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过表达番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因提高烟草抗MV诱导的氧化胁迫能力



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (7): 689~698 689
收稿 2012-03-12  修定 2012-04-07
资助 国家重点基础研究发展计划(2009CB118505)、国家自然
科学基金(31071338和31171474)和作物生物学国家重点实
验室开放课题基金(2011KF08)。
* 通讯作者(E-mail: qwmeng@sdau.edu.cn; Tel: 0538-
8249606)。
过表达番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因提高烟草抗MV诱导的氧化胁迫能力
王丽燕1,2, 王玉1, 孟夏1, 孟庆伟1,*
1山东农业大学生命科学学院, 山东泰安271018; 2德州学院生物系, 山东德州253023
摘要: 为了探讨番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶对烟草抗坏血酸(AsA)含量及抗氧化能力的影响, 从番茄叶片中分离了GDP-L-半
乳糖磷酸酶基因(LeGGP), 并转入到烟草中。以野生型(WT)和转正义LeGGP烟草株系T1-3和T1-15为试材, 测定了甲基紫精
(MV)处理下AsA、脱氢抗坏血酸(DHA)、H2O2、O2¯·和叶绿素含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、光合速率和叶绿素
荧光参数等。Northern杂交分析表明LeGGP的表达受MV的诱导, 在MV处理下, 野生型烟草的离体叶圆片发生比转基因烟
草更严重的光漂白, 转基因烟草的AsA含量及清除H2O2和O2¯·的能力明显强于野生型, 过表达LeGGP提高了烟草的生长量。
并且转基因烟草比野生型具有更高的净光合效率(Pn)和光系统II (PSII)最大光化学效率(Fv/Fm)。结果表明, LeGGP的过表
达有助于提高烟草AsA含量及抗氧化胁迫能力。
关键词: 烟草; 番茄; 氧化胁迫; LeGGP; 转基因植株
Overexpression of Tomato GDP-L-Galactose Phosphorylase Gene Enhanced
Tolerance of Transgenic Tobacco to Methyl Viologen-Mediated Oxidative
Stress
WANG Li-Yan1,2, WANG Yu1, MENG Xia1, MENG Qing-Wei1,*
1College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018, China; 2Department of Biology, Dezhou
University, Dezhou, Shandong 253023, China
Abstract: In order to investigate the effect of tomato GDP-L-galactose phosphorylase (GGP) on ascorbate
(AsA) content of transgenic tobacco and tolerance to oxidative stress, tomato GDP-L-galactose phosphorylase
gene (LeGGP) was introduced into tobacco. WT, sense-transgenic lines T1-3 and T1-15 of tobacco were used to
measure the contents of AsA, dehydroascorbate (DHA), hydrogen peroxide (H2O2), O2¯·, and chlorophyll, activity
of ascorbate peroxidase (APX), photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence parameters under methyl viol-
ogen (MV) treatment. Northern blot analysis confirmed that the expression of LeGGP was induced by MV. The
content of AsA, the capability for scavenging H2O2 and O2¯· of the transgenic tobacco plants were distinctly high-
er than those of WT under MV treatment. Overexpression of LeGGP in tobacco improved growth of seedlings.
Under MV treatment, more serious bleaching was observed in the leave of WT plants. The net photosynthetic
rate (Pn) and the maximal photochemistry efficiency of PSII (Fv/Fm) in the transgenic plants were higher than
those of WT. These results indicated that overexpression of LeGGP increased AsA content and enhanced toler-
ance of transgenic tobacco plants to MV-induced oxidative stress.
Key words: tobacco; tomato; oxidative stress; LeGGP; transgenic line
植物在正常代谢过程中不可避免地会产生活
性氧(reactive oxygen species, ROS) (Noctor和Foyer
1998), 一定水平的ROS是植物正常生理活动所必
需的, 但ROS生成过多会造成细胞损伤, 引起植物
衰老和死亡。干旱、高温、冷害、涝害、臭氧等
各种逆境胁迫会引起植物体内ROS大量积累, 植物
可以通过酶促和非酶促两种方式清除活性氧, 非
酶促方式包括一些低分子量的抗氧化物质, 如抗坏
血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)、α-生育酚(VE)、类黄
酮等。其中, AsA是植物体最主要的抗氧化物质。
抗坏血酸可以直接清除植物体内包括单线态
氧、超氧阴离子自由基及羟基自由基在内的活性
植物生理学报690
氧(Padh 1990)。同时, 抗坏血酸还能维持另一重要
抗氧化剂——维生素E的还原态, 并通过抗坏血酸-
谷胱甘肽循环清除H2O2, 从而保护植物有机体及
其正常代谢免于氧化胁迫造成的伤害。抗坏血酸
还在植物细胞分裂(Tabata等2001)、细胞壁代谢
(Smirnoff 1996)、细胞膨大及光合作用和光保护
(Yabuta等2007)等过程中起着重要作用。除此之
外, AsA对调控一些基因的表达具有重要作用(Pas-
tori等2003)。
目前已知的植物抗坏血酸合成主要包括4条
途径, 即甘露糖/L-半乳糖途径、半乳糖醛酸途
径、古洛糖途径及肌醇途径, 其中甘露糖/L-半乳
糖途径(又称为Smirnoff/Wheeler途径)是植物中抗
坏血酸合成的主要途径。甘露糖/L-半乳糖途径从
D-6-磷酸葡萄糖开始 , 经由GDP-甘露糖(GDP-
Man)、GDP-L-半乳糖(GDP-L-Gal)、L-半乳糖-1-
磷酸(L-Gal-1-P)、L-半乳糖(L-Gal)和L-半乳
糖-1,4-内酯(L-galactone-1,4-lactone), 最终转化为
抗坏血酸(AsA) (Wheeler等1998)。GDP-L-半乳糖
磷酸酶(GGP)一直是甘露糖/L-半乳糖途径中的未
知酶, 直到2007年, Linster等的研究才证实拟南芥
VTC2及VTC5编码这个未知酶(Linster等2007), 催
化GDP-L-半乳糖转化成L-半乳糖-1-磷酸(Linster
等2008)。
目前, 人们对GGP的研究主要集中在GGP是
否是AsA合成过程中的关键酶。光照是影响植物
抗坏血酸合成的重要因素(Barth等2006; Smirnoff
2000), 强光处理下拟南芥VTC2表达量增加与
GDP-L-Gal磷酸酶活性升高的一致性, 预示着GGP
在抗坏血酸合成中可能具有重要作用(Dowdle等
2007)。抑制L-Gal脱氢酶活性可以导致L-Gal的积
累 , 同时强光照射可以进一步诱导L-Gal积累
(Gatzek等2002), 而Dowdle等(2007)的研究结果显
示, 强光处理条件下D-甘露糖抗坏血酸合成途径
中仅有GGP及L-Gal脱氢酶活性显著升高, 因此认
为GGP可能是导致L-Gal积累的原因。茉莉酸甲酯
可以提高抗坏血酸含量, 与此同时拟南芥VTC2和
VTC5的表达量也明显升高(Sasaki-Sekimoto等
2005; Wolucka和Van Montagu 2003)。VTC5可以补
偿vtc2-1中VTC2的缺失, 从而有效维持AsA的含量
(Gao等2011), 除非提供外源的AsA或L-Gal (AsA合
成的前体), 否则VTC2及VTC5双突变体不能正常
生长(Dowdle等2007)。以上结果表明GDP-L-半乳
糖磷酸酶可能是拟南芥抗坏血酸合成的关键酶。
目前对番茄GGP的研究较少, 过表达GGP可
以提高番茄果实抗坏血酸含量(Bulley等2012)。
Gilbert等(2009)利用RNAi的方法抑制番茄抗坏血
酸合成过程中GME (GDP-甘露糖-3,5-差向异构酶)
的活性, 明显促进了GGP的活性, 因此认为GGP在
番茄抗坏血酸合成过程中可能具有重要作用。逆
境条件下番茄GGP的表达情况如何?番茄GGP基
因的过表达是否可以有效地提高植物抗非生物胁
迫的能力?这些问题都有待于进一步探讨。本研
究从番茄叶片中克隆了GDP-L-半乳糖磷酸酶基因
(LeGGP), 并转化到烟草中, 以甲基紫精(MV)模拟
氧化胁迫, 探讨过表达LeGGP烟草的抗氧化能力。
材料与方法
1 植物材料的处理
以番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) ‘中蔬6
号’和烟草(Nicotiana tabacum L.) ‘NC89’为试材。
种子浸种催芽生根后分别播于塑料盆中, 以蛭石
作基质, Hoagland营养液培养, 放置于温室[温度
(25±4) ℃, 光照强度约850 μmol·m-2·s-1, 相对湿度
80%左右]中生长。生长8周的番茄及转基因烟草
叶片表面喷以100 μmol·L-1 MV, 保持持续光照, 取
样后液氮冷冻, 保存于-80 ℃备用。
2 测定项目与测定方法
2.1 番茄GGP基因的克隆、表达载体的构建及对
烟草的遗传转化
根据已知的其他植物GGP基因及预测的番茄
GGP基因(SGN-U312646)序列(Dowdle等2007), 设
计分别带有BamHI酶切位点引物G1 (5′GGATCCT-
TCCGACCTCCTCTTCCTT3′)及带有SacI酶切位
点引物G2 (5′GAGCTCATGAACACCAGAGCTG-
GG3′)。利用RT-PCR扩增番茄GGP基因全长, PCR
条件是: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 60 s, 53 ℃ 60 s, 72 ℃
90 s, 35个循环; 72 ℃ 10 min。切胶回收PCR目的
片段, 与pMD18-T-simple载体在16 ℃过夜连接, 将
连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 菌
液PCR筛选阳性克隆, 送上海生工生物工程有限公
司进行测序, 用DNAman软件对测序结果进行分
王丽燕等: 过表达番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因提高烟草抗MV诱导的氧化胁迫能力 691
析。分别利用BamHI和SacI对PBI121 (经本实验室
改造带有BamHI和SacI酶切位点)载体和pMD18-T-
simple载体上的LeGGP基因进行双酶切, 回收目的
片段, 连接构建成PBI121-LeGGP载体(图1), 并转
化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 经酶切和测序
标准误表示。
2.6 电解质外渗量、H2O2和O2¯·含量测定
膜透性参照Sun等(2010)的方法测定, 用电解
质外渗量表示。超氧阴离子自由基含量参照王爱
国和罗广华(1990)的方法。H2O2含量的测定参照
Ferguson等(1983)的方法。每处理重复3次, 结果以
平均值±标准误表示。
2.7 野生型和转基因烟草叶片AsA含量测定
AsA含量测定参照Kampfenkel等(1995)的方
法。0.5 g叶片加入2 mL 6% TCA研磨成匀浆, 4 ℃,
13 000×g离心5 min, 上清液即用于AsA和氧化型抗
坏血酸(DHA)的测定。AsA反应液包括0.2 mL提
取液(空白以6% TCA代替)、0.6 mL 0.2 mol·L-1
PBS (pH 7.4)、0.2 mL ddH2O、1 mL 6% TCA、0.8 mL
42% H3PO4、0.8 mL 4% 2,2’-二联吡啶和0.4 mL
3% FeCl3。总AsA (AsA+DHA)的测定以0.2 mL 10
mmol·L-1 DTT和0.4 mL 0.2 mol·L-1 PBS (pH 7.4)代
替以上0.6 mL 0.2 mol·L-1 PBS。反应液42 ℃温浴1 h,
测定525 nm吸光值。DHA含量为总AsA含量与未
加DTT时所测得AsA含量的差值。每处理重复3
次, 结果以平均值±标准误表示。
2.8 APX活性测定
APX活性测定参照Mishra等(1993)的方法, 以
每分钟氧化1 μmol AsA的酶量为一个酶活单位。每
处理重复3次, 结果以平均值±标准误表示。
2.9 光合气体交换参数的测定
采用英国PP Systems公司生产的CIRAS-2便
携式光合作用系统测定净光合速率(Pn), 测定时光
照强度为800 μmol·m-2·s-1, 叶温25 ℃, 氧气含量
21%, CO2浓度360 μL·L
-1。每处理重复3次, 每重复
2.2 Northern杂交分析
番茄总RNA的提取采用Trizol (Invitrogen)抽
提法, 具体步骤按照天根RNA提取试剂盒说明书
进行。RNA (20 μg)用甲醛变性凝胶电泳分离, 电
泳完毕后将RNA转移至尼龙膜上, 交联固定RNA。
以LeGGP基因3′端为探针(用α[32P]dATP标记)进行
Northern杂交(42 ℃, 36 h)。洗膜2次后于−70 ℃下
放射自显影, 观察杂交结果。
2.3 转基因烟草检测
取T1代烟草相同叶位叶片, 用CTAB微量法提
取转基因烟草叶片中的总DNA, 以此为模板, 进行
PCR检测。烟草叶片总RNA的提取方法同上, 反
转录后进行RT-PCR。
2.4 烟草幼苗生长实验
选取T1代种子在含Kan抗生素的MS培养基上
培养2周, 然后将幼苗转移到含不同浓度MV (5、
10 μmol·L-1)的MS培养基上, 光照培养箱内[12 h光
照, 12 h黑暗, 光照强度200 μmol·m-2·s-1, 温度(25±3)
℃]培养10 d, 拍照记录生长状况。
2.5 转基因烟草叶圆片抗氧化能力和叶绿素含量
的测定
取烟草的同一叶位叶片用于试验。打取叶圆片,
置于含50、100 μmol·L-1 MV (含有0.1% Tween20)
的溶液中, 抽真空30 s, 连续光照(250 μmol·m-2·s-1)
24 h, 观察叶圆片颜色变化并拍照。叶绿素含量测
定参照Hemavathi等(2010)的方法, 将MV处理后的
叶圆片放入盛有10 mL 80%丙酮的试管中, 室温避
光放置8~10 h, 至叶片颜色完全褪去, 用紫外分光
光度计测定663 nm和645 nm的光吸收值, 计算叶
绿素a和b的总量。每处理重复3次, 结果以平均值±
验证后, 用冷冻法转化导入农杆菌LBA4404感受
态中。以‘NC89’烟草叶片作为转化材料, 用农杆
菌介导的叶盘法进行转化, 浸染后的愈伤组织经
卡那霉素筛选 , 挑选新生抗性愈伤组织进行分
化、生根、炼苗, 最后移栽到花盆中培养。
图1 表达载体构建
Fig.1 Construction of expression vectors
植物生理学报692
测定5株, 结果以平均值±标准误表示。
2.10 叶绿素荧光参数测定
叶绿素荧光参数采用Hansatech公司生产的脉
冲调制式便携荧光仪FMS2测定。处理过程中Fv/Fm
在暗中适应15 min后测定。Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm, 其
中, Fo为初始荧光, Fm为最大荧光。每处理重复3次,
每重复测定5株, 结果以平均值±标准误表示。
实验结果
1 LeGGP基因及其编码蛋白序列分析
由测序结果可知, 我们获得的GGP基因cDNA
全长为1 495 bp, 在第153个核苷酸处为起始密码
子ATG, 在1 464个核苷酸处为终止密码子TGA。其
编码区为1 314 bp, 由此推断该蛋白应包含437个
氨基酸残基。利用DNAman软件将该基因编码的
氨基酸序列与GenBank中其他植物氨基酸序列进
行比对, 结果显示番茄的GDP-L-半乳糖磷酸酶与
马铃薯(JN000934)、猕猴桃、柑橘、蓖麻、拟南
芥以及烟草等植物的GDP-L-半乳糖磷酸酶高度同
源(图2), DNAman软件聚类分析结果显示, 这些植
物的GGP与LeGGP同源性分别为97.49%、74.06%、
72.15%、66.82%、71.30%和59.82%。如图2所示,
所比对植物的氨基酸序列中具有一个保守的
HxHxQ基序(其中X代表疏水氨基酸), 即组氨酸三
联体HIT (histidine triad), 这是GDP-L-半乳糖磷酸
酶家族的共同特征(Brenner 2002)。酵母四磷酸二
腺苷磷酸酶可以催化四磷酸二腺苷转化成ATP和
ADP, 也具有典型的保守HxHxQ基序(Plateau等
1989)。以上结果表明我们已经成功地克隆到了
GDP-L-半乳糖磷酸酶基因的序列, 将该基因命名为
LeGGP, 并在GenBank中注册, 注册号为JQ517313。
2 MV诱导番茄LeGGP的表达
如图3所示, Northern杂交分析表明, 100 μmol·L-1
MV处理条件下番茄LeGGP的表达量随着处理时
间的延长而升高, 在处理12 h时达到最高, 此结果
表明番茄LeGGP的表达受MV诱导。
图2 LeGGP推演的氨基酸序列与其他植物GGP的氨基酸序列比对
Fig.2 Alignments of the deduced amino acid sequence of LeGGP and other GGP
王丽燕等: 过表达番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因提高烟草抗MV诱导的氧化胁迫能力 693
3 转LeGGP烟草的获得及表达分析
LeGGP转化烟草获得了大量的抗卡那霉素转
基因植株, 为了检测转基因是否成功, 利用PCR检
测抗性植株, 得到1 400 bp左右的产物(图4-A), 但
野生型中未出现目的条带。T1代植株与野生型无
可见的表型差异, 在T1代中随机选择3个转基因株
系(T1-1、T1-3和T1-15)进行半定量PCR检测, 结果
表明, 番茄LeGGP在烟草中过表达(图4-B), 选取
T1-3和T1-15两个株系进行生理功能研究。
含MV的MS培养基上, 随着MV浓度的升高, 野生
型植株生长受到明显抑制, 叶片出现明显的光漂
白现象(图5), 但转基因植株的生长变化不明显, 10
µmol·L-1 MV处理后仅表现出轻微的光漂白。在25
℃连续光照条件下, 用不同浓度MV (0、50、100
µmol·L-1)处理野生型和转基因烟草叶圆片24 h, 对
照处理的所有叶圆片维持绿色, 并且野生型和转
基因植株的叶绿素含量差别不显著(P>0.05)。MV
处理24 h后, 所有叶圆片表现出不同程度的失绿,
MV浓度越高 , 失绿越严重 (图6-A、B) , 但转
LeGGP烟草叶圆片失绿程度较轻, 且100 µmol·L-1
图3 MV处理下LeGGP在番茄叶片中的表达
Fig.3 The expression of LeGGP in tomato leaves under MV
(100 µmol·L-1) treatment
图4 转基因烟草的PCR验证
Fig.4 Identification of transgenic tobacco plants
A: PCR 测定结果; M: Marker; WT: 野生型烟草; 1~6: 转基因
烟草。B: RT-PCR测定结果; WT: 野生型; 1~3: 不同的转基因株系
T1-1、T1-3和T1-15。
图5 MV处理对烟草幼苗生长的影响
Fig.5 The growth of transgenic tobacco plant and WT under
MV treatment
图6 MV处理下烟草叶圆片的失绿状况(A)和叶绿素含量(B)的变化
Fig.6 Changes of leaf disc bleaching (A) and chlorophyll content (B) in tobacco leaves under MV treatment
*表示相同处理浓度或时间不同植株间差异显著(P<0.05), **表示相同处理浓度或时间不同植株间差异极显著(P<0.01), 下图同。
4 LeGGP过表达提高了烟草抗氧化能力
转基因株系的种子经卡那霉素筛选后转移到
植物生理学报694
MV处理后叶绿素含量明显高于野生型(P<0.05)。
以上结果表明LeGGP过表达提高了烟草抵抗MV
诱导的氧化胁迫能力。
5 MV处理下H2O2、O2¯·及相对电导率的变化
用100 μmol·L-1 MV喷施野生型和转基因烟草
植株, 持续光照24 h (光强为200 µmol·m-2·s-1)。处
理前野生型和转基因植株H2O2含量无明显差别,
随着MV处理时间的延长, 所有植株中H2O2的含量
均增加, 而转正义基因植株的增加较少(图7-A)。
O2¯·及相对电导率的变化表现出同样的趋势, 即随
着MV处理时间的延长, 叶片O2¯·含量及相对电导率
升高, 且野生型植株高于转基因植株, MV处理24 h
后转基因株系的O2¯·含量及相对电导率都明显低于
野生型(P<0.05) (图7-B、C)。
6 MV处理下烟草抗坏血酸含量及APX活性的变化
MV处理后, 野生型和转基因植株还原型AsA、
DHA及总抗坏血酸含量均升高(图8-A、B、D), 但
转正义基因植株仍能维持较高的AsA还原状态,
100 μmol·L-1MV处理24 h后, WT、T1-3和T1-15中
AsA含量分别为0.68、0.95、0.86 μmol·g–1 (FW) (图
8-A)。野生型及转正义基因植株AsA/DHA都随着
处理时间的延长而降低, 但转正义基因植株的AsA/
DHA高于WT, 100 μmol·L-1 MV处理24 h后, T1-3和
T1-15的AsA/DHA比值分别为WT的2.82倍和3倍(图
8-C)。MV处理后APX活性出现不同程度的下降,
转正义基因植株的A P X活性明显高于野生型
(P<0.05) (图9)。AsA是维持APX活性所必需的, 转
正义基因植株相对较高的的APX活性可能与其在
氧化胁迫下能维持较高的AsA含量有关。
7 LeGGP过表达对氧化胁迫下Pn和Fv/Fm的影响
为了检测转LeGGP基因在MV胁迫过程中对
光合机构的保护作用, 测定了野生型和转基因烟草
的Pn和Fv/Fm。正常生长条件下野生型和转基因植
株的Pn和Fv/Fm无明显差别, 用100 µmol·L
-1 MV处
理后所有植株的Pn显著下降。24 h后WT、T1-3和
T1-15的Pn分别下降了30.8%、12.3%和11.39% (图
10-A)。MV处理后Fv/Fm也下降(图10-B), 但是, 转正
义基因下降较少, 这说明转正义基因烟草在MV处
理引起的氧化胁迫下PSII反应中心受伤害较轻。
讨  论
AsA是植物细胞重要的抗氧化物质, 还原型
抗坏血酸在H2O2存在下被细胞内的抗坏血酸过氧
化物酶(APX)作用而形成单脱氢抗坏血酸(MDHA),
进而通过非酶促反应形成氧化型(双脱氢)抗坏血
酸(DHA)。抗坏血酸的生物合成(Wheeler等1998)
图7 MV处理下烟草叶片H2O2含量(A)、相对电导率(B)和
O2¯· (C)的变化
Fig.7 Changes of H2O2 content (A), relative electronic con-
ductance (B) and O2¯· content (C) in tobacco leaves under
MV treatment
王丽燕等: 过表达番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因提高烟草抗MV诱导的氧化胁迫能力 695
及其再生(Stevens等2008)对清除H2O2是必需的, 植
物体内还原型抗坏血酸库的维持除了通过抗坏血
酸的合成之外, 由氧化型抗坏血酸再生出还原型
抗坏血酸也是必不可少的。细胞质中的单、双脱
氢抗坏血酸分别在单、双脱氢抗坏血酸还原酶的
作用下可再生成还原型AsA, 而叶绿体中单脱氢抗
坏血酸可以利用光还原的铁氧还蛋白(ferredoxin,
Fd)以高速率直接被还原生成抗坏血酸, 此过程可
能是位于类囊体膜附近的主要途径(Miyake和Asa-
da 1994)。MV作为光系统I (PSI)电子传递到O2的
有效人工次生电子受体, 可以与Fd蛋白竞争来自
于PSI的FeS簇的电子, 抑制Fd蛋白的还原, 对围绕
于PSI的环式电子传递产生强烈的抑制作用, 催化
PSI处O2发生光还原, 加速O2¯·和H2O2的产生, 是细
胞内产生氧化胁迫的促进剂(林植芳等2005; Cor-
nic等2000)。MV诱导后过量积累的H2O2, 在引起
植物的氧化损伤的同时也使叶绿体内依赖于还原
型Fd蛋白的MDHA再生出抗坏血酸的非酶促过程
受到抑制, 因此, MV处理条件下AsA的从头合成途
径变得尤为重要。
有研究表明, GGP可能是植物抗坏血酸合成
的关键酶(Gatzek等2002; Sasaki-Sekimoto等2005;
Wolucka和Van Montagu 2003)。本实验结果表明,
MV模拟的氧化胁迫处理可以诱导番茄LeGGP的
图9 MV处理下烟草叶片APX 活性的变化
Fig.9 Changes of APX activities in tobacco leaves under
MV treatment
图8 MV处理对转基因和野生型烟草叶片AsA (A)、DHA (B)、AsA/DHA (C)和总抗坏血酸含量(D)的影响
Fig.8 Effect of MV treatment on AsA (A), DHA (B), AsA/DHA (C) and total AsA (D)
in leaves of transgenic plants and WT tobacco
植物生理学报696
表达(图3)。虽然100 µmol·L-1 MV处理一定程度上
阻碍了烟草抗坏血酸的再生, 但通过转基因手段
促进了转基因烟草抗坏血酸合成关键酶GGP的过
表达(图4-B), 由于AsA合成过程中GGP催化之前
的代谢中间物质(D-6-磷酸葡萄糖, D-6-磷酸果糖,
D-6-磷酸甘露糖, D-6-磷酸甘露糖, GDP-甘露糖)是
植物体内多聚糖合成的底物, 在植物正常生长条
件下应该维持较高的含量(Reuhs等2004; Seifert
2004), 因此GGP含量的提高必然会促进AsA含量
的增加。有实验表明转拟南芥GGP基因可以有效
提高番茄、烟草及草莓的抗坏血酸含量(Bulley等
2012)。本实验结果也证实, 转LeGGP提高了烟草
总抗坏血酸含量和还原型抗坏血酸含量(图8-A、
C)。100 µmol·L-1 MV处理24 h后, 转基因烟草和野
生型植株氧化型抗坏血酸(DHA)含量均升高, 但野
生型烟草的DHA含量远高于转基因株系, 转正义
基因植株仍可以维持较高的抗坏血酸还原状态(图
8)。可见, 转LeGGP可以提高烟草的AsA含量, 维
持氧化胁迫下的还原状态。
MV氧化胁迫下, 植物叶圆片出现可见的损伤
通常被用于分析植物的抗逆性(Yoshimura等2004)。
本实验中的烟草叶圆片实验显示, 当分别用去离
子水和2种不同浓度MV (50和100 µmol·L-1)处理后,
野生型植株叶片颜色变褐, 出现明显的坏死现象,
但是转正义基因植株只是在叶圆片边缘出现了部
分坏死现象(图6-A), 转基因植株叶圆片具有高的
叶绿素含量(图6-B)。随着MV处理浓度的升高, 野
生型烟草幼苗的生长受到明显的抑制, 且叶片出
现光漂白现象, 但转基因烟草的生长明显好于野
生型(图5)。MV处理条件下转基因植株的H2O2、
O2¯·及相对电导率明显低于野生型(图7-A~C)。
H2O2的清除能力取决于抗坏血酸浓度以及APX的
活性, AsA是维持APX活性的保护剂, 缺乏抗坏血
酸会导致APX失活(Mano等1997), MV处理后, 转
正义基因植株H2O2增加比较缓慢(图7-A), 并且
APX仍可以维持较高活性(图9)。可见, 过表达
LeGGP基因提高了烟草还原型抗坏血酸含量, 有
助于维持APX活性。
抗坏血酸是叶绿体中最主要的水溶性抗氧化
物质, 类囊体腔内的抗坏血酸可以参与叶黄素循
环, 为紫黄质脱环氧化酶(VDE)提供电子, 是光保
护必不可少的组分(Smirnoff 2000), 抗坏血酸还可
以作为PSI和PSII的次级电子供体发挥作用(Mano
等2004)。MV胁迫刺激PSI O2的光还原作用, 使
PSII功能和结构受到伤害 , 从而抑制光合作用
(Krause 1988)。100 µmol·L-1 MV处理条件下烟草
Pn及Fv/Fm下降(图10-A、B), 转正义基因植株可以
维持较高的Fv/Fm, 这可能与抗坏血酸含量的增加
有助于清除叶绿体内的ROS相关。
总之, LeGGP的过表达提高了烟草的抗坏血
酸含量 , 维持较高的APX活性 , 降低了H2O2及
O2¯·积累, 减轻对膜的伤害, 有助于提高烟草的抗氧
化能力。
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图10 MV处理下转基因和野生型烟草
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Fig.10 Changes of Pn (A) and Fv/Fm (B) in transgenic plants
and WT tobacco under MV treatment
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