全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (12): 1880~1888　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.10401880
收稿 2014-11-25　　修定 2014-12-04
资助 国家自然科学基金(31270370和31160262)、福建省生物学
省级重点学科建设项目、2014年国家级大学生创新创业
训练项目(201410399018)和泉州师范学院大学生科研基金
项目(2014DKJ05)。
* 共同通讯作者(E-mail: dwf320@163.com, Tel: 0595-
22919563; E-mail: txmh@163.com, Tel: 0475-8314677)。
蓖麻质膜水通道蛋白PIP1.3在仓鼠卵巢细胞中的转运功能
董乐1, 戴聪杰1, 王芳1,*, 王云2,*, 朱国立3, 谢小宾1, 许珊珊1, 刘灿阳1, 林婷1
1泉州师范学院化学与生命科学学院, 福建泉州362000; 2内蒙古民族大学农学院, 内蒙古通辽028042; 3通辽市农业科学院,
内蒙古通辽028015
摘要: 为研究蓖麻质膜水通道蛋白PIP1.3的转运功能, 采用RT-PCR技术扩增基因PIP1.3的全长编码区cDNA序列(861 bp), 将
该序列亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His A, 酶切、测序分析表明, 重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His阅读框架正
确。将pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His和连接氯离子敏感性绿色荧光蛋白突变体(EYFP-H148Q-V163S)的pcDNA3.1Hygro-EY-
FP-H148Q-V163S重组质粒稳定共转染至中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞中, RT-PCR和Western blot分析表明,
PIP1.3的mRNA和蛋白质在选定CHO细胞克隆中高表达。分别通过荧光法和同位素标记的14C-甘油摄入实验测定该CHO细
胞对水分和甘油的通透性, 结果表明, 该CHO细胞表达的PIP1.3对水分子的转运能力很低, 但能选择性转运甘油。
关键词: 蓖麻; 质膜水通道蛋白; 真核表达; 转运功能
Castor Plasma Membrane Aquaporin (PIP1.3) in Vitro Transprot in Chinese
Hamster Ovary
DONG Le1, DAI Cong-Jie1, WANG Fang1,*, WANG Yun2,*, ZHU Guo-Li3, XIE Xiao-Bin1, XU Shan-Shan1, LIU Can-Yang1, LIN Ting1
1College of Chemistry and Life Science, Quanzhou Normal University, Quanzhou, Fujian 362000, China; 2College of Agriculture,
Inner Mongolia University for Nationlities, Tongliao, Inner Mongolia 028042, China; 3Institute of Agricultural Science of Tongli-
ao City, Tongliao, Inner Mongolia 028015, China
Abstract: The encoding sequence of plasma membrane aquaporin gene (PIP1.3) in castor (Ricinus communis
L.) was amplified with RT-PCR and inserted into pcDNA3.1/Myc-His A vector, double enzyme digestion analy-
sis and DNA sequencing confirmed that recombination plasmid was successfully constructed. pcD-
NA3.1PIP1.3-Myc-His and pcDNA3.1Hygro-EYFP-H148Q-V163S plasmids linking Cl--sensitive EYFP mutant
(EYFP-H148Q-V163S) were transfected in CHO cells. The stable transfection of CHO cells was analysis with
RT-PCR and Western blot. The results showed that PIP1.3 mRNA and protein were overexpressed in cell line
screened. Permeabilities of PIP1.3 expressing CHO cells for water and glycerol were measured respectively by
fluorescence method and carbon labeling experiment. The results showed that permeability of PIP1.3 express-
ing CHO cells for water was low, but high for glycerol.
Key words: castor (Ricinus communis L.); plasma membrane aquaporin; mammalian expression; permeability
水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一族细胞膜
上选择性高效转运水分子的特异蛋白孔道。AQPs
属主要内在蛋白(major intrinsic proteins, MIPs)家
族成员。序列分析显示, MIP基因内部由两个同向
重复单元(tandom repeats)组成, 表明MIP可能由基
因串联重复进化而来(Wistow等1991)。每个单元
含有一个高度保守的Asn-Pro-Ala (NPA)氨基酸组
单元, 拓扑结构表明, 整个分子含有6个跨膜结构
域(TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6), 氨基
酸链在膜两侧形成5个环形结构(A、B、C、D、
E) (Heymann和Engel 1999)。AQPs在植物种子萌
发、细胞伸长、气孔运动、受精等过程中调节水
分的快速跨膜运输, 有些AQPs在植物逆境应答中
起着重要作用(王芳等2011)。目前, 在拟南芥、玉
米、水稻等多种植物中已发现并克隆了AQPs。已
经测序的植物基因组揭示了植物AQPs是一个超家
族(Chaumont等2001)。根据氨基酸序列同源性和
亚细胞定位通常将植物AQPs划分为5个家族: 质膜
董乐等: 蓖麻质膜水通道蛋白PIP1.3在仓鼠卵巢细胞中的转运功能 1881
内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)
(Kammerloher等1994)、液泡膜内在蛋白(tonoplast
membrane intrinsic proteins, TIPs) (Karlsson等2000)、
类Nodulin26 (NOD26)膜内在蛋白(NOD26-like
intrinsic proteins, NIPs) (Weaver等1991)、小的碱性
膜内在蛋白(small basic intrinsic proteins, SIPs)
(Maurel 1997)和类GlpF (glycerol facilitator)膜内在
蛋白(GlpF-like intrinsic proteins, GIPs) (Gustavsson
等2005; Postaire等2008; Wudick等2009)。在苔藓
(Danielson和Johanson 2008)和番茄(Sade等2009)中
还存在XIPs (X intrinsic proteins)。PIPs分为PIP1和
PIP2两个亚类(Kammerloher等1994), 二者的区别
在于PIP1比PIP2具较长的N-端和较短的C-端, 而且
在序列中各有相应的保守氨基酸(Higuchi等1998)。
植物AQPs除转运水分外, 能允许甘油(Biela
等1999)、硼酸(Dordas等2000)、尿素(Gaspar等
2003; Gerbeau等1999)、铵/氨(Holm等2005)、二氧
化碳(Uehlein等2003)、甲醛(Uehlein等2003)、过
氧化氢(Henzler和Steudle 2000)、亚砷酸盐(Ma等
2008; Bienert等2008)、重金属(Mahdieh等2008)、
乳酸(Choi和Roberts 2007)和少量的乙醇(Schütz和
Tyerman 1997)等多种中性小分子的通透。AQPs
的功能检测目前最常用的是非洲爪蟾卵母细胞检
测系统。在应用非洲爪蟾卵母细胞系统体外检测
AQPs转运水分的能力时, PIP1转运水的能力一般
没有或很低(Kammerloher等1994), 而PIP2比PIP1
的大得多(Kammerloher等1994)。哺乳动物水通道
蛋白根据其转运功能特性分为2个亚家族: 水选择
性通道(aquaporins)和水-甘油通道(aquaglyceropo-
rins)。前者对水分子的通透性具有高度选择性, 如
大鼠AQP1; 而后者除对水分子通透外, 对甘油和
尿素等中性小分子也具有通透性, 如大鼠AQP3
(Wallace和Roberts 2004)。大肠杆菌甘油通道蛋白
(glyceroporin, GlpF)能专一转运甘油(Wallace和
Roberts 2004)。植物AQPs中发现类GlpF膜内在蛋
白, 例如, 球蒴藓中PpGIP1;1 (Danielson和Johanson
2008; Gustavsson等2005)、豌豆中PsPIP1;1 (Sch-
uurmans等2003)及烟草中NtAQP1和NtTIPa (Biela
等1999)均能转运甘油, 它们可能在特定组织部位
表达后参与渗透平衡。
蓖麻属大戟科蓖麻属双子叶一年生或多年生
草本植物。蓖麻具有耐旱、耐瘠薄、耐盐碱、抗
病虫害、适应性强等特点, 对栽培条件要求不高,
耕作较为粗放, 因此联合国已将其列入三大抗旱
作物之一而在世界干旱地区推广(郝卫国2008)。
中国是全球第二大蓖麻生产国(方平平等2011)。
中国蓖麻主要分布在内蒙古、吉林、辽宁、山
西、陕西、山东等北方省区, 以旱作少耕栽培方
式生产(王冬梅2010)。蓖麻PIP中已有3种全长基
因cDNA序列提交到GenBank, 但基因功能的相关
研究尚未见报道。
本研究在蓖麻PIP基因PIP1.3 cDNA的全长编
码区序列的上、下游设计1对特异引物, 利用RT-
PCR技术扩增该区段, 将其构建入真核表达载体
pcDNA3.1/Myc-His A。用构建的pcDNA3.1PIP1.3-
Myc-His重组质粒和连接氯离子敏感性绿色荧光
蛋白突变体(EYFP-H148Q-V163S)的pcDNA3.1Hy-
gro-EYFP-H148Q-V163S质粒稳定共转染中国仓
鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞, RT-PCR
和Western blot分析PIP1.3的mRNA和蛋白质在选
定CHO细胞克隆中的表达水平。分别通过荧光法
和同位素标记的14C-甘油摄入实验测定该CHO细
胞对水分和甘油的通透性。通过上述实验探索
CHO细胞作为体外检测AQPs功能的异源表达系
统的可行性, 同时为进一步探讨PIP1.3在植株中的
生理作用奠定基础。
材料与方法
1 材料
1.1 植物材料
蓖麻(Ricinus communis L.)种子由内蒙古自治
区通辽市农业科学研究院惠赠。
1.2 菌株、质粒和细胞
大肠杆菌(E. coli) DH5α和BL21(DE3)菌株购
自天根生化科技有限公司。连接氯离子敏感性绿
色荧光蛋白突变体(EYFP-H148Q-V163S)的pcDNA-
3.1Hygro-EYFP-H148Q-V163S质粒由东北师范大学惠
赠。连小鼠水通道蛋白1 (mAQP1)基因的pcDNA3.1-
mAQP1-Myc-His质粒由本实验室构建。中国仓鼠
卵巢CHO-K1细胞购自中国科学院上海细胞库。
1.3 PCR引物
根据蓖麻PIP1.3 cDNA的全长编码区序列
(GenBank登录号: XM_002526820.1; XP_00252-
6866.1)设计1对特异性引物, 引物序列如下:
植物生理学报1882
正向引物5′-CCCAAGCTTATGGAGGG-
CAAGGAAGAAG-3′ ; 反向引物5′-GCTCTA-
GA-CTTCTTGAAAGGAATGGC-3′。
在引物的5′端分别引入HindIII (AAGCTT)和
XbaI (TCTAGA)限制性酶切位点, 酶切位点只在
pcDNA3.1/Myc-His A载体的多克隆位点(multiple
cloning sites, MCS)中存在, 而在PIP1.3 cDNA中不
存在, 引物合成由上海生工生物工程技术服务有
限公司完成。
1.4 试剂
RNA提取试剂TRIzol® reagent、mRNA纯化
试剂盒Oligotex mRNA Mini Kit、逆转录合成试剂
盒SuperScript® III First-Strand Sythesis Syetem for
RT-PCR、PCR扩增试剂盒、真核表达载体pcD-
NA3.1/Myc-His A和脂质体Lipofectin 2000购自In-
vitrogen公司, DNA凝胶回收试剂盒QIAquick® Gel
Extraction Kit、PCR产物纯化试剂盒QIAquick®
PCR Purification Kit和质粒精提试剂盒QIAquick®
Spin Miniprep Kit购自QIAGEN公司, 限制性内切
酶HindIII和XbaI购自NEB公司, IPTG和X-Gal购自
Promega公司, T4 DNA连接酶和DNA分子量标准
购自大连宝生物工程有限公司, 蛋白分子量标准购
自Bio-Rad公司, 低熔点琼脂糖、Tris、甘氨酸、
Acr、Bis、SDS购自Sigma公司, 细胞膜和胞质蛋白
提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限
公司, 其他常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 蓖麻根总RNA的提取
种子消毒后, 于40 ℃水中浸泡12 h, 然后于25
℃恒温培养箱中暗催芽3 d。胚根长至0.5 cm时, 移
到光照培养箱中培养, 营养液为Hoagland营养液[5
mmol·L-1 Ca (NO3)2、5 mmol·L
-1 KNO3、2 mmol·L
-1
MgSO4、0.025 mmol·L
-1 FeSO4-EDTA], 光/暗培养
时间为16 h/8 h, 光照强度为100 µmol·m-2·s-1, 昼/夜
温度为30 ℃/25 ℃, 相对湿度为70%。培养期间无
任何水分胁迫。培养7 d后, 蓖麻根用液氮速冻后,
采用TRIzol法从根中提取总RNA。电泳检测总
RNA完整性、紫外分光光度法检测纯度后用于基
因克隆。
2.2 PCR扩增
用Oligotex mRNA Mini Kit从总RNA中纯化
mRNA, 以此mRNA为模板进行逆转录反应合成
cDNA。在50 μL的PCR反应体系中依次加入30.7 μL
ddH2O、10 μL 10×Buffer、4 μL 50 mmol·L
-1 MgCl2、
1 μL 50 mmol·L-1 dNTP、1 μL 0.01 mmol·L-1正向
引物、1 μL 0.01 mmol·L-1反向引物、2 μL 40×10-6
ng·L-1 cDNA、2.5 U Taq酶; PCR反应条件为: 94 ℃
预变性50 s; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延
伸1 min, 25个循环; 72 ℃延伸7 min。
2.3 真核表达载体构建
PIP1.3 PCR产物按QIAGEN公司的PCR产物
纯化试剂盒说明书回收纯化DNA。纯化的PCR产
物和真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His A分别用
HindIII和XbaI双酶切后, 进行琼脂糖凝胶电泳, 按
试剂盒说明书分别回收双酶切后的PCR产物和
pcDNA3.1/Myc-His A, 琼脂糖凝胶电泳估测上述
两种双酶切产物浓度后, 再把二者用T4 DNA连接
酶连接。把连接产物转化到E. coli DH5α感受态细
胞, 菌落在含0.1 mg·mL-1氨苄青霉素(Amp)、0.024
mg·mL-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和0.04
mg·mL-1 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的
选择培养基上培养后, 挑选白色单克隆菌落分别
培养, 按QIAGEN公司的精提质粒试剂盒说明书提
质粒, 并通过HindIII和XbaI双酶切鉴定筛选阳性重
组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His。选取经酶切鉴
定的阳性克隆pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His进行基因
序列测定。基因序列测定由上海生工生物工程技
术服务有限公司进行。
2.4 PIP1.3的序列分析
用DNA Strider 1.2对PIP1.3 cDNA序列、氨基
酸编码序列进行分析。用ClustalX 1.83进行序列
相似性和进化地位分析及多序列比对。用MEGA5.0
中距离矩阵邻接法(Neighbor-Joining, NJ)建立系统
进化树, 通过自引导检验(bootstrap)获得系统分支
的置信度(重复次数为10 000)。
2.5 重组质粒的精提
用QIAquick® Spin Miniprep Kit提取经测序鉴
定的阳性重组质粒DNA。取精提的质粒DNA样品
经1.2%琼脂糖凝胶电泳估测浓度, 质粒浓度约为
100 ng·μL-1。
2.6 CHO细胞培养
CHO细胞用不含胎牛血清、含100 U·mL-1青
霉素和100 U·mL-1链霉素的F12 Ham’s基本培养基
于37 ℃, 5% CO2条件下培养。
董乐等: 蓖麻质膜水通道蛋白PIP1.3在仓鼠卵巢细胞中的转运功能 1883
2.7 质粒的稳定转染
质粒pcDNA3.1Hygro-EYFP-H148Q-V163S经脂
质体Lipofectin 2000转染CHO细胞, 用含500 μg·mL-1
G418、10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1
链霉素的F12 Ham’s筛选培养基进行筛选, 挑取表
达绿色荧光的阳性单克隆细胞(CHO/EYFP-H148Q-
V163S)扩大培养。质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His
转染CHO/EYFP-H148Q-V163S, 用筛选培养基继
续培养, 并取部分细胞转接到预先放置了圆形盖
玻片的12孔板中培养。
2.8 免疫荧光和细胞化学鉴定
免疫荧光鉴定时, 取12孔板中的盖玻片, 室温
下将细胞用4%多聚甲醛溶液固定15 min后, 分别
在可见光和荧光下观察并拍照。免疫细胞化学鉴
定时, 一抗用抗c-Myc的单克隆抗体(按1:500稀释),
二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记(按1:500稀释),
AEC染色后在荧光显微镜下观察并拍照。
2.9 CHO细胞的RT-PCR检测
收集CHO细胞, 提取细胞总RNA。所得RNA逆
转录合成cDNA。以此cDNA为模板, 用PIP1.3特异
性引物进行PCR扩增, 引物和PCR扩增条件同上。
RT-PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。
2.10 细胞膜提取
根据免疫细胞化学检测结果, 阳性克隆细胞
转接到10 cm培养皿培养, 按试剂盒说明书的方法
提取细胞膜蛋白。
2.11 SDS-PAGE和Western blot
按李永明等(2006)的文献进行。
2.12 PIP1.3的功能测定
2.12.1 PIP1.3对水分的通透性 根据免疫细胞化
学、RT-PCR和Western blot检测结果, 确定PIP1.3对
水通透性测定用的阳性克隆细胞CHO/EYFP-
H148Q-V163S/PIP1.3-Myc-His。细胞膜水通透性
测定方法参考文献(李永明等2006; Jin等2006)。测
量细胞水通透性时, 将阳性克隆细胞按每孔20 000
个细胞的密度铺于黑壁透明底的96孔培养板, 用
含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1
链霉素的F12 Ham’s筛选培养基, 于设定参数为37
℃, 湿度90%, 5% CO2的CO2孵箱中培养。于24 h
形成单层后, 每次用200 μL PBS溶液洗细胞2次, 最
后一次每孔留100 μL PBS溶液。用荧光仪测定
PIP1.3对水分的通透性, 发射光和激发光滤光片波
长分别为HQ535/30M (535 nm±15 nm)和HQ500/20X
(500 nm±10 nm)。连续测定30 s, 速度为每秒5个数
据点, 其中前2 s为基线。2 s后向细胞培养孔中快速
注入100 μL超纯水(<100 ms), 继续测定28 s。细胞
荧光值随时间变化的曲线斜率反应细胞体积的变
化, 细胞膜相对水通透性用达到最大荧光值所需时
间的倒数(1·τ-1)表示, 按Solenov等(2004)方法计算。
2.12.2 PIP1.3对甘油的通透性 将阳性克隆细胞铺
于6孔培养板上, 每个6孔板上同时铺1孔空载体转
染的CHO细胞做对照, 用含10%胎牛血清、100
U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的F12 Ham’s筛
选培养基, 于设定参数为37 ℃, 湿度90%, 5% CO2
的CO2孵箱中培养。经过12~16 h培养形成单层后,
用PBS溶液洗涤3次, 每孔加入1 mL甘油-PBS溶液
(300 mmol·L-1甘油溶液与PBS溶液之比为1:2, 含每
分钟105次放射性衰变14C标记的甘油)孵育, 孵育时
间分别为9、6、3、0 min。用4 ℃甘油-PBS溶液
迅速洗涤5次, 每孔用0.5 mL 0.5% SDS溶液溶解全
部细胞, 转入含20 mL闪烁液的液闪瓶中, 混匀,
在闪烁仪上用14C通道进行放射性测定。
2.13 数据统计
实验数据以平均值±标准误表示, 显著性差异
分析用SPSS 11.5软件进行。
实验结果
1 重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His的构建
以蓖麻根总RNA (图1-A)为模板反转录形成
cDNA后, 用根据PIP1.3序列设计的引物进行RT-PCR
扩增, 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检验, 结果
表明在预期长度位置有1条清晰特异性泳带(图
1-B)。把目的基因片段和表达载体pcDNA3.1/
Myc-His A分别用HindIII和XbaI双酶切, 酶切产物
电泳(图1-C)后分别进行回收, 回收产物估测浓度
后, 再用T4 DNA连接酶将二者的回收产物按一定
比例连接, 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,
挑取阳性单菌落培养, 提质粒。质粒经HindIII和
XbaI双酶切, 可切出预期大小的片段, 证明构建出
重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His (图1-D)。
2 重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His中PIP1.3的
序列分析
将经酶切验证后的重组质粒p c D N A 3 . 1 -
PIP1.3-Myc-His进行测序。测序结果与发表的
植物生理学报1884
PIP1.3序列进行比较, 结果表明, pcDNA3.1PIP1.3-
Myc-His上的PIP1.3序列长度为861 bp, 序列正确,
未出现移码突变, 序列尾部与载体c-Myc和His标签
编码序列连接后阅读框架正确。序列如图2-A。
Blast检索的结果表明, PIP1.3序列与GenBank
中注册的AQPs序列的相似性均在88%以上。推断
的氨基酸序列与GenBank中注册的AQPs序列的同
源性均在85%以上。与该蛋白同源性高的其他植
物AQPs均为PIP1亚家族成员。多序列相似性用
CLUSTALW聚类分析后(结果略), 采用相邻连接法
绘制进化树(图2-B)显示, PIP1.3与已克隆的蓖麻
PIP1.3 (XP_002526867.1)属同一进化分支, 而与蓖
麻PIP1.1 (XP_002531349.1)和蓖麻PIP1.3 (XP_
002509815.1)分属不同进化分支。PIP1.3与橡胶树
AQP (ADN94473.1)、橡胶树PIP1 (AFD61600.1)和
麻疯树AQP (AEH76327.1)的进化关系相近。
3 重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His和pcD-
NA3.1Hygro-EYFP-H148Q-V163S共转染CHO细胞
首先利用脂质体将pcDNA3.1Hygro-EYFP-
H148Q-V163S质粒稳定转染入CHO细胞, 挑选阳
性克隆(图3-C、D)后, 再用pcDNA3.1PIP1.3-Myc-
His质粒稳定转染CHO细胞, 利用G418筛选出阳性
细胞克隆, 即为CHO/EYFP-H148Q-V163S/PIP1.3-
Myc-His。以未转染pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His, 但
稳定转染pcDNA3.1Hygro-EYFP-H148Q-V163S的
CHO细胞为阴性对照。取CHO/EYFP-H148Q-V163S/
PIP1.3-Myc-His和CHO/EYFP-H148Q-V163S的阳
性细胞克隆, 以c-Myc单克隆抗体(ATCC)为一抗、
HRP标记的抗体为二抗进行免疫细胞化学分析。
未转染pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His的CHO细胞没有
染色(图3-E), 转染pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His的
CHO细胞被强烈染色(图3-H)。
提取EYFP-H148Q-V163S/PIP1.3-Myc-His阳
性CHO细胞的总RNA。1.2%非变性琼脂糖凝胶电
泳检测(图4-A)完整性后, 纯化mRNA, 以此mRNA
为模板, 逆转录获得阳性细胞株的cDNA, 进行
PCR的结果(图4-B)表明, PIP1.3在转录水平上已获
阳性表达。
将免疫细胞化学鉴定为阳性的细胞克隆
(CHO/EYFP-H148Q-V163S/PIP1.3-Myc-His)扩大
培养, 提取细胞膜, 进行Western blot分析。结果表
明, 在分子量约为31 kDa处有1条清晰特异性泳带,
分子量大小与理论值相符(图4-C)。
4 PIP1.3转运功能的测定
由于EYFP-H148Q-V163S对Cl-浓度极为敏感,
当水进入细胞后, 可使Cl-浓度稀释, 使荧光增强
(原理见图5-A)。因此可通过细胞荧光的变化快慢
来判断细胞水通道蛋白表达量高低。本实验以稳
定转染小鼠水通道蛋白AQP1的细胞CHO/EYFP-
H148Q-V163S/mAQP1-Myc-His为阳性对照, 以
CHO/EYFP-H148Q-V163S为阴性对照, 测定水分
子通过PIP1.3进入细胞后, 细胞内EYFP的荧光增
强动力学曲线变化, 从而测定CHO/EYFP-H148Q-
V163S/PIP1.3-Myc-His阳性细胞克隆的功能(图
5-B)。稳定共转染EYFP-H148Q-V163S/mAQP1-
M yc-H i s阳性细胞的 t 1 /2与稳定共转染EY F P -
图1 重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His的构建
Fig.1 Construction of mammalian expression plasmid pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His
A: 蓖麻根总RNA的电泳图谱。1、2:蓖麻根总RNA。B: PIP1.3 cDNA的PCR产物的电泳图谱。M: DNA分子量标准; 1: PIP1.3 cDNA
的PCR产物。C: PIP1.3 PCR产物和pcDNA3.1/Myc-His A限制性酶切产物的电泳图谱。M: DNA分子量标准; 1: pcDNA3.1/Myc-His A经
HindIII和XbaI双酶切的产物; 2: PIP1.3 PCR产物经HindIII和XbaI双酶切的产物。D: 重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His限制性酶切鉴定的
电泳图谱。M: DNA分子量标准; 1、2: 重组质粒pcDNA3.1PIP1.3-Myc-His经HindIII和XbaI双酶切的产物。
董乐等: 蓖麻质膜水通道蛋白PIP1.3在仓鼠卵巢细胞中的转运功能 1885
图2 蓖麻PIP1.3全长编码区cDNA序列的生物信息学分析
Fig.2 Bioinformatic analysis of PIP1.3 cDNA from R. communis
A: PIP1.3完整编码区的cDNA序列和推断的氨基酸序列。划横线表示特征序列。B: PIP1.3推断的蛋白序列进化树分析。Ricinus
communis: 蓖麻; Hevea brasiliensis: 橡胶树; Jatropha curcas: 麻疯树; Citrus clementina: 克莱门柚; Vitis cinerea var. helleri×Vitis rupestris: 北
美变种甜冬葡萄和沙地葡萄杂交种; Camellia oleifera: 油茶; Juglans regia: 核桃; Theobroma cacao: 可可; Populus trichocarpa: 毛果杨; Pop-
ulus alba×Populus glandulosa: 银腺杂种杨; Gossypium hirsutum: 陆地棉; Helianthemum almeriense: 半日花; Phaseolus vulgaris: 菜豆。用相
邻连接法绘制, 标尺为遗传距离。
H148Q-V163S/PIP1.3-Myc-His阳性细胞的t1/2和对
照细胞的t1/2相比, 均具显著性差异(图5-C); 而稳定
共转染EYFP-H148Q-V163S/PIP1.3-Myc-His阳性
细胞的t1/2与对照细胞的t1/2相比没有显著性差异(图
5-C), 说明CHO/EYFP-H148Q-V163S/PIP1.3-Myc-
His细胞克隆中PIP1.3水通透性很低。
14C-甘油摄入实验进行的转运功能测定结果表
明, 在9 min中内, 稳定共转染EYFP-H148Q-V163S/
PIP1.3-Myc-His阳性CHO细胞表达的PIP1.3能将细
胞膜对甘油的转运效率提高约8.2倍(图5-D)。
植物生理学报1886
讨　　论
迄今为止, 植物中对水和其他中性小分子的
跨细胞转运的研究主要是通过非洲爪蟾卵母细胞
系统体外检测来进行的。动物中的研究除此系统
外 , 还有通过体外培养的CHO细胞系统来进行
的。本实验分别通过荧光法和同位素标记的14C-
甘油摄入实验测定表达PIP1.3的CHO细胞对水分
和甘油的通透性, 结果表明, 虽然该CHO细胞表达
的PIP1.3对水分子的转运能力很低, 但能选择性转
运甘油, 并且能将细胞膜对甘油的转运效率在9
min内提高约8.2倍。这预示CHO细胞作为体外检
测植物AQPs通透性的异源表达系统的可行性。
PIP1.3对水分子的转运能力很低, 原因可能是
多方面的。这可能与PIP1.3在CHO细胞膜上不能
形成正确的空间构象等因素有关。Mahdieh等
(2008)用非洲爪蟾卵母细胞系统分别检测烟草Nt-
PIP2;1、NtAQP1和NtPIP1;1对水分子的转运能力
时, NtPIP2;1具有强的水通透性, 后二者的水通透
性均很低。但共表达NtPIP2;1和NtPIP1;1的细胞的
图3 在稳定转染的CHO细胞中PIP1.3的免疫细胞化学分析
Fig.3 Immunocytochemistry of PIP1.3 in stably transfected CHO cells
A: 未表达PIP1.3-Myc-His和EYFP-H148Q-V163S的CHO细胞在可见光下的观察结果。B: 未表达PIP1.3-Myc-His和EYFP-H148Q-
V163S的CHO细胞在荧光下的观察结果。C: 表达EYFP-H148Q-V163S的CHO细胞在可见光下的观察结果。D: 表达EYFP-H148Q-V163S
的CHO细胞在荧光下的观察结果。E: 未表达PIP1.3-Myc-His但表达EYFP-H148Q-V163S的CHO细胞的免疫细胞化学染色结果。F: 表达
PIP1.3-Myc-His和EYFP-H148Q-V163S的CHO细胞在可见光下的观察结果。G: 表达PIP1.3-Myc-His和EYFP-H148Q-V163S的CHO细胞在
荧光下的观察结果。H: 表达PIP1.3-Myc-His和EYFP-H148Q-V163S的阳性CHO细胞的免疫细胞染色结果。A~H圴为比例尺×100。
图4 稳定转染PIP1.3的CHO细胞RT-PCR和膜蛋白免疫印迹分析
Fig.4 RT-PCR and western blot analysis of PIP1.3 in stably transfected CHO cells
A: 表达PIP1.3的CHO细胞RNA的电泳图谱。1~3: 表达PIP1.3的CHO细胞的RNA。B: 表达PIP1.3的CHO细胞RT-PCR产物的电泳图
谱。M: DNA分子量标准; 1~3: 表达PIP1.3的CHO细胞的RT-PCR产物。C: 表达PIP1.3的CHO细胞膜蛋白的Western blot。M: 蛋白质分子量
标准; 1~5: 表达PIP1.3的CHO细胞的膜蛋白。
董乐等: 蓖麻质膜水通道蛋白PIP1.3在仓鼠卵巢细胞中的转运功能 1887
水通透性显著高于单独表达NtPIP2;1的细胞的水通
透性。即, PIP1和PIP2通过形成异源多聚体来调控
水通道蛋白的运输功能。在玉米(Fetter等2004)和大
麦(Horie等2011)的PIPs研究中均获得类似结果。
PIP1.3的作用可能与此类似, 蛋白本身确实具低的
水分转运能力, 其水通透性功能需与PIP2类基因互
作才能体现。
本实验用CHO异源表达系统在体外检测了
PIP1.3的功能, 但PIP1.3在植株体内生理过程中的
功能尚未知, 需要后续经体内实验进一步验证。
参考文献
方平平, 郑鹭, 陶爱芬, 祁建民, 林荔辉, 吴建梅(2011). 蓖麻遗传资
源产量与品质性状主成分聚类分析及其评价. 福建农林大学
学报(自然科学版), 40 (3): 231~236
郝卫国(2008). 蓖麻单雌性状的RAPD标记研究[硕士论文]. 通辽:
内蒙古民族大学
李永明, 冯学超, 杨红, 麻彤辉(2006). 水通道蛋白AQP1的表达促进
SMMC-7221人肝癌细胞的迁移. 科学通报, 51 (17): 2024~2029
王冬梅(2010). 矮秆蓖麻主要农艺性状的杂种优势及配合力分析
[硕士论文]. 通辽: 内蒙古民族大学
王芳, 董乐, 戴聪杰, 林娈(2011). 甘草质膜水通道蛋白GuPIP1对甘
油的转运. 生物技术通报, (5): 172~177
Biela A, Grote K, Otto B, Hoth S, Hedrich R, Kaldenhoff R (1999).
The Nicotiana tabacum plasma membrane aquaporin NtAQP1 is
mercury-insensitive and permeable for glycerol. Plant J, 18 (5):
565~570
Bienert GP, Thorsen M, Schüssler MD, Nilsson HR, Wagner A, Tamás
MJ, Jahn TP (2008). A subgroup of plant aquaporins facilitate
the bi-directional diffusion of As(OH)3 and Sb(OH)3 across
membranes. BMC Biol, 6: 26
Chaumont F, Barrieu F, Wojcik E, Chrispeels MJ, Jung R (2001).
Aquaporins constitute a large and highly divergent protein fami-
ly in maize. Plant Physiol, 125 (3): 1206~1215
Choi WG, Roberts DM (2007). Arabidpsis NIP2;1, a major intrinsic
protein transporter of lactic acid induced by anoxic stress. J Biol
Chem, 282: 24209~24218
Danielson JA, Johanson U (2008). Unexpected complexity of the
图5 表达PIP1.3的CHO细胞膜通透性
Fig.5 Permeability of PIP1.3 expressing CHO cells
A: 荧光法检测细胞膜水通透性模式图。B: 渗透压诱发的细胞荧光动力学曲线。C: 表达PIP1.3的CHO细胞的相对水通透性。平行实
验n=10; 测定值=平均值±标准误; t检验; **为差异极显著(P<0.01)。D: 表达PIP1.3的CHO细胞的相对甘油通透性。平行实验n=10; 测定值=
平均值±标准误; **为差异极显著(P<0.01)。
植物生理学报1888
aquaporin gene family in the moss Physcomitrella patens. BMC
Plant Biol, 8: 45
Dordas C, Chrispeels MJ, Brown PH (2000). Permeability and chan-
nel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles
isolated from squash roots. Plant Physiol, 124 (3): 1349~1362
Fetter K, Wilder VV, Moshelion M, Chaumont F (2004). Interactions
between plasma membrane aquaporins modulate their water
channel activity. Plant Cell, 16: 215~228
Gaspar M, Bousser A, Sissoeff I, Roche O, Hoarau J, Mahe A (2003).
Cloning and characterization of ZmPIP1-5b, an aquaporin trans-
porting water and urea. Plant Sci, 165: 21~31
Gerbeau P, Güçlü J, Ripoche P, Maurel C (1999). Aquaporin Nt-TIPa
can account for the high permeability of tobacco cell vacuolar
membrane to small neutral solutes. Plant J, 18 (6): 577~587
Gustavsson S, Lebrun AS, Nordén K, Chaumont F, Johanson U (2005).
A novel plant major intrinsic protein in Physcomitrella patens
most similar to bacterial glycerol channels. Plant Physiol, 139 (1):
287~295
Henzler T, Steudle E (2000). Transport and metabolic degradation of
hydrogen peroxide in Chara corallina: model calculations and
measurements with the pressure probe suggest transport of H2O2
across water channels. J Exp Bot, 51 (353): 2053~2066
Heymann JB, Engel A (1999). Aquaporins: phylogeny, structure
and physiology of water channels. News Physiol Sci, 14 (5):
187~193
Higuchi T, Suga S, Tsuchiya T, Hisada H, Morishima S, Okada Y,
Maeshima M (1998). Molecular cloning, water channel activity
and tissue specific expression of two isoforms of radish vacuolar
aquaporin. Plant Cell Physiol, 39 (9): 905~913
Holm LM, Jahn TP, Møller AL, Schjoerring JK, Ferri D, Klaerke DA,
Zeuthen T (2005). NH3 and NH4
+ permeability in aquaporin-ex-
pressing Xenopus oocytes. Pflugers Arch, 450 (6): 415~428
Horie T, Kaneko T, Sugimoto G, Sasano S, Panda SK, Shibasaka M, Kat-
suhara M (2011). Mechanisms of water transport mediated by PIP
aquaporins and their regulation via phosphorylation events under
salinity stress in barley roots. Plant Cell Physiol, 52 (4): 663~675
Jin SY, Liu YL, Xu LN, Jiang Y, Wang Y, Yang BX, Ma TH (2006).
Cloning and characterization of porcine aquaporin 1 water chan-
nel expressed extensively in gastrointestinal system. World J
Gastroentero, 12 (7): 1092~1097
Kammerloher W, Fischer U, Piechottka GP, Schäffner AR (1994).
Water channels in the plant plasma membrane cloned by immu-
noselection from a mammalian expression system. Plant J, 6 (2):
187~199
Karlsson M, Johansson I, Bush M, McCann MC, Maurel C, Larsson C,
Kjellbom P (2000). An abundant TIP expressed in mature highly
vacuolated cells. Plant J, 21 (1): 83~90
Ma JF, Yamaji N, Mitani N, Xu XY, Su YH, McGrath SP, Zhao FJ
(2008). Transporters of arsenite in rice and their role in arse-
nic accumulation in rice grain. Proc Natl Acad Sci USA, 105:
9931~9935
Mahdieh M, Mostajeran A, Horie T, Katsuhara M (2008). Drought
stress alters water relations and expression of PIP-type aqua-
porin genes in Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Physiol, 49:
801~813
Maurel C (1997). Aquaporins and water permeability of plant mem-
branes. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48: 399~429
Postaire O, Verdoucq L, Maurel C (2008). Aquaporins in plants: from
molecular structure to integrated functions. Adv Bot Res, 46:
75~136
Sade N, Vinocur BJ, Diber A, Shatil A, Ronen G, Nissan H, Wallach
R, Karchi H, Moshelion M (2009). Improving plant stress toler-
ance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2
a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytol, 181:
651~661
Schütz K, Tyerman SD (1997). Water channels in Chara corallina. J
Exp Bot, 48 (313): 1511~1518
Schuurmans JA, van Dongen JT, Rutjens BP, Boonman A, Pieterse
CM, Borstlap AC (2003). Members of the aquaporin family in
the developing pea seed coat include representatives of the PIP,
TIP, and NIP subfamilies. Plant Mol Biol, 53: 655~667
Solenov E, Watanabe H, Manley GT, Verkman AS (2004). Seven-
fold-reduced osmotic water permeability in primary astrocyte
cultures from AQP-4-deficient mice, measured by a fluorescence
quenching method. Am J Physiol Cell Physiol, 286: C426~C432
Uehlein N, Lovisolo C, Siefritz F, Kaldenhoff R (2003). The tobacco
aquaporin NtAQP1 is a membrane CO2 pore with physiological
functions. Nature, 425 (6959): 734~737
Wallace IS, Roberts DM (2004). Homology modeling of representa-
tive subfamilies of Arabidopsis major intrinsic proteins. Clas-
sification based on the aromatic/arginine selectivity filter. Plant
Physiol, 135: 1059~1068
Weaver CD, Crombie B, Stacey G, Roberts DM (1991). Calcium-de-
pendent phosphorylation of symbiosome membrane proteins
from nitrogen-fixing soybean nodules. Plant Physiol, 95 (1):
222~227
Wistow GJ, Pisano MM, Chepelinsky AB (1991). Tandem sequence
repeats in transmembrane channel proteins. Trends Biochem Sci,
16 (5): 170~171
Wudick MM, Luu DT, Maurel C (2009). A look inside: localization
patterns and functions of intracellular plant aquaporins. New
Phytol, 184 (2): 289~302