 JcMIPS的启动子序列
Fig.3 Nucleotide sequences of JcMIPS promoter
J cMIPS 启动子的顺式调控元件用下划线表示; CAAT 盒、T AT A 盒、翻译起始位点用阴影显示; 转录起始位点加框显示。
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期，2010年 7月728
关的启动子。
4 JcMIPS启动子 5端不同缺失片段的扩增
通过PCR成功扩增了5个JcMIPS启动子不同
长度的 5端缺失片段(图 4): WQ1 (−565 bp)、QS1
(−449 bp)、QS2 (−685 bp)、QS3 (−814 bp)和
WQ2 (−1 265 bp)。5个缺失片段分别回收后, 测
序结果表明它们都是 JcMIPS启动子全长的一部
分。
5 JcMIPS启动子驱动GUS表达的瞬时表达载体
构建
重组质粒通过PCR (图5)及双酶切鉴定(图6),
表明瞬时表达载体构建成功。
6 烟草叶片原生质体的制备与活性分析
显微镜下观察制备的烟草叶片原生质体及其
FDA活性染色的结果见图 7。原生质体因细胞壁
酶解后, 呈圆球形, 边缘部分有绿色的叶绿体, 中间
表 3 JcMIPS启动子的顺式作用元件
Table 3 cis-Elements in the JcMIPS promoter
功能 保守元件 位点
ABA应答元件 YACGTG −282~−277, −268~−263, −173~−168
光调控应答元件 ACGTG −282~−277, −268~−263, −175~−167, −173~−168
CCRCCC −613~−604
MYB结合位点 TAACTG −769~−764
热激应答元件 AAAAAATTTC −652~−643, −436~−426
发育相关元件(胚乳、分生组织) CAAGCCA −325~−319
GCCACT −305~−300
AT 富集区 TAAAATACT −344~−352
　　Y=C/T; R=A/G。
图 6 重组质粒的双酶切鉴定
Fig.6 Double restriction enzyme digestion
of the recombinant plasmid
图 5 质粒的 PCR验证
Fig.5 PCR validation of plasmid
图 4 JcMIPS启动子 5端不同缺失片段
Fig.4 5-end different deletion fragments of the JcMIPS promoter
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期，2010年 7月 729
透明部分为大液泡, 其余杂质主要是破碎的原生质
体和降解的细胞壁和胞间组织。FDA染色结果表
明, 90%以上的原生质体有活性, 可将穿过原生质
膜进入原生质体的FDA分解产生荧光素, 在倒置荧
光显微镜下原生质体发出绿色荧光。
7 GUS活性荧光定量检测
GUS活性荧光定量检测结果(图8)表明, JcMIPS
启动子在烟草叶片原生质体中能启动GUS报告基
因表达, 但启动子各区段的活性不同。QS1区活性
较强, WQ1区活性最强, 比正对照pBI221的CaMV
35S启动子高出 19.2%; QS2区、QS3区、WQ2
区 3个区段活性差异不显著。用100 μmol·L-1 ABA
处理后, JcMIPS启动子活性增强, 但不同区段的增
长幅度不同。WQ1区增长幅度最大, 比未处理时
增高 41.4%。正对照 pBI221的 CaMV 35S启动子
活性在ABA处理后没有显著差异。
从 JcMIPS启动子的序列特征来看, 由于主要
的胁迫应答元件均存在于WQ1区附近, 距离转录
起始位点A和翻译起始密码子ATG较近, 对基因的
表达调控起关键作用, 故这个区段的活性最强; 随
着 5端序列的延伸, 活性不断降低, 可能是由于存
在减弱转录的负调控元件引起的。JcMIPS启动子
各区段都存在的ABRE元件可以积极应答ABA的诱
导, 从而提高了GUS报告基因的表达水平。
讨　　论
植物基因启动子的克隆通常有两条途径(尹辉
等2006): 一是构建基因组文库, 通过杂交来筛选目
的启动子; 二是通过接头连接 PCR或反向 PCR扩
增目的启动子。但这两种方法都比较复杂, 使用
TAIL-PCR方法具有简便、快速、高效、特异性
强等特点, 通常可以扩增到 0.2~2 kb的片段(Liu和
Huang 1998)。
植物原生质体的遗传转化研究在20世纪80年
代以后才逐渐开展起来, 最常见的是PEG介导转化
法。这种方法不需特殊设备, 操作简便易行, 便于
采用。本文中用 40% (W/V) PEG4000介导瞬时表
达载体转化烟草叶片原生质体。在加入 PEG时,
应从管底缓慢加入, 然后立即轻柔混匀, 避免原生
质体结团, 从而获得较高的转化效率。
影响瞬时表达的因素有宿主细胞的类型、生
理状态、所用报告基因的种类等。烟草叶片原生
质体作为瞬时表达的良好受体材料, 已经得到广泛
图 7 烟草叶片原生质体(A)及其 FDA染色(B)
Fig.7 The protoplasts from tobacco leaves (A) and FDA staining (B)
图 8 GUS活性的荧光定量检测
Fig.8 Fluorescence quantitative detection of GUS activity
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期，2010年 7月730
应用。GUS报告基因在高等植物中特别有用, 因
为在大多数种类的植物中都不含内源性的GUS活
性, 且检测方法方便、灵敏。本文中采用荧光分
析法检测GUS活性, 从而分析 JcMIPS启动子的活
性。由于瞬时表达有一定的随机性, 本文的结论是
几个独立转化实验数据的综合分析。
由于启动子存在不同的顺式作用元件, 因而其
调控方式不同: 有的是组织特异型启动子, 如种子
特异性启动子中存在 B-box元件、RY重复序列
(Ellerstrom等 1996; Ezcurra等 1999; Kao等 1996);
有的是诱导型启动子, 如热诱导表达启动子中存在
HSE元件(Rrandl和Schoffl 1996), 生长素诱导的启
动子含有 G 盒结构或 TGA (Hex)盒(Nagao等
1993)。通过对 JcMIPS启动子的序列进行分析, 我
们找到了多个胁迫应答元件, 并结合已知的JcMIPS
基因自身的表达特点, 推断所分离的 JcMIPS启动
子是一种胁迫诱导型启动子。烟草原生质体中的
瞬时表达证明JcMIPS启动子可驱动GUS报告基因
表达, 且在ABA诱导下其活性增强。在启动子的
序列中, 一般核心区对基因的表达调控起关键作
用。通过对 JcMIPS启动子 5端不同缺失片段驱
动报告基因表达的活性分析, 我们发现各区段的活
性不同, 并找到了其核心区位于−565~−449 bp。在
后续实验中, 还将通过农杆菌介导的拟南芥转化技
术, 进行稳定表达以进一步确定 JcMIPS启动子的
特性。
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