全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (9): 1336~1346　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.10201336
收稿 2014-08-15　　修定 2014-08-20
资助 复旦大学自主创新科技项目(培育)。
* 通讯作者(E-mail: bkkuai@fudan.edu.cn; Tel: 021-65642648)。
国内大豆品种资源中滞绿(stay-green)性状的初步研究
任钧1, 王晓磊1, 高炯1, 周强2, 徐永平2, 蒯本科1,*
1复旦大学生命科学学院, 复旦大学植物研究所, 遗传工程国家重点实验室, 上海200433; 2上海华耘种业有限公司, 上海200335
摘要: 种子滞绿(stay-green)是豆科植物中的普遍现象, 最典型的例子就是孟德尔的绿粒豌豆。本文对十余份种子滞绿的大
豆品种进行了初步分析, 发现滞绿性状表型上和遗传上呈现多样性特征。所分析的滞绿变异没有显著影响到叶片衰老进程
中光合作用效率的下降, 但是明显影响衰老叶片中蛋白的降解与转运, 包括可溶性蛋白的降解与转运。我们对‘绿楂豆’等几
个品种材料的滞绿性状的遗传和分子基础进行了初步的探索, 发现滞绿性状可能是受到两对遗传基因的控制, 很可能就是
SGR1和SGR2。我们的初步分析结果提示, 大豆中受SGR1和SGR2共同调控的滞绿性状可能是源自于同一个早期变异事件。
关键词: 大豆; 滞绿; 衰老; 光合作用效率; GmSGRs
A Preliminary Study on the Stay-Green Traits of Soybean Varieties
REN Jun1, WANG Xiao-Lei1, GAO Jiong1, ZHOU Qiang2, XU Yong-Ping2, KUAI Ben-Ke1,*
1State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Plant Biology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai
200433, China; 2Shanghai Huayun Seed Company, Shanghai 200335, China
Abstract: Green seeds are widely observed in Leguminosae sp., as exemplified by classic Mendel’s green pea.
In this study, we collected dozens of soybean varieties with green seeds and preliminarily analyzed the pheno-
typic, physiological, genetic and molecular aspects of their greenness traits. Their greenness was phenotypically
classified into two general types: both cotyledons and seed coats showing greenness and only seed coat showing
greenness. Those varieties possessing green cotyledons showed stay-green phenotypes during leaf senescence,
and these stay-green traits were physiologically characterized as non-functional stay-green, i.e. net photosyn-
thesis rates of senescent leaves declining as usual. However, both total and soluble proteins were significantly
retained in their senescent leaves. We also preliminarily analyzed the inheritance of greenness traits in
‘Lvzhadou’ as well as in a few other varieties through their crosses with ‘William 82’, and found that they were
principally regulated by two genetic loci. By PCR-based cloning techniques, we found that these greenness
traits were associated with loss-of-function mutations in GmSGR genes across species. Along with a similar
finding reported recently, our results imply that stay-green phenotypes caused by loss-of-function mutations in
GmSGR genes are probably derived from the same mutation events.
Key words: soybean; stay-green; senescence; photosynthesis rate; GmSGRs
研究报告 Original Papers
豆科植物中普遍存在种子滞绿(stay-green)的
现象 , 最著名的例子就是孟德尔豌豆的绿粒性
状。上个世纪初, 研究人员也开始分析研究了大
豆中的种子滞绿性状。他们通过对杂交后代的分
析, 鉴别出了4个位点的突变会导致滞绿, 分别为
D1、D2、G和cytG。其中D1、D2为隐形遗传, 双
基因均突变才导致种子滞绿; G与D1连锁, 其突变
能导致种皮滞绿; cytG是细胞质遗传的位点(Terao
1918; Woodworth 1921)。Guiamet和Nooden在分析
它们的生理表型时发现, Gd1d2和cytG不影响衰老
叶片光合作用速率的下降, 但是Gd1d2几乎阻止所
有类囊体膜蛋白降解, cytG只是部分阻滞它们的降
解, 两种突变在衰老过程中都表现出叶绿素降解
受阻现象(Guiamét等1990, 1991)。Gd1d2还能抑制
可溶性蛋白的降解, 叶片掉落时还滞留大量的核
酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶蛋白(Rubisco), 但是
cytG只能延缓可溶性蛋白的降解过程(Guiamét和
Giannibelli 1996)。上述分析表明, 大豆种子的滞
任钧等: 国内大豆品种资源中滞绿(stay-green)性状的初步研究 1337
绿与叶片的滞绿是相关联的, 是由遗传因素导致
的叶绿素及其相关蛋白的积累。
近年来, 在叶绿素降解代谢的研究方面取得
了许多实质性乃至突破性的进展, 叶绿素降解的
关键生化途径已基本明晰(Hörtensteiner和Kräutler
2011; Hörtensteiner 2013)。叶绿素b被转化为叶绿
素a后才能够进入降解途径。叶绿素b到叶绿素a的
转换是一个两步反应过程, 分别受到叶绿素b还原
酶(chlorophyll b reductase)和7-羟甲基叶绿素a还原
酶(hydroxymethyl chlorophyll a reductase, HCAR)
的催化(Horie等2009; Sato等2007; Meguro等2011;
Sakuraba等2013)。叶绿素降解的第一步是叶绿素
a的脱镁, 产生脱镁叶绿素a (Phein a); Phein a在脱
镁叶绿素水解酶(pheophytin pheophorbide hydro-
lase, PPH)的作用下脱去植基, 形成脱镁叶绿酸a
(Pheide a) (Schelbert等2009); Pheide a在脱镁叶绿
酸a单加氧酶(pheiophorbide a oxygenase, PAO)的作
用下氧化开环, 生成红色叶绿素降解产物(red chlo-
rophyll catabolite, RCC) (Pružinská等2003)。PAO
催化的卟啉环氧化开环是叶绿素降解的关键步骤,
该步骤使得叶绿素降解产物最终丧失绿色, 这一
降解途径因此被称之为PAO途径(Matile等1999)。
RCC在红色降解产物还原酶(red chlorophyll catab-
olite reductase, RCCR)的作用下还原为初级荧光叶
绿素降解产物(primary fluorescent chlorophyll
catabolite, pFCCs) (Mach等2001)或epi-pFCCs
(Pružinská等2007)。pFCCs或epi-pFCCs经过一系
列修饰后以终产物NCCs (nonfluorescent chloro-
phyll catabolites) (Hörtensteiner和Kräutler 2011)或
NDCCs (nonfluorescentdioxobilin-type chlorophyll
catabolites)的形式贮藏于液泡内(Christ等2013)。
整个降解途径中除了脱镁的机制尚不清楚外, 其
他步骤已基本被阐明。
然而, 关于叶绿素降解的调控机制依然知之
甚少。SGR1 (STAY-GREEN 1)/NYE1 (NON-YEL-
LOWING 1)的鉴别是近年来叶绿素降解调控研究
中的一个里程碑事件。Ren等(2007)通过图位克隆
从拟南芥中鉴别出了AtNYE1; Park等(2007)和
Jiang等(2011)通过图位克隆从水稻中也鉴别出了
AtNYE1的同源基因OsSGR。此外, 在甜椒、柑橘、
番茄和苜蓿等物种中, 也先后发现SGR1/NYE1不
仅调控衰老叶片中叶绿素的降解, 也调控种子/果
实成熟过程中叶绿素的降解(Alós等2008; Barry等
2008; Zhou等2011)。特别有意思的是, 上述豌豆和
大豆上的滞绿性状也是由SGRs/NYEs基因变异所
导致的(Sato等2007; Aubry等2008; Fang等2014)。
本文对收集到的十余份种子滞绿的大豆品种
进行了初步分析, 发现滞绿性状存在表型上的多
样性和遗传上的复杂性, 滞绿变异并没有显著影
响叶片的衰老进程, 但是明显影响到衰老叶片中
蛋白的降解与转运, 包括可溶性蛋白的降解与转
运。在此基础上, 对‘绿楂豆’等几个品种材料的滞
绿性状的遗传, 特别是滞绿的分子基础进行了进
一步的分析研究, 发现所分析的材料中的滞绿性
状可能是由两对基因控制的, 且很可能就是SGR1/
NYE1和SGR2/NYE2。我们的初步分析结果显示,
大豆中受SGR1和SGR2共同调控的滞绿性状可能
是源自于同一个早期变异事件。
材料与方法
1 实验材料
从中国种质资源中心获取了34份大豆材料, 其
中αA属于cytG型突变体, αB属于Gd1d2型突变体。
另获中国农科院傅永福研究员馈赠大豆测序品种
‘William 82’。表1列出本文研究的13份材料。
2 实验材料种植
夏季大豆种植在江苏省太仓市复旦大学种植
基地内(北纬31.562082º, 东经121.15787º), 种植时
间为2011年5月下旬, 7月上旬到8月初开花, 9月下
旬收获, 不同品种材料生育期差异明显。冬季大
豆种植在海南省三亚市南滨农场南繁基地内, 播
种时间为当年12月份上旬, 次年3月上旬收获大豆,
由于光周期改变, 生长周期变短, 不同品种间无明
显差异。在温室中, 种植在直径16 cm, 深13 cm的
圆钵内, 每钵3颗。培养室采取16 h光照, 8 h黑暗,
光照强度约160 μmol·m-2·s-1, 温度恒定在(23±2) ℃,
通风良好。
3 叶绿素含量测定
取冻存在–80 ℃冰箱的叶片, 于液氮中研磨成
均一的粉末。低温下称取约0.1 g粉末, 加入3 mL
丙酮:乙醇(95:5), 混匀后静止10 min, 期间超声处
理3次, 每次30 s。室温12 000×g离心10 min, 取上
清测定645 nm和663 nm处的吸光度, 根据以下公
式计算叶绿素含量。
植物生理学报1338
叶绿素a (mg·mL-1)=0.0127A663–0.00269A645
叶绿素b (mg·mL-1)=0.0229A645–0.00468A663
4 光合作用效率测定
采用LI-COR公司的LI-6400XT-40型荧光叶室
光合作用测定仪测定叶片光合作用效率。叶室面
积2 cm2, 光照强度120 μmol·m -2·s -1, 流速300
μmol·s -1, 叶面温度24 ℃, 其余参数选择默认设
置。自然生理状态下, 关灯2 h后测定Fm、Fo; 开灯2
h后测定Fm′、Fo′、Fs′、净光合效率等参数。黑暗
处理时, 首先在暗处测定Fm、Fo, 光适应15 min后,
继续测定Fm′、Fo′、Fs′、净光合作用效率等值。
5 蛋白含量测定
取冻存于–80 ℃冰箱的叶片, 于液氮中研磨成
均一的粉末。低温下称取粉末约0.1 g, 加入3 mL
提取液(50 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 6.8, 0.05% Triton-
100), 混匀后静止10 min, 期间超声处理3次, 每次
30 s。室温12 000×g离心10 min, 取上清。
采用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(生
工生物)测定蛋白含量, 标准曲线制作及测定方法
均依据试剂盒的使用说明。
6 Western检测核酮糖-1, 5-二磷酸羧化/加氧酶大
亚基(RubLS)
取冻存在–80 ℃冰箱的叶片, 液氮研磨成均一
的粉末。低温下精确称取粉末0.1 g, 加入500 μL上
样缓冲液, 煮沸10 min, 室温12 000×g离心, 取上清,
电泳时加样2 μL。SDS-PAGE电泳结束后, 蛋白转
移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。RubLS (Agrisera)
的是多克隆抗体, 稀释3 000倍。二抗采用AP-山羊
抗兔抗体(碧云天), 稀释4 000倍。其余操作均按照
常规方法进行。
7 相关基因的PCR扩增
7.1 同源基因分析比对、引物设计
在DOE Joint Genome Institute (http://www.jgi.
doe.gov/)及NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)网
站上, 利用tBlastn方法比对序列。引物设计时在
cds区上下游或者两端设计引物, 基因GmSGR1-1
和GmSGR2-1的引物序列见表2。
7.2 RNA抽提
采用Trizol (Invitrogen)试剂提取RNA, 操作按
照说明书进行。
7.3 反转录
采用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (TaKa-
Ra)生成cDNA, 操作均按照试剂盒说明书进行。
7.4 PCR、连接、转化、测序
采用KOD-Plus-Neo (TOYOBO)扩增大豆基
因, 操作按试剂盒说明进行。电泳后采用DNA凝
胶回收试剂盒(AXYGEN)回收PCR产物, 操作按试
剂盒说明进行。采用pMD®19-T Vector (TaKaRa)试
剂盒连接PCR产物。
8 GmSGR1和GmSGR2的功能验证
8.1 载体构建
设计含有KpnI和BamHI的酶切位点的引物(见
表2)扩增GmSGR1、GmSGR2和AtNYE1基因的
CDS序列, 酶切后插入pCHF3载体中。测序验证
表1 大豆资源材料编号及名称
Table 1 Soybean materials used in this study
编号 子叶颜色 品种名称 种质资源编号 生育期/d 原产地
αA 绿 ‘L62-1027’ WDD00084 140 美国
αB 绿 ‘L64-2545’ WDD00087 144 美国
αC 绿 ‘绿楂豆’ ZDD01367 135 辽宁岫岩
αD 绿 ‘大绿豆’ ZDD09006 106 山西怀仁
αE 绿 ‘青皮豆’ ZDD14370 132 江西萍乡
αF 绿 ‘双青豆’ ZDD19989 111 安徽阜阳
αJ 绿 ‘绿皮黄豆’ ZDD07887 121 内蒙古兴和
γA 黄 ‘William 82’ WDD00585 140 美国
γB 黄 ‘L61-4222’ WDD00003 141 美国
γC 黄 ‘小金黄’ ZDD01150 123 辽宁宽甸
γD 黄 ‘六月豆’ ZDD05947 112 浙江天台
γE 黄 ‘八月白’ ZDD06120 129 浙江诸暨
γF 黄 ‘二黄皮黄豆’ ZDD08577 120 山西阳高
任钧等: 国内大豆品种资源中滞绿(stay-green)性状的初步研究 1339
后, 将质粒转化进入农杆菌GV3101中。
8.2 烟草叶片瞬时表达分析
选择生长了3~4周烟草植株, 取完全展开的嫩
叶作为侵染材料。先在烟草叶片下表皮的两条侧
脉之间用注射器针头轻轻扎一个小孔, 用1 mL不
带针头的注射器吸取含有目的基因GmSGR1、
GmSGR2和AtNYE1的表达载体及空载体pCHF3的
农杆菌GV3101重悬菌液, 从烟草下表皮经小孔将
菌液缓缓注射进叶肉中, 烟草注射菌液后继续在
正常条件下生长2~3 d, 直至正对照叶片开始出现
黄化表型。
8.3 拟南芥nye1-1的稳定转化
将长势良好的拟南芥nye1-1突变体植株打顶
2~3次, 增加其花蕾数量,。采用花蕾侵染法进行上
述目的基因表达载体的遗传转化。转化菌株为农
杆菌GV3101, 转化质粒为pCHF3的空载体和携带
有GmSGR1、GmSGR2和AtNYE1基因的表达载
体。收集转化后的拟南芥种子, 用75%的酒精灭菌
后铺于含有50 mg·L-1卡那霉素的MS培养基上, 经
抗性筛选获得疑似拟南芥转基因植株, 然后抽提
DNA进行PCR鉴定。从生长4周的F2代纯合植株上
摘取第7片叶, 置于湿润培养皿中黑暗处理4 d以后
观察表型。
实验结果
1 大豆种子与叶片的滞绿表型
为了研究大豆上的滞绿性状, 我们从中国种
质资源中心索要了34份大豆种质资源材料。仔细
观察比较这34份大豆材料, 分辨出了种子子叶和
种皮均呈现滞绿的品种(14个, 以α+大写英文字母
编号)和仅有种皮滞绿的品种(12个), 其余品种的
子叶和种皮均表现为正常黄色, 与测序品种‘Wil-
liam 82’的表型一致(8个, 以γ+大写英文字母编
号)。进一步的分析发现, 种子子叶滞绿品种的叶
片和果荚在自然衰老时也表现滞绿, 甚至脱落的
叶片也表现明显的滞绿; 成熟叶片黑暗处理2周后
也表现显著滞绿(图1)。
我们测定了田间种植大豆开花期成熟叶片和
成熟期即将脱落叶片(离层已形成, 叶片轻触即落)
中叶绿素的含量。如图2-A~C所示, 六个正常品种
中, γA的总叶绿素含量下降幅度最大, 达到96%, 其
次是γE、γB、γD、γF, 最小的是γC, 67%; 叶绿素a
与叶绿素b的下降趋势与总叶绿素趋势相似 ,
γA>γE>γB>γD>γF>γC, 下降幅度都大于55%。在
六个滞绿品种中, αB、αC、αD、αE、αF的总叶绿
素含量降幅小于7%, 甚至没有出现明显下降; 叶绿
素a和b的下降趋势也是如此。αA的总叶绿素含量
降幅达到46%, 其中叶绿素a的降幅达到58%, 叶绿
素b的降幅达到22%, 与其他五个滞绿品种中的叶
绿素降解情况不太一致, 可能是因为αA属于cyt G
型的突变。
2 黑暗处理叶片中的叶绿素降解和光合速率下降
趋势分析
我们选取了生长5周的大豆(五叶一心)的第一
张复叶进行黑暗处理(叶片放置在湿润的平皿内,
外部用铝箔包裹), 在0、5、9和13 d时取叶片测定
叶绿素含量和光合作用效率。如图3-C所示, 正常
品种γB、γD、γE和γF中的叶绿素水平在黑暗处理
表2 引物序列
Table 2 Primer sequences used in this study
扩增基因 引物序列(5′→3′)
GmSGR1-1 上游: CCCCACACTCCTCCAGTACTTGA
下游: GCAGCATCCCCGTAACTGTGAA
GmSGR1-2 上游: ATAGGTACCATGTGTACTCTCACAACTGTTCCTG
下游: ATAGGATCCTTATAGATTTTGTTGGGTCCCAATC
GmSGR2-1 上游: TGAATTTGCCAGCATCCCTGTA
下游: GCTCCCACACTCCTCCACTACTT
GmSGR2-2 上游: ATAGGTACCATGGGTACTCTAACAACTGTTCCTG
下游: ATAGGATCCTTATAGACTTTGTTGGGTCTCAATC
AtNYE1-1 上游: ATAGGTACCATGTGTAGTTTGTCGGCGATTA
下游: ATAGGATCCCTAGAGTTTCTCCGGATTTGGA
植物生理学报1340
图1 大豆品种材料的滞绿表型
Fig.1 Stay-green phenotypes of soybean varieties under different senescence scenarios
A: ‘绿楂豆’叶片(αC)自然衰老时的滞绿表型(左侧), 测序品种‘William 82’ (γA)作为参照(右侧, B、C同); B: ‘绿楂豆’叶片黑暗诱导衰
老时的滞绿表型; C: ‘绿楂豆’果荚自然衰老时的滞绿表型; D: 几种种子滞绿大豆掉落叶片的滞绿表型; E: 几种种子滞绿的大豆品种材料。
图2 大豆成熟和衰老叶片中的叶绿素和蛋白含量
Fig.2 Contents of chlorophyll and total protein in mature and senescent leaves
A: 总叶绿素含量; B: 叶绿素a含量; C: 叶绿素b含量; D: 总蛋白含量。
任钧等: 国内大豆品种资源中滞绿(stay-green)性状的初步研究 1341
5 d前后已经显著下降, 13 d时下降幅度分别达到
51%、74%、44%和59%。γA叶片中的总叶绿素
含量较低, 降解速度也较缓慢, 13 d时降幅达到
27%; γC叶片中的总叶绿素含量也比较低, 处理9 d
后没有检测到明显的降解迹象, 13 d时出现明显的
降解, 降幅为22%。六个滞绿品种中, αA中的总叶
绿素含量较低 , 但是降解幅度在1 3 d时与α C
(16%)、αD (13%)、αE (13%)和αF (16%)中的降幅
相当, 达到12%; αB中的降幅最小, 13 d时为6%。
图4 成熟与衰老叶片中的酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶大
亚基含量的Western分析
Fig.4 Western analysis of RubLS contents in mature and
senescent soybean leaves
上述结果表明, 黑暗处理过程中滞绿品种材料中
的叶绿素降解速率也显著低于正常品种材料中的
降解速率, 但是其显著程度明显低于自然衰老进
程中的差异。与叶绿素降解趋势不同, 滞绿材料
中的光合作用效率的下降与正常材料中的相比没
有明显的延缓趋势, 其中αA的光合作用效率的下
降速率甚至还快于其他材料(图3-A、B), 据此推测
上述滞绿品种材料的滞绿性状属于非功能滞绿。
3 滞绿性状导致衰老叶片中蛋白滞留
为了分析非功能型滞绿对衰老叶片中蛋白降
解与转运的影响, 本研究首先测定了田间种植的
成熟叶片和自然衰老叶片(结果1中的材料样品)的
总蛋白含量变化。如图2-D所示, 六个正常品种衰
老叶片中总蛋白的下降幅度均较大, 达到70%左
右; 滞绿品种间的差异较大, 其中αF中的总蛋白下
降最多, 达到了65%; 其次是αA、αE和αC, 分别为
62%、50%和44%; αB和αD中的下降最少, 均在
25%左右。在C3植物叶片中, 约有50%的可溶性蛋
白是核酮糖-1,5-二磷酸羧化 /加氧酶(Rubisco)
(Feller等2008)。我们采用Western杂交的方法分析
了上述两种叶片中的Rubisco大亚基(RubLS)含量
的变化。如图4所示, 成熟叶含有大量的RubLS, 衰
老叶片中的则被显著降解。正常品种γA、γB、
γD、γE、γF衰老叶片中的RubLS条带几乎不可见,
仅γC衰老叶片中滞留比较多的RubLS, 但也明显低
于多数滞绿品种中的滞留量; 6个滞绿品种衰老叶
片中的RubLS滞留非常明显, 都明显多于正常品种
中的滞留量。上述数据显示, 非功能型滞绿性状不
仅抑制了大豆衰老过程叶片中总蛋白的降解与转
运, 也影响其中可溶性蛋白的降解与转运过程。
图3 黑暗处理条件下大豆叶片的光合效率和叶绿素含量下
降趋势
Fig.3 Declines of net photosynthetic rates and chlorophyll
contents in dark-treated leaves
A: 净光合作用效率的下降趋势; B: PSII最大量子产率(Fv/Fm)
的下降趋势; C: 叶绿素含量的下降趋势。
植物生理学报1342
4 非功能型滞绿性状分子基础的初步分析
在其他物种上的研究发现, 非功能型的滞绿
性状均是由叶绿素降解途径关键酶基因或调控基
因的变异所导致的。由于叶绿素降解途径主要相
关基因已经基本被克隆出来了(Hörtensteiner和
Kräutler 2011; Hörtensteiner 2013), 因此我们首先
采用了同源克隆的技术途径鉴别大豆滞绿性状的
关键调控基因。大豆是古四倍体, 许多基因具有
多个拷贝。如图5-A所示, PPH和PAO分别有3个拷
贝, SGR/NYE有5个拷贝。根据以往在拟南芥和玉
米等物种上的研究结果, PAO和RCCR的突变体叶
片在光下会产生坏死表型(Mach等2001; Pružinská
等2003), 我们所有的滞绿材料都没有坏死表型, 所
以暂且认定这2个基因变异的可能性不大, 重点关
注了SGR1/NYE1、SGR2/NYE2、NYC1、NYC2、
PPH1和PPH2。在αC中扩增出的基因中, NYC2和
PPH2中没有发现变异, NYC1和PPH1中零星出现
缺失或移码变异, SGR2/NYE2中重复鉴别出了182
位T缺失导致的移码变异(图5-B)。在扩增SGR1/
NYE1时, 在野生型中能扩增出完整的基因序列, 但
是在滞绿品种中却一直没有能够正常扩出; 经过
分段扩增和测序发现, 在第一个内含子内发现了3
图5 大豆叶绿素降解代谢与调控基因在染色体上的分布及滞绿品种中SGR基因中的变异
Fig.5 Distributions of soybean chlorophyll degradation-associated genes on chromosomes and mutations of SGR genes in stay-
green varieties
A: 大豆叶绿素降解代谢与调控基因在染色体上的分布; B: 滞绿品种中SGR1第一个内含子缺少ATT三个碱基、第2端外显子存在同义
突变, SGR2外显子中182位缺少一个T导致移码突变。
任钧等: 国内大豆品种资源中滞绿(stay-green)性状的初步研究 1343
个碱基的缺失, 在第2个内含子内鉴别出了2个单
核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,
SNP) (图5-B)。
αC中SGR2编码区182位的单碱基缺失导致了
移码使得该基因的翻译提前终止, 推测该基因已
经失去了功能。利用该移码作为分子标记对滞绿
材料进行了扫描检测, 我们发现在γA与αC的杂交
后代F2:3中的10个滞绿株系中均为纯合移码; 另外,
在αB、αD和αF的滞绿品种中也发现了相同的移
码变异。我们也利用SGR1内含子中的SNP作为多
态性标记对γA与αC的杂交后代F2:3中的10个滞绿
株系进行了检测分析, 发现在其中8株滞绿株系为
纯合, 2株为杂合。上述试验表明, SGR基因的变异
可能是导致这类品种滞绿性状的原因。
此外, 我们利用了烟草叶片瞬时表达系统检
测了从‘William 82’中扩增出的GmSGR1和GmS-
GR2的功能。初步分析发现, 35S启动子驱动的
GmSGR1和GmSGR2过表达能够加速烟草叶片中叶
绿素的降解, 但是其活性远低于拟南芥AtNYE1/
SGR1的活性。我们还利用上述载体转化了拟南芥
nye1-1突变体, 发现35S启动子驱动的GmSGR1和
GmSGR2过表达能够明显互补nye1-1滞绿表型。
讨　　论
1 大豆非功能型滞绿性状表型的多样性和遗传上
的复杂性
大豆种子的滞绿性状可以分为种皮和子叶都
滞绿与仅种皮滞绿两种基本类型; 进一步的分析
发现, 种子子叶滞绿的品种其叶片和果荚在自然
衰老时也表现滞绿, 成熟叶片黑暗处理2周后也表
现显著滞绿。这两种滞绿特性均能稳定遗传。美
国学者通过对他们资源材料及其杂交后代的分析,
鉴别出了隐形遗传的基因(D1、D2)、仅调控种皮
滞绿性状的基因(G)和细胞质遗传位点(cytG) (Terao
1918; Woodworth 1921)。我们也用6个滞绿品种
(αB、αC、αD、αF、αG和αJ)与测序品种‘William
82’配制了12个正反交组合, 收获了9个组合的F1代
种子。部分以滞绿品种为母本的F1代种子呈现淡
绿表型, 部分以‘William 82’为母本的F1代种子也呈
现淡绿表型(淡绿种子的子叶也可能为黄色; 因为
种子太少, 没有剥开验证), 它们的果荚也多呈棕黑
色(图6), 显示其中的叶绿素降解受到了一定程度
的阻滞。这些观察表明滞绿性状可能为半显性遗
传, 这与拟南芥中nye1-1与野生型杂种F1的叶片表
型类似(Ren等2007)。有意思的是, 这些杂种F1代
的叶片自然衰老时均表现出正常的黄化, 与‘Wil-
liam 82’无明显差异, 显示出了这些材料上的滞绿
性状在杂种后代中存在一定程度上的组织/器官特
异性或遗传调控上的复杂性。F2代种子颜色出现
了分离, 在收获到的杂种中, 出现两种分离表型: αJ
与‘William 82’的杂种后代呈现绿和黄的两种表型,
其余品种均是绿和淡绿两种表型分离(图6-B), 暗
示它们可能是由不同性质基因的突变所致。在这
些组合中, F2代两种表型种子的比值在1:9到1:20之
间(表3); 因各组合收获到杂种种子比较少, 不足以
设计重复试验, 因而尚不能对数据进行t-测验分
析。大豆为古四倍体植物, 许多基因都有两个拷
贝, 推测这些品种上的滞绿性状可能是由双拷贝
基因的突变所致(非连锁情况下的理论分离比为
1:15)。
2 国内大豆品种资源材料的滞绿性状可能与
SGRs/NYEs的功能缺失有关
我们对国内滞绿品种‘绿楂豆’ (αC)进行了重
点分析, 鉴别出了SGR2的182位T缺失, 导致翻译提
前终止, 该变异在‘William 82’ב绿楂豆’的F2代分
离群体中与滞绿性状完全关联。进一步的分析发
现, 美国引进的滞绿品种‘L64-2545 ’(αB, 基因型为
Gd1d2)及其他两个国内滞绿品种大绿豆(αD)和双
青豆(αF)在该位点也发生了同样的变异。这一发
现与Fang等新近报道在‘CLARK’品种中鉴别出的
变异位点完全一致(Fang等2014)。在SGR1的PCR
扩增中, 一直没有能够扩增出完整的基因组片段,
试验仍在进行中。通过分段扩增鉴别出的第二个
内含子内的两个SNPs在‘William 82’ב绿楂豆’的F2
代分离群体中与滞绿性状也高度关联。结合上述
初步遗传分析数据以及在烟草叶片和拟南芥nye1-1
突变体中对‘William 82‘中GmSGR1和GmSGR2的
功能确认, 初步推测所分析的大豆滞绿资源材料
中的滞绿性状可能主要受到SGRs/NYEs基因的
调控。我们的初步分析结果提示, 国内外大豆上
的许多滞绿变异可能是源自于相同的早期变异
事件。
植物生理学报1344
表3 F2代杂种分离统计表
Table 3 The statistics segregation seeds of hybrids F2
杂交组合 比例 表型 杂交组合 比例 表型
＼ ＼ ＼ γA×αB 4:52 绿: 淡绿
αC×γA 8:81 绿: 淡绿 γA×αC 24:432 绿: 淡绿
＼ ＼ ＼ γA×αD 5:99 绿: 淡绿
αF×γA 34:398 绿: 淡绿 γA×αF 10:90 绿: 淡绿
αG×γA 4:63 绿: 淡绿 ＼ ＼ ＼
αJ×γA 20:264 绿: 黄 γA×αJ 27:267 绿: 黄
图6 滞绿品种与‘William 82’杂种后代种子和果荚颜色
Fig.6 The seeds and capsule phenotype of the hybrids of stay-green variety and ‘William 82’
A: 杂种F2代种子颜色, 左边为绿色种子, 右边为淡绿或黄色种子; B: 杂种F1果荚颜色。
3 大豆品种非功能型滞绿性状被人工选育保留的
原因分析
叶片的非功能型滞绿不仅会阻滞衰老进程中
叶绿素的降解, 而且也会阻止与叶绿素结合的蛋
白复合体的降解(Thomas和Howarth 2000; Hörten-
steiner 2009)。我们对大豆滞绿品种材料自然衰老
叶片中的滞留蛋白分析发现, 滞绿性状不仅使得
衰老叶片中的总蛋白显著滞留, 而且也导致主要
可溶性蛋白核酮糖-1, 5-二磷酸羧化/加氧酶大亚基
的明显滞留。成熟期衰老叶片中营养物质的再利
用, 特别是氮素的再利用, 是种子快速发育的最重
要营养物质来源; 大豆成熟期整株叶片快速衰老,
可能有助于叶片中的营养物质集中转运到种子
中。小麦和玉米等种子中有50%~90%的蛋白源自
于衰老叶片中的氮素动员与再利用 (Kichey等
2006), 大豆种子中的蛋白含量远高于禾谷类种子
任钧等: 国内大豆品种资源中滞绿(stay-green)性状的初步研究 1345
中的蛋白含量, 可以推测在其发育与成熟阶段需
要从衰老的叶片中导入大量的氮素, 因此影响衰
老叶片中蛋白降解与转运的滞绿性状对产量和品
质性状的发育理应是不利的。有研究表明, 非功
能型滞绿性状的确会导致作物产量的降低(Luquez
和Guiamét 2001)。令人费解的是, 经过了上千年
的人工选育改良, 大豆上仍然保留了许多非功能
型滞绿的品种, 这激起了我们的好奇心。一种可
能的解释是人们因为“钟情于”青豆的美感而淡化
了滞绿对产量和品质的影响, 另一种可能性是滞
绿性状不会对产量和品质产生明显的负面影响,
甚至还可能有有益的效应。我们对黑暗处理下大
豆叶片净光合效率的分析发现, 总体上并未观察
到滞绿品种光合效率下降延缓的现象; 但是, Fang
等(2014)对近等基因系突变体d1d1和d2 (CLARK
背景中)衰老叶片的净光合速率分析发现, 滞绿突
变的确能够延缓自然衰老进程中光合效率的下降,
这与之前的研究报道不一致 (Guiamét等1990,
1991)。这些数据上的差异可能反映了黑暗诱导衰
老与自然衰老的差异, 也可能是遗传背景的效应,
甚至可能是试验的准确性和精确性所导致的。创
建不同遗传背景下的近等基因系材料或转基因株
系将会有助于明确衰老叶片中蛋白降解与转运的
阻滞与产量/品质性状的形成之间的关系, 以及由
SGRs基因变异导致的滞绿与衰老叶片光合速率下
降的关系, 进而有助于阐明滞绿性状对大豆产量
和品质性状的确切影响。
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