全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 663
收稿 2009-03-30 修定 　2009-05-20
资助 国家 “863” 计划(2009AA101105)和华中科技大学研究
基金(2 006 Q0 56B)。
* 通讯作者(E-ma i l : yu longj i a n g@ma i l .hu st . edu .cn ,
limaoteng426@163.com; Tel: 027-87792264)。
芸薹属中几个物种碳酸酐酶活性的比较
邓秋红, 甘露, 付春华, 栗茂腾 *, 余龙江 *
华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉 430074
提要: 检测芸薹属中几种植物的碳酸酐酶在根、茎、叶中的分布和活性以及叶片净光合速率和锌元素含量的结果表明: 碳
酸酐酶在甘蓝型油菜的根、茎、叶中均有分布, 叶中的碳酸酐酶活性最大, 茎中的次之, 根中的最小。不同芸薹属植物中
碳酸酐酶活性的大小依序为: 甘蓝型油菜>白菜型油菜>芜菁>埃塞俄比亚芥。以甘蓝型油菜为例, 碳酸酐酶活性的日变化
呈双峰曲线, 在整个生育期的变化趋势是先上升后下降, 抽薹期间的碳酸酐酶活性最高。碳酸酐酶活性与净光合速率以及
与锌元素含量之间均呈现显著的正相关。
关键词: 芸薹属; 甘蓝型油菜; 碳酸酐酶活性; 净光合速率; 锌含量
Comparison of Carbonic Anhydrase Activities of Several Species in Brassica
DENG Qiu-Hong, GAN Lu, FU Chun-Hua, LI Mao-Teng*, YU Long-Jiang*
College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China
Abstract: The distribution and activities of carbonic anhydrases (CA) in root, stem, and leaf of several species
in Brassica were studied in order to determine the correlations between CA activity with net photosynthetic rate
or zinc content. It was showed that CAs were distributed extensively in root, stem, and leaf of Brassica. CA
activity was much higher in leaves than that in roots or stems, while enzyme activity in roots was the lowest.
Considering different species in Brassica, CA activities in leaves were descending with the range as B. napus L.,
B. campestris L., B. rapa L., and B. carinata L. The diurnal variation of CA activity in B. napus leaves showed
the double-peak curve during whole growth period, which reached its maximum at the bolting stage. It could be
concluded that CA activity had positive correlation with net photosynthetic rate and zinc content, respectively.
Key words: Brassica; Brassica napus; carbonic anhydrase activity; net photosynthetic rate; zinc content
碳酸酐酶(carbonic anhydrase, EC4.2.1.1)是一
种含锌金属酶, 其活性中心有一个催化所必需的锌
原子, 催化CO2的可逆水合反应, 转化常数高达106
(Tripp 等 2001; Smith 和 Ferry 2000)。碳酸酐酶参
与多种生物过程, 包括: pH 调节、离子交换、CO2
转运、呼吸作用、生物合成和光合 CO2 固定。到
目前为止, 除了真菌以外, 其他生物体中都已经发
现了碳酸酐酶的存在(Smith 等 1999; Thoms 2002;
Lindskog 1997)。碳酸酐酶的广泛分布以及其催化
的反应具有特别的生物学地位, 这预示碳酸酐酶可
能具有人们无法想象的作用和功能。
碳酸酐酶在所有利用 CO2 进行光合作用的绿
色植物当中都存在, 从藻类, 蕨类到高等被子植物
都含有碳酸酐酶, 而且含量还相当可观, 有些植物
中碳酸酐酶约占可溶性蛋白的 2 % ( O k a b e 等
1984)。植物的碳酸酐酶主要存在于绿色组织中,
豌豆幼苗叶片的碳酸酐酶活性是茎的10倍, 虽然根
瘤含有一定量的碳酸酐酶, 但根中几乎无碳酸酐酶
活性, 黄化叶片中碳酸酐酶的活性也较低。高等植
物种间的碳酸酐酶活性差别很大。C3和C4植物中
均含有碳酸酐酶, 其中C3植物中的碳酸酐酶活性比
C4 植物中的要高很多(Everson 和 Slack 1968)。C3
植物中碳酸酐酶主要分布在叶绿体内, 95%以可溶
性的游离蛋白酶形式存在(Poincelot 1972), 内囊体
膜含有少部分碳酸酐酶活性(Stemler 1986), 叶绿体
膜上无碳酸酐酶活性, 细胞质中碳酸酐酶含量很
少。而C4 植物细胞质中却含有较高的碳酸酐酶活
性。碳酸酐酶是有些植物固定CO2所必需的, 但对
植物碳酸酐酶的研究仅限于少数几种植物, 主要是
豆类(Johansson 和 Forsman 1993; Moskvin 2000)、
玉米(Lu和 Stemler 2002)、菠菜(Rowlett 等 1994)、
胡萝卜(Demir 等 1997)等农作物, 对其碳酸酐酶的
一些酶学特性包括动力学等都有较多的研究。本
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月664
文研究芸薹属不同植物、同一植物不同部位(如甘
蓝型油菜的根茎叶)以及同一植物同一部位不同时
间(如甘蓝型油菜叶中的日变化和不同生育期的变
化)的碳酸酐酶活性, 以期为深入研究碳酸酐酶活性
在油菜品种间的差异和筛选高产优质的油菜品种建
立基础。另外还研究了碳酸酐酶活性与锌元素、
净光合速率之间的关系, 为探讨碳酸酐酶在植物光
合作用中的功能提供参考。
材料与方法
材料为芸薹属的甘蓝型油菜(Brassica napus
L.)、白菜型油菜(Brassica campestris L.)、埃塞
俄比亚芥(Brassica carinata L.)和芜菁(Brassica rapa
L.), 种植在试验田中, 采光通风良好。取甘蓝型
油菜苗期的新鲜根、茎、叶测定碳酸酐酶活性。
并在2007年10月至2008年5月测定4个不同生育
时期的碳酸酐酶活性、光合作用和锌含量。
上午9:00在田间采集新鲜叶片, 均取自第一片
完全展开叶下数第 2、3 片功能叶。取 2 片叶子
测定光合速率、碳酸酐酶活性和金属元素含量。
叶中碳酸酐酶的提取参照 Hatch 和 Burnell
(1990)文中的方法略作修改。取田间的新鲜叶片
0.5 g, 立即于液氮中研磨, 加 5 mL 提取缓冲液(50
mmol·L-1 Hepes-KOH 含 10 mmol·L-1 DTT, pH=
8.2)。以 12 000×g 离心 10 min, 取上清液并储存
在 4 ℃中待测。
碳酸酐酶活性的测定参照Brownell等(1991)文
中方法略作改进, 于 4 ℃的冷冻反应室中, 加入 5
mL缓冲液(20 mmol·L-1 巴比妥 -KOH, pH=8.3)和 0.5
mL经过煮沸或未煮沸的样品液, 打开磁力搅拌器持
续搅拌混合均匀, 再用注射器注入 4.5 mL 冰冷的
CO2 饱和水(蒸馏水在 0 ℃冰水混合物中充 CO2 气
体1 h获得)时反应开始, 测定H2O+CO2→ΗCO3-+H+
过程中导致的 pH下降, 用梅特勒 pHs-320S酸度计
监测 pH 从 8.3 下降到 7.3 所需的时间。碳酸酐酶
的活性单位(U)计算公式为: U=10×(T0/T-1), 其中
T0 和 T 分别为煮沸杀死的样品液和未煮沸的样品
液测得的pH变化所需的时间。碳酸酐酶活性以每
克新鲜叶片( 或根、茎) 含有的酶活单位数表示
[U·g-1(FW)]。所有数据均为 3 次测量的平均值。
用消解法 - 原子吸收光谱法测定金属元素含
量。具体方法为: 用双蒸水洗净植物叶片, 吸干水
分, 放至烘箱 60 ℃烘烤 48 h, 用玛瑙研钵研成粉
末, 过 200目塑料尼龙筛, 用ETHOS-T高压微波消
解 /萃取仪进行消解, 消解液稀释后定容至10 mL。
元素分析时稀释消解液至适当浓度, 用WFX-110原
子吸收分光光度计测定其含量。
用英国 PPSystem公司生产的TPS-1便携式光
合作用测定仪测定净光合速率。
数据用 Origin 6.1 作图, 并用 SPSS 15.0 软件
进行统计分析。
结果与讨论
1 碳酸酐酶活性在油菜中的分布
图 1 和 2 结果表明: (1) 11 种甘蓝型油菜根茎
叶中的碳酸酐酶活性各不相同, 且每一种油菜的根
图 1 碳酸酐酶在不同甘蓝型油菜的根茎叶中的分布
Fig.1 The distribution of carbonic anhydrases in root, stem and leaf of different Brassica napus lines
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茎叶中的碳酸酐酶活性是叶片中的最大, 茎中的居
中, 根中的最小(图 1); (2)碳酸酐酶活性的大小顺
序为: 甘蓝型油菜>白菜型油菜>芜菁>埃塞俄比亚
芥(图 2)。这与吴沿友等(2006a)的结果相似。
图 2 不同类型油菜叶中的碳酸酐酶活性比较
Fig.2 Comparision of carbonic anhydrase activities in leaves of different species of Brassica
2 油菜叶中碳酸酐酶活性的日变化
从图3可以看出, 甘蓝型油菜07L20叶中碳酸
酐酶活性在 1 d 之内呈双峰曲线变化, 在 11:00 左
右出现最高峰, 14:00 左右有一低谷, 16:00 左右又
有回升, 而后一直下降。这与净光合速率日变化相
似。
期活性达到最高, 而后下降, 角果成熟期活性降至
最低。就同一时期而言, 07L04 (甘蓝型油菜)和
07L32 (埃塞俄比亚芥)的碳酸酐酶活性始终很低, 而
07L24 (甘蓝型油菜)的碳酸酐酶活性则很高(图4)。
此外, 于苗期、抽薹期、开花期和角果成熟
期分别取样测定碳酸酐酶活性的结果表明, 总的趋
势是先升高后下降。苗期油菜叶中活性较高, 抽薹
图 4 整个生育期过程中不同类型油菜叶中
碳酸酐酶的活性变化
Fig.4 Changes of carbonic anhydrase activity in leaves of
different Brassica species during whole growth period
3 油菜的碳酸酐酶活性与锌元素含量及净光合速
率之间的关系
碳酸酐酶活性与净光合速率的变化之间呈明
显的正相关(图 5), 相关系数 r为0.999 (P<0.01), 达
到极显著水平。这与吴沿友等(2006b)的结果基本
上一致。碳酸酐酶活性与锌元素含量的变化之间
图 3 甘蓝型油菜叶中碳酸酐酶活性的日变化
Fig.3 The diurnal change of carbonic anhydrase
activity in B. napus leaves
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月666
也呈明显的正相关(图 6), 相关系数 r 为 0.953 (P<
0.05), 达到显著水平。
参考文献
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图 5 全生育期间甘蓝型油菜叶中碳酸酐酶活性和
净光合速率的变化
Fig.5 Changes of carbonic anhydrase activity and net
photosynthetic rate of B. napus leaves during
whole growth period
图 6 全生育期间甘蓝型油菜叶中碳酸酐酶活性和
锌元素含量的变化
Fig.6 Changes of carbonic anhydrase activity and zinc
content of B. napus leaves during whole growth period