全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (12): 1207~1212 1207
收稿 2011-10-08　　修定 2011-10-26
资助 国家自然科学基金(30871317和31070281)。
* 通讯作者(E-mail: xbli@mail.ccnu.edu.cn; Tel & Fax: 027-
67862443)。
植物树脂半薄切片染色方法的改进
李兵, 李登弟, 张杰, 黄耿青, 李学宝*
华中师范大学生命科学学院, 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室, 武汉430079
摘要: 以双子叶植物棉花的幼根、幼茎、叶、胚珠和单子叶植物玉米茎为实验材料, 制作树脂半薄切片, 对样品染色方法
等进行了改进, 将蕃红-固绿染色、苏木精-伊红染色、氯化铁-苏木精染色方法系统应用于植物树脂半薄切片制备中, 获得
了结构完整、染色清晰的棉花各器官和玉米茎半薄切片, 建立了一套适合于植物树脂半薄切片制作的染色方法。
关键词: 植物组织; 半薄切片; 染色方法改进
Modification of Resin Semithin Section Staining Method in Plant Tissues
LI Bing, LI Deng-Di, ZHANG Jie, HUANG Geng-Qing, LI Xue-Bao*
Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Sciences, Central China Normal University,
Wuhan 430079, China
Abstract: In this study, a new resin semithin section staining method suitable to plant tissue-section was estab-
lished. Young roots, young stems, leaves and ovules of cotton (Gossypium hirsutum) and stems of maize (Zea
mays) were analyzed by the methods of resin semithin section. The improved staining methods (including safr-
anin-fast green staining, hematoxylin-eosin staining, FeCl3-haematoxylin staining) were applied in the preparation
of the plant semithin section. Our experimental results indicated that clear-staining and integral-structural semi-
thin section of cotton and maize tissues were obtained by using modified methods of resin semithin section.
Key words: plant tissue; semithin section; improvement of staining methods
树脂半薄切片技术是生物材料经固定、染
色、脱水、渗透等处理后, 以树脂作为包埋剂的
一种制片技术, 其切片厚度介于超薄切片和石蜡
切片之间, 为0.5~3 µm之间, 故称为半薄切片, 是一
种供光学显微镜观察的薄切片(李和平2009; 许广
沅和周晓丽1984)。起初, 树脂半薄切片技术用于
超薄切片前包埋材料的定位, 因超薄切片的材料
小, 通过半薄切片定位后能比较准确地选择观察
部位制作超薄切片(刘鲜林和林陶1999; 王萍和任
力2007; 徐敏2001; 于红丽等2004)。后来, 随着树
脂半薄切片染色方法的不断改进, 而且制备技术
能使组织细胞成分更大限度地保存, 加之比石蜡
切片薄, 能克服石蜡切片厚、细胞成分重叠之不
足, 具有清晰度和分辨率高、可观察到细胞内较
细微的结构等优点, 因此, 树脂半薄切片被广泛应
用于细胞学、胚胎学、解剖学的教学、科研工作
以及病理诊断等领域, 现已发展成为细胞学细微
结构研究的重要光学手段之一 (王萍和任力
2007)。
染色是制备树脂半薄切片的关键技术, 常用
于树脂半薄切片的染色方法有单色染色法和多色
染色法。以人体或动物组织为实验材料制作树脂
半薄切片常用的单色染色方法主要有甲苯胺蓝染
色(许广沅和周晓丽1984; 徐敏2001; 于红丽等
2004; 王萍和任力2007)和硼砂甲苯胺蓝染色(韩琳
等2008; 刘冬娟等2004), 多色染色的方法有苏木
精-伊红染色(韩莉等2003; 于红丽等2004), 亚甲基
蓝-碱性品红染色(刘鲜林和林陶1999; 王萍和任力
2007; 魏崴等2005)和亚甲基蓝-天青II和碱性品红
染色(许广沅和周晓丽1984)。以植物为实验材料
制作树脂半薄切片常用的单色染色方法有甲苯胺
蓝染色(Huck等2003; Mahmoodzadeh等2007)、苏
丹黑染色(Leonova等2010)和高碘酸-Schiff染色(吴
技术与方法 Technique and Method
植物生理学报1208
均章和韩素芬2003)等, 多色染色方法有亚甲基蓝-
碱性品红染色 (李和平2009; 徐丽云和胡适宜
1986)、亚甲基蓝-天青II和碱性品红染色(李学湛等
1989; 徐丽云和胡适宜1986)、苏木精(或亚甲基蓝)-
蕃红染色(Leonova等2010, Warmke和Lee 1976)、
高碘酸-Schiff/甲苯胺蓝染色(PAS/TBO法) (李和平
2009; 徐丽云和胡适宜1986)和高碘酸-Schiff (PAS)/
苏丹黑B/考马斯亮蓝三重染色(胡适宜和徐丽云
1990; 李和平2009)等, 其中, 高碘酸-Schif主要对组
织中的糖类进行染色, 苏丹黑主要对组织中的脂
类进行染色, 考马斯亮蓝主要对组织中的蛋白质
进行染色, 甲苯胺蓝、蕃红为细胞壁染色剂, 碱性
品红、苏木精、亚甲基蓝为细胞核染色剂。
蕃红-固绿染色、苏木精-伊红染色和氯化铁-
苏木精染色是植物石蜡切片使用的3种染色方法,
而将上述3种染色方法系统应用于植物树脂半薄
切片的制备少见有文献报道。为进一步提高显微
切片的清晰度和分辨率, 更清楚地显示细胞内较
细微的结构, 从细胞水平建立一种更有效的显微
制片方法, 为教学或科研工作提供更有力的实验
证据, 我们选取双子叶植物棉花的幼根、幼茎、
叶、胚珠和单子叶植物玉米茎为实验材料, 用SPI-
PON 812树脂作为包埋剂制作树脂半薄切片, 对样
品染色方法等进行了改进, 探索将蕃红-固绿染
色、苏木精-伊红染色和氯化铁-苏木精染色3种方
法系统应用于树脂半薄切片制备中, 获得了效果
理想的树脂半薄切片, 建立了一套适合于植物树
脂半薄切片制作的染色方法。
材料与方法
1 植物材料
陆地棉‘珂字312’ (Gossypium hirsutum L. cv.
‘Coker312’)种子经70%乙醇表面处理1 min后, 再
用10% H2O2浸泡杀菌1 h, 用无菌水充分清洗后种
植于1/2MS培养基, 在28 ℃、16 h光照/8 h黑暗条
件下培养生长2 d, 自根尖向上切取0.5~1 cm的幼
根。将培养生长5~6 d小苗移栽于大田中, 生长发
育至开花结实期 , 分别收取植株近顶芽下端幼
茎、过主脉的幼叶、开花后2 d胚珠等材料。
选取当年的玉米(Zea mays L.)种子, 播种于花
盆或田间, 种子播下后经常浇水但不能施肥, 自播
种至取材60 d左右, 从玉米茎的节间部位剥去叶
鞘, 将茎用单面刀片切成5 mm左右小段。
2 实验方法
将棉花根、茎、叶、胚珠和玉米茎固定于
FAA溶液或4%多聚甲醛溶液中不少于24 h。将已
固定好的棉花幼根于5%冰乙酸乙醇溶液中媒染2
d, 埃立氏苏木精染液内染色3 d, 蒸馏水洗净余色,
自来水冲洗不少于12 h, 经蒸馏水和乙醇逐级脱水,
每级不少于2 h, 进95%乙醇伊红染液复染细胞质
48 h, 无水乙醇脱水2 h, 经环氧丙烷进一步脱水2
次, 每次5~10 min, SPI-PON 812树脂全部配方和环
氧丙烷按1:1配制渗透液至少渗透1 h, 用SPI-PON
812树脂全部配方再渗透样品1 h。材料复染伊红
后, 所经过的脱水剂、渗透剂中需含有0.1%的伊
红染料。选择合适的塑料小管为包埋模具, 将各
种样品与完整配方树脂置于模具中, 随时调整材
料方向使之处于最佳位置 , 完成样品的最终嵌
入。在60 ℃烤箱中固化48 h, 冷却固化块至室温,
即可用于半薄切片。
将已固定好的棉花胚珠浸染于氯化铁-苏木
精染液内72 h, 蒸馏水洗净余色, 自来水冲洗不少于
12 h, 之后脱水、渗透和包埋步骤与棉花根相同。
将已固定好的棉花幼茎、叶和玉米茎于50%
乙醇蕃红染液内染色7~10 d, 经50%~100%乙醇逐
级脱水, 之后脱水、渗透和包埋步骤与棉花根相
同, 但实验材料经蕃红染色后, 所经过的脱水剂、
渗透剂中需含有0.1%的蕃红染料, 棉花叶选择橡
胶包埋板为模具, 棉花幼茎和玉米茎选择塑料小
管为包埋模具。
调整切片厚度为3 μm, 在莱卡RM2255切片机
上进行切片。在洁净的载玻片上滴加含有微量蛋
清甘油的蒸馏水, 置电热板上加热至42 ℃, 用尖头
镊子将切好的半薄切片移至上述准备好的载玻片
上, 置电热板上加热烘烤不少于12 h, 使切片牢固
地贴附于载玻片上。
蕃红-固绿染色的棉花幼茎、叶和玉米茎复
染固绿时需脱树脂, 将粘附有棉花茎、叶和玉米
茎半薄切片的载玻片浸入氢氧化钠的无水乙醇饱
和溶液中脱树脂0.5~1 h, 用无水乙醇充分清洗, 逐
级降至蒸馏水中, 于42 ℃烤箱中烘干。上述凡是
由无水乙醇配制的溶液中都需含有0.1%蕃红。经
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二甲苯、无水乙醇、蒸馏水处理后, 用胶头吸管
吸取固绿染色液数滴于半薄切片上, 染色数秒钟
后无水乙醇洗去余色, 二甲苯透明, 中性树胶封
片。
苏木精-伊红染色的棉花根、氯化铁-苏木精
染色的棉花胚珠进行半薄切片后直接用中性树胶
封片。
甲苯胺蓝单色染色的玉米茎经固定、脱水、渗
透、包埋和半薄切片后可直接将0.5%甲苯胺蓝水
溶液滴染于其载玻片上, 酒精灯火焰上加热至近
沸点染色数秒, 然后用蒸馏水速洗, 除去多余染液,
滤纸吸干, 于60 ℃烤箱中烘干, 中性树胶封片。
实验结果
1 植物树脂半薄切片相关方法的改进
与常规植物树脂半薄切片相比较, 我们在对
染色方法进行改进的同时, 对样品的包埋模具、
脱树脂方法等进行了一些改进(表1), 取得了良好
的效果。
2 双子叶植物棉花组织的树脂半薄切片观察
取棉花幼根自根尖向上切取0.5~1 cm的幼根
作纵切树脂半薄切片, 采用苏木精-伊红整体染色,
切片厚度为3 μm, 在光学显微镜下镜检观察, 如图
1-A所示, 细胞结构无明显的破损、收缩或质壁分
离等现象发生, 细胞核着色明显, 呈蓝色, 细胞质
着色均匀, 棉花根的皮层、内皮层、中柱鞘和维
管组织等细微结构清晰可见。
取近棉花顶芽下端的幼茎作横切切片, 用蕃
红-固绿染色, 树脂半薄切片厚度3 μm, 在光学显微
镜下观察了棉花茎组织结构。如图1-B所示, 木质
导管呈红色, 其他组织均呈绿色。能够清楚显示
茎的皮层薄壁组织、初生韧皮部、形成层、初生
木质部、髓等结构。
取过主脉的棉花叶片, 经蕃红-固绿染色后横
切, 半薄切片厚度为3 μm, 在光学显微镜下观察棉
花叶组织结构。如图1-C所示, 细胞结构完整、形
态正常, 能看清叶的栅栏组织、海绵组织、叶脉
等, 叶脉导管呈红色, 其他组织呈绿色。图中能看
清栅栏组织和海绵组织细胞中的叶绿体, 主脉横
切面上能看清木质部、韧皮部、形成层等细微结
构。
取开花后2 d的胚珠经氯化铁-苏木精染色后
作纵切, 树脂半薄切片厚度为3 μm, 在光学显微镜
下观察棉花胚珠组织结构。如图1-D所示, 胚细胞
结构完整, 无明显裂隙、收缩等现象发生, 能看清
表皮细胞、纤维(种皮毛)及细胞核、外珠被、内
珠被、发育中的胚珠等结构。
3 单子叶植物玉米茎树脂半薄切片观察
我们观察了甲苯胺蓝单色染色的玉米茎横切
的树脂半薄切片, 其厚度为3 μm。如图2-A所示,
在光学显微镜下切片背景干净, 细胞结构完整, 表
皮、薄壁细胞和散生微管束等结构清晰可见, 因
切片为单色染色, 故木质部、机械组织和薄壁细
胞、韧皮部等结构区分不如多色染色明显, 但单
色染色迅速, 制作简便, 成功率高。
同时, 我们也对多色染色的玉米茎树脂半薄
表1 常规植物树脂半薄切片方法与改进方法的比较
Table 1 Comparison of the common method and its modified method of resin semithin section
方法过程及效果 常规树脂半薄切片制片技术 改进的树脂半薄切片制片技术
包埋模具 胶囊和橡胶板作模具 塑料小管和橡胶板作模具
脱树脂剂 饱和NAOH或KOH无水乙醇溶液 饱和NAOH或KOH无水乙醇溶液添加相应染色剂
多色染色方法 亚甲基蓝-碱性品红染色、亚甲基蓝-天青II 苏木精-伊红染色、蕃红-固绿染色、氯化铁-苏木
和碱性品红染色、高碘酸-Schiff/甲苯胺蓝 精染色
染色、高碘酸-Schiff (PAS)/苏丹黑B/考马
斯亮蓝三重染色、苏木精(或亚甲基蓝)-蕃
红染色等
染色方式 切片染色方式 整体染色与切片染色相结合
染色效果 对细胞壁、细胞质以及细胞化学成分染色, 主要对组织细胞的细胞壁、细胞质、细胞核、细
侧重对植物细胞中的糖类、脂类、蛋白质 胞器等细胞结构和形态进行染色, 便于分清薄壁
进行染色定位, 便于了解细胞中物质成分的 细胞、微管组织等细胞结构
分布

植物生理学报1210
切片进行了观察。经蕃红-固绿染色后作横切, 树
脂半薄切片厚度为3 μm。如图2-B所示, 在光学显
微镜下切片能看清表皮、散生维管束和薄壁细胞,
且表皮中的机械组织、散生维管束中木质部呈红
色, 薄壁组织、散生维管束中的韧皮部呈绿色。
细胞界限清晰, 着色均匀, 颜色鲜亮, 层次分明, 其
清晰度和分辨率高。多色染色的树脂半薄切片比
单色染色的树脂半薄切片更易区分木质部、韧皮
部、薄壁细胞和机械组织等, 染色效果好, 但多色
染色程序复杂, 耗时较长。
讨　　论
染色是制备树脂半薄切片的重要环节, 本实
验对植物树脂半薄切片的多色染色方法进行了改
图1 棉花幼根、幼茎、叶片和开花后2 d胚珠树脂半薄切片
Fig.1 Resin semithin sections of cotton young roots, young stems, leaves and 2 days post anthesis (DPA) ovules
A: 棉花幼根苏木精-伊红染色(×20); B: 棉花幼茎蕃红-固绿染色(×20); C: 棉花叶片(过主脉)蕃红-固绿染色(×20); D: 开花后2 d胚珠氯
化铁-苏木精染色(×20)。ep: 表皮; co: 皮层; en: 内皮层; pe: 中柱鞘; vt: 维管组织; pa: 薄壁细胞; ca: 形成层; ph: 韧皮部; xy: 木质部; pi: 髓;
pt: 栅栏组织; st: 海绵组织; ch: 叶绿体; f: 纤维; o: 外珠被; i: 内珠被。标尺=100 µm。
图2 玉米茎甲苯胺蓝单色染色和蕃红-固绿染色的树脂半薄横切切片
Fig.2 Resin semithin cross-sections of maize stems by toluidine blue staining and safranin-fast green staining
A: 甲苯胺蓝单色染色(×20); B: 蕃红-固绿染色(×20)。ep: 表皮; xy: 木质部; ph: 韧皮部; pa: 薄壁细胞。标尺=100 µm。
李兵等: 植物树脂半薄切片染色方法的改进 1211
进。已有文献报道植物树脂半薄切片的多色染色
方法, 如亚甲基蓝-天青II和碱性品红染色(李学湛
等1989; 徐丽云和胡适宜1986)、高碘酸-Schiff
Schiff/甲苯胺蓝双重染色(PAS/TBO法) (李和平
2009; 徐丽云和胡适宜1986)和高碘酸-Schiff
(PAS)/苏丹黑B/考马斯亮蓝三重染色(胡适宜和徐
丽云1990; 李和平2009)等, 这些染色方法主要用于
植物组织细胞化学成分染色, 对植物组织中的糖
类、脂类、蛋白质进行染色定位, 而我们改进的
多色染色方法是将苏木精-伊红染色、蕃红-固绿
染色和氯化铁-苏木精染色系统应用于树脂半薄切
片的制备中。其中, 苏木精-伊红染色适合对植物
根尖和顶芽等组织的染色, 将细胞核染成蓝色, 细
胞质染成红色或紫红色; 蕃红-固绿染色适合对植
物茎和叶等组织的染色, 将机械组织和木质化的
细胞壁染成红色, 薄壁细胞和纤维素的细胞壁染
成绿色; 氯化铁-苏木精染色适合于植物胚珠、子
房和花药等组织的染色, 是植物细胞一般结构及
细胞分裂时期的优良染色剂, 将细胞分裂时期的
染色体染成黑色。上述改进的3种染色方法主要
对植物组织细胞壁、细胞质、细胞核等细胞结构
和形态进行染色, 从而丰富了植物树脂半薄切片
多色染色方法。
我们采用整体染色和切片染色两种方式完成
了上述3种染色方法的改进。染色可分为切片染
色和整体染色两种方式, 切片染色是指材料经切
片、展片、粘片、脱石蜡或脱树脂后再染色, 而
整体染色是指材料在未经切片前直接染色。相比
较而言, 切片染色时间短, 着色速度快, 染色效果
尚可, 但易染过度且切片上会留有余色, 需进行分
色处理; 整体染色时间长, 但不会有余色, 不需进
行分色处理, 染色均匀, 切片背景干净。切片染色
和整体染色为两种较为重要和普遍的染色方式,
在树脂半薄切片制备中, 已报道的文献多采用切
片染色的方式(韩莉等2003; 胡适宜和徐丽云1990;
于红丽等2004), 而整体染色方式少见有报道。在
树脂半薄切片的多色染色中, 整体染色不需脱树
脂, 避免余色产生, 切片背景干净; 切片染色需先
脱掉树脂, 否则就很不容易染上多种颜色。若树
脂未脱干净, 还会产生余色, 导致染色效果不好和
结构模糊, 影响制片质量(刘鲜林和林陶1999)。因
此 , 对树脂半薄切片进行整体染色研究很有必
要。整体染色主要需解决的难题是材料经整体染
色后, 在各级乙醇和环氧丙烷脱水、树脂渗透、
树脂包埋以及饱和的NaOH无水乙醇溶液脱树脂
等环节中会出现脱色, 我们通过采取增加整体染
色时间和在相关脱水剂、渗透剂、脱树脂剂中添
加相应染料的方式妥善解决上述问题。在本研究
中, 我们对棉花幼根的苏木精-伊红染色、棉花胚
珠的氯化铁-苏木精染色都采用了整体染色, 因而
省去了脱树脂的过程, 避免了余色产生, 切片背景
干净, 结构清晰。在棉花幼茎、叶和玉米茎的蕃
红-固绿染色中, 我们采取整体染色与切片染色相
结合的方式, 对蕃红染色采用了整体染色, 固绿染
色采用了切片染色, 所制备的树脂半薄切片木质
部呈鲜艳红色, 其他组织呈绿色, 收到良好效果。
本研究还对半薄切片树脂包埋的模具进行了
改进。文献报道的包埋模具为胶囊、橡胶包埋板
等(李和平2009)。在我们的实验中, 将胶囊改为塑
料小管, 取材广泛, 价格便宜, 有大小不同的各种
规格, 不需任何加工直接使用, 且有配套的管架,
操作很方便, 既可节省包埋剂, 又能满足不同大小
实验材料的需求。我们选取不同规格的塑料小管
作棉花的根、茎、胚珠和玉米茎的包埋模具, 用
橡胶包埋板作棉花叶的包埋模具, 解决了样品包
埋中对不同模具的需求。但对较大的纵切材料选
择胶囊、塑料小管、橡胶包埋板等作为包埋模具
都不合适, 还需进一步摸索探讨。
在采用改进的染色方法制备树脂半薄切片的
过程中, 样品包埋、脱树脂、复染固绿等环节若
操作不当易导致制片失败。样品包埋之前的树脂
渗透要完全, 否则, 切片时易破碎或结构不完整;
样品包埋应选择白天为宜, 以便随时观察并调整
材料的方向, 使之处于最佳位置, 否则无法切片。
制备蕃红-固绿多色染色的树脂半薄切片复染固绿
时需脱树脂, 在脱树脂的过程中因切片进出各种
溶液的次数多, 除了需解决脱色的问题外, 还需解
决脱片的问题, 我们通过在展片液中滴加适量蛋
清甘油而解决了脱片的问题, 展片时滴加蛋清甘
油一定要适量, 过少切片会脱落, 过多会使树脂脱
不干净, 复染固绿时易产生余色, 导致细胞结构模
糊。树脂脱净后, 复染固绿时易出现因固绿颜色
植物生理学报1212
过深而遮盖蕃红颜色的现象, 因此, 把握好固绿染
色液的浓度、染色时间至关重要。甲苯胺蓝为碱
性染料, 经酒精脱水时大部分被破坏而脱色, 因此,
经甲苯胺蓝染色后的切片不能用酒精脱水, 而以
水洗后烘干为好(刘冬娟等2003)。
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