全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月 427
收稿 2009-12-09 修定 　2010-01-29
资助 国家自然科学基金项目(30971725, 30671214)。
* 通讯作者(E-mail: zhaohj303@163.com; Tel: 0371-63555319)。
外源钙对高温强光胁迫下小麦叶中蛋白激酶活性和D1蛋白磷酸化的影响
李利红 1,2, 梁书荣 3, 曲小菲 3, 赵会杰 3,*
1河南农业大学农学院, 郑州 450002; 2郑州牧业工程高等专科学校药物工程系, 郑州 450011; 3河南农业大学生命科学学院,
郑州450002
提要: 检测灌浆期叶面喷施10 mmol·L-1CaCl2和1 mmol·L-1蛋白激酶抑制剂(FSBA)对高温强光胁迫下小麦叶中蛋白激酶活
性和D1蛋白磷酸化影响的结果表明, CaCl2可提高而蛋白激酶抑制剂则抑制高温强光下蛋白激酶活性和D1蛋白含量及其
磷酸化水平。
关键词: 小麦; 高温强光; Ca2+; 蛋白激酶; D1蛋白磷酸化
Effects of Ca2+ on the Activiy of Protein Kinases and Phosphorylation of D1
Protein in Wheat (Triticum asetivum L.) Leaves under Heat and High Irradi-
ance Stress
LI Li-Hong1,2, LIANG Shu-Rong3, QU Xiao-Fei3, ZHAO Hui-Jie3,*
1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2Department of Pharmaceutical Engineering,
Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering, Zhengzhou 450011, China; 3College of Life Sciences, Henan Agricultural
University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: This article aimed at proving the effects of 10 mmol·L-1 CaCl2 and 1 mmol·L-1 FSBA on the protein
kinases activity and D1 protein phosphorylation in leaves of wheat (Triticum asetivum) at filling stage under high
temperature and irradiance stress. Results showed that pretreatment with CaCl2 improved remarkably the activity
of protein kinases and increased the content of D1 protein and it’s phosphorylation, while FSBA had the reverse
effects.
Key words: wheat; high temperature and irradiance stress; Ca2+; protein kinase; phosphorylation of D1 protein
植物体内的蛋白磷酸化主要参与调节代谢途
径中酶的活性、植物细胞信号的转导过程以及在
不同层次上调节有关基因的表达, 多种胞外刺激如
光照、温度和激素等在胞内的传递中均涉及蛋白
质的磷酸化过程(吴能表等 2004)。越来越多的证
据表明, 蛋白磷酸化在高等植物光合机构对环境的
适应和调节中都有作用(Ebbert和Godde 1996)。
在我国北方地区, 小麦灌浆期间经常遭遇到高
温和强光共存的逆境因素胁迫。在这种条件下, 植
物光合作用易受强光的抑制和破坏, 不仅 PS II光
化学效率及电子传递速率明显下降(La Porta等
2004; 李利红等 2009), 而且 PS II反应中心蛋白也
遭破坏, 从而导致光抑制(Yamamoto 2001)。近年
来, 随着光抑制机制及光系统 II 功能(刘文娟等
2007)研究的深入, 人们逐渐将注意力转向外源物质
对光合机构的防护效应和作用机制的探讨。Ca2+
作为植物生长发育的第二信使常得到广泛关注, 缓
解植物高温伤害的研究发现, 外源Ca2+可提高和保
护高温胁迫下花生中Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶的
活性(宰学明等 2007); 还可促进水杨酸(salicylic
acid, SA)对葡萄耐热性的诱导(刘悦萍等 2005)。
这些研究表明, Ca2+和CaM可能是植物热激信号转
导途径中的组分。但是, 外源钙在遭受高温和强光
胁迫的植物的保护作用还少有报道。本文在以前
研究的基础上(李利红等2009), 检测了外源钙对小
麦叶蛋白激酶和叶绿体D1蛋白磷酸化的影响, 以
期为生产中采用抗逆应变技术提供参考。
材料与方法
以小麦(Triticum asetivum L.)品种 ‘豫农 949’
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为材料, 试验于 2008年 10月 ~2009年 6月在本校
科教园区进行。采用盆栽试验, 盆高 40 cm, 内径
40 cm, 盆内装入 20 kg耕层潮土。土壤的有机质
含量为 10.5 g·kg-1(土), 全氮含量为 1.01 g·kg-1(土),
碱解氮含量为 75.4 mg·kg-1(土) , 速效磷为 26.7
mg·kg-1(土), 速效钾为 87.6 mg·kg-1(土)。10月 15
日播种, 播种后将盆埋入试验田土中, 出苗后每盆
留苗 5株, 常规管理。旗叶完全展开时, 将其分为
3组: (1)喷水作为对照, (2)喷CaCl2, (3)作蛋白激酶
抑制剂(5-p-fluorosulfonylbenzoyl adenosine, FSBA)
处理。CaCl2浓度经过前期筛选, 采用最佳浓度 10
mmol·L-1, 每天喷 1次, 连喷 5 d。喷后 3 d将盆带
回实验室, 参照 Zhang和Xu (2003)文中的方法将
实验组(3)进行 FSBA处理。然后进行温、光处理,
其流程为: 在人工气候室中设置一铁架, 上放置1 cm
厚的流动水槽(钨灯与材料之间) , 高照度光源为
1 000 W钨灯, 通过调整灯的高度控制光照到旗叶
上的辐射强度。照光前各处理先作 12 h的暗适应,
然后置于人工气候室中进行高温和强光胁迫处理
(36 ℃, 1 800 μmol·m-2·s-1)。于高温强光处理的 0 h
(照光前)、1 h、3 h以及正常温光条件下(25 ℃、
600 μmol·m-2·s-1)恢复 3 h后取样。每个处理重复
4次, 所取旗叶样品立即置于液氮中备用。
蛋白质含量采用考马氏亮蓝法(邹琦 2003)测
定。
用 SD S- 聚丙烯酰胺凝胶电泳和West er n
b lot ting进行 D1 蛋白的分离与测定(李利红等
2009), 重复 3次。以光密度扫描测定 D1蛋白的
相对含量。
按照王宁宁等(1998)文中方法提取小麦叶中膜
蛋白。将小麦叶片于液氮中磨碎后, 按 1/3 (W/V)
比例加入缓冲液 1。缓冲液 1 的配方如下: 0 . 5
mmol·L-1山梨醇, 50 mmol·L-1 MOPS (3-吗啉丙磺
酸, 3-morpholinopropanesulfonic acid, 分子量为 209.26) /
KOH, 10 mmol·L-1 EGTA, 2.5 mmol·L-1焦亚硫酸钾,
0.5 mmol·L-1牛血清白蛋白, 1 mmol·L-1 PMSF (苯甲
基磺酰氟, phenylmethanesulfonyl fluoride), 2% PVP
(聚乙烯基吡咯烷酮, polyvinylpyrrolidone), pH为7.6。
混合研磨后, 以 10 000×g 于 4 ℃离心 15 min; 上清
液再以 80 000×g离心 20 min, 沉淀用缓冲液 2 (含
15 mmol·L-1Tris/失水苹果酸、0.5 mmol·L-1山梨
醇、pH 为 7.3)洗 1次, 重悬于缓冲液 3中(含 3
mmol·L-1 Tris/失水苹果酸、0.5 mmol·L-1山梨醇、
pH为 7.3)备用。蛋白的磷酸化参考 Sakamoto和
Shibata (1992)文中的方法略有改动。40 μL反应
体系中含 10 mmol·L-1 MgCl2、50 mmol·L-1 MOPS/
NaOH、2 mmol·L-1 MnCl2、2 mmol·L-1 DTT, pH
7.5, 加入 30 μL蛋白提取液。加入 2 μL ATP-[γ-
32P] ATP混合液(1.85×107 Bq·μL-1, 购自中国同位素
有限总公司)后开始反应, 反应的温度为 30 ℃, 反
应 10 min后取 20 μL反应混合物涂在经 150 mmol·L-1
H3PO4预处理的Whatman 3MM滤纸片上, 滤纸片
放在 150 mmol·L-1 H3PO4中洗涤 6次以除去游离的
[γ-32P] ATP, 以乙醇脱水干燥后用 LS-6500液体闪
烁计数仪(Beckman公司)进行液体闪烁计数测定磷
酸化活性, 以 cpm·mg-1(蛋白)表示。
数据采用 Excel 2003进行处理, 测定均重复 5
次, 结果以平均值 ±标准差(mean±SE)表示, 结合
DPS 3.01版软件进行方差分析和多重比较。
结果与讨论
1 外源钙和 FSBA对蛋白激酶活性的影响
图 1表明, 强光照射下, 无论是否经钙处理，
植株的蛋白激酶活性均上升; 照光 3 h条件下，钙
处理植株的蛋白激酶活性极显著高于不作钙处理
的; 暗中恢复阶段, 钙处理与否的植株中蛋白激酶
活性均下降, 3个处理的酶活性差异不显著。强光
下, FSBA处理后的植株酶活性显著低于对照和钙
处理植株的酶活性。
2 外源钙和 FSBA对D1蛋白磷酸化水平的影响
以Western blotting方法分析D1蛋白结果(图
2)表明, 分别以未经钙处理的照光前的磷酸化和非
磷酸化的D1蛋白为参照, 测得各处理磷酸化和非
磷酸化的D1蛋白的相对含量和方差分析的结果(图
3)显示, 各个处理的叶中都存在D1蛋白的磷酸化现
象。随着照光时间的延长, D1蛋白磷酸化和非磷
酸化均下降, 暗恢复阶段则有所上升。不管在照光
前、照光期间, 还是恢复期间, 外源钙均极显著提
高D1蛋白含量和D1蛋白的磷酸化水平; FSBA处
理后的D1蛋白含量和磷酸化水平极显著下降。
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图 2 D1蛋白Western blotting转膜图
Fig.2 Western blotting mapping of D1 protein
CK0、CK3、CK 恢复分别指对照(喷水处理)的照光前、照光 3 h和恢复 3 h; FSBA0、FSBA3、FSBA 恢复分别指 FSBA处理后照
光前、照光 3 h 和恢复 3 h; Ca 0、Ca 3、Ca 恢复分别指 Ca 处理后的照光前、照光 3 h 和恢复 3 h; 下同。
图 3 钙离子和 FSBA对D1蛋白相对含量的影响
Fig.3 Effects of Ca2+ and FSBA on the relative quantity of D1 protein
图 1 钙离子和 FSBA对蛋白激酶活性的影响
Fig.1 Effects of Ca2+ and FSBA on the activity of protein kinases
图中 0 h、1 h 、3 h 和恢复后分别表示照光前、照光 1 h、照光 3 h 和恢复 3 h 后。不同小、大写字母分别表示差异达显
著(P<0 .05 )和极显著水平(P<0.0 1)。
参考文献
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