全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月 1135
收稿 2010-06-24 修定 　2010-09-03
资助 国家转基因重大专项(2008ZX08004-005 -02)。
* 共同通讯作者(E-mail: nanxr@hotmail.com, Tel: 0451-
86676104; E-mail: manweiqun@163.com, Tel: 0451-
86668734)。
大豆离体培养及高频再生基因型的筛选
张艳 1,2,3, 南相日 4,*, 满为群 5,*, 李柱刚 4
1东北林业大学博士后流动站, 哈尔滨 150040; 2黑龙江省农业科学院博士后工作站, 哈尔滨 150086; 3黑龙江省教育学院理
科教育研培部, 哈尔滨 150080; 黑龙江省农业科学院 4生物技术研究所, 5大豆研究所, 哈尔滨 150086
提要: 为建立一个高效的大豆再生体系用于大豆的遗传转化, 选用 3个东北主栽品种 ‘黑农 35’、‘黑农 41’和 ‘黑农 58’的
子叶节和胚尖作为外植体, 分别建立了3个品种的子叶节和胚尖再生体系, 并研究了6-BA对大豆再生的影响。结果表明,
‘黑农41’子叶节最适芽诱导培养基为MSB5+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 IBA, 胚尖最适芽诱导培养基为MSB5+0.2 mg·L-1 6-
BA+0.2 mg·L-1 IBA。‘黑农 41’再生体系在出芽率、出芽数和芽伸长数上均远高于 ‘黑农 35’和 ‘黑农58’, 是一个优秀的大
豆转基因受体材料。
关键词: 大豆; 子叶节; 胚尖; 再生体系
Culture in vitro and High-Frequency Regeneration Genotype Selection of Soy-
bean
ZHANG Yan1,2,3, NAN Xiang-Ri4,*, MAN Wei-Qun5,*, LI Zhu-Gang4
1Station of Postdoctor, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2Station of Postdoctor, Heilongjiang Academy of
Agricultural Sciences, Harbin 150086, China; 3Department of Science Education Research and Training, Heilongjiang College of
Education, Harbin 150080, China; 4Biological Technology Research Institute, 5Soybean Research Institute, Heilongjiang Academy
of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
Abstract: To establish a high frequency regeneration system for the gene transformation of soybean [Glycine
max (L.) Merr.], cotyledonary nodes and embryonic tips from three varieties ‘Heinong 35’, ‘Heinong 41’ and
‘Heinong 58’ were used as the explants. Regeneration systems of cotyledon nodes and embryonic tips from
three varieties were established in this research. Effect of 6-benzylaminopurine (6-BA) on soybean regeneration
was studied. The results indicated that the optimal shooting induction medium of cotyledonary node from
‘Heinong 41’ was MSB5 added 1.0 mg·L-1 6-BA and 0.2 mg·L-1 indolebutyric acid (IBA) and the optimal shooting
induction medium of embryonic tip from ‘Heinong 41’ was MSB5 added 0.2 mg·L-1 6-BA and 0.2 mg·L-1 IBA. In
comparison with ‘Heinong 35’ and ‘Heinong 58’ regeneration systems, ‘Heinong 41’ regeneration system was
superior in shoot regeneration frequency, shoot regeneration number and shoot elongation number. ‘Heinong
41’ was an excellent receptor material in soybeans genetical transformation.
Key words: soybean; cotyledonary node; embryonic tip; regeneration system
大豆是重要的粮食作物、饲料作物和油料作
物, 同时还是重要的工业原料, 在我国广泛种植。
人们对大豆组织培养再生体系的研究可以追朔到
20世纪 60年代, 但直到 80年代才有突破性进展。
Cheng等(1980)首次报道用无菌苗的子叶节为外植
体, 在含高浓度BA的改良B5培养基上诱导丛生芽
获得高频率的再生植株。此后, 各种不同的再生体
系逐渐为人们所发现。Christianson等(1983)首次
以大豆未成熟胚为外植体, 通过胚胎发生途径获得
再生植株。Wei和Xu (1988)首次获得大豆原生质
体再生植株。随后, Lazzeri等(1985)、Barwale等
(1986)、周思君等(1989)通过大豆幼胚培养, 经体
细胞胚胎发生途径获得了再生植株。D h i r 等
(1992)和南相日等(1998)对不同品种的大豆原生质
体进行处理也获得了再生植株。
目前大豆再生体系主要包括: 大豆体细胞胚发
植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月1136
生系统、原生质体发生系统和大豆不定芽器官发
生系统, 其中大豆不定芽器官发生系统是目前公认
比较成熟、易行的大豆再生体系。不定芽器官发
生系统中, 外植体内已存在的分生组织和有分化潜
力的表皮、亚表皮细胞都可作为遗传转化的靶组
织(李明春等 2006)。Barwale等(1986)用未成熟胚
子叶、W r i g h t 等( 1 9 8 7 )用上胚轴和初生叶、
McCabe等(1988)用幼胚轴、Kim等(1990)以下胚
轴相继通过器官发生途径获得再生植株。但由于
大豆再生体系受不同基因型、不同外植体、不同
激素浓度和不同培养基等诸多因素的影响, 目前仍
然是公认的几种再生困难的作物之一。因此, 进一
步研究和优化大豆组织培养, 建立新的、高效稳定
的再生体系是十分必要的, 同时也是大豆遗传转化
成功的前提和基础。
为选择农艺性状优良, 且离体培养再生力强的
大豆品种, 本试验选用大豆 ‘黑农 ’系列品种的无
菌苗子叶节和胚尖为外植体, 研究了不同浓度激素
对大豆两种外植体再生的影响, 同时分别建立了 3
个品种的子叶节和胚尖再生体系, 并筛选出再生效
果最好的大豆品种, 为下一步大豆的遗传转化提供
新的受体材料。
材料与方法
供试大豆[Glycine max (L.) Merr.]品种 ‘黑农
35’、‘黑农 41’和 ‘黑农 58’由黑龙江省农业科学
院大豆所提供。实验所用化学药品均为分析纯。
使用的基本培养基为MSB5 (MS无机盐和 B5维生
素 ) 。
种子消毒采用氯气消毒法。挑选饱满无病斑
的大豆种子, 在通风橱中将种子放于密闭容器中, 同
时在容器内放入一盛有 100 mL次氯酸钠和 4 mL
浓盐酸的小烧杯, 氯气消毒 8~24 h。
试验处理分为两种: (1)子叶节外植体的获得及
处理。将消毒后的大豆种子用无菌水浸泡, 待种子
充分吸水, 种皮软化后接种在添加 1.0 mg·L-1 6-BA
的MSB5培养基中培养 5~6 d。用解剖刀切去无菌
苗的部分下胚轴, 留 2~3 mm, 切去萌发的顶芽和
侧芽, 保留完整的子叶, 从子叶节处纵向切开, 得到
2个外植体。将子叶节外植体分别转到附加不同
浓度 6-BA (0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg·L-1)和
0.2 mg·L-1 IBA的MSB5培养基中诱导出芽及伸长。
(2)胚尖外植体的获得及处理。将消毒后的大豆种
子在无菌水中浸泡 24 h, 去掉种皮, 去除子叶和原
叶, 分离得到胚尖外植体。将胚尖朝上, 置于添加
3.5 mg·L-1 6-BA的MSB5培养基中光培养24 h, 然后
分别转到附加不同浓度 6-BA (0.2、0.4、0.6、0.8
mg·L-1)和0.2 mg·L-1 IBA的MSB5培养基中诱导出芽
及伸长。两种外植体均每隔 10 d继代一次。4周
后统计每个处理的出芽率、出芽数及芽伸长数。
出芽率=出芽的子叶节数/接种的子叶节数×100%,
伸长率 =芽伸长数 /出芽数 ×100%。
当芽伸长至 3~5 cm后, 将其转至添加 2.0
mg·L-1 IBA的MSB5生根培养基中培养, 待根长出
2~3条时, 将瓶盖打开炼苗 2~3 d, 小心取出小苗,
洗净根部残留的培养基, 然后栽于盛有土:蛭石:沙子
(1:1:1)均匀混合的塑料盆中, 注意保持一定湿度。
培养条件为温度(26±1) ℃, 光强 40 μmol·m-2·s-1,
光 /暗周期 16 h/8 h。
数据统计分析采用 SPSS软件, 多重比较采用
Duncan’s法。
实验结果
1 大豆子叶节再生体系的优化
1.1 6-BA对大豆子叶节出芽率的影响 在前人实验
基础上, 采用 5个浓度, 对上述 3个品种进行了子
叶节出芽率测定试验。从表 1可以看出, 3个大豆
品种在不同6-BA浓度的培养基中都能分化出丛生
芽, 但出芽率存在差异。随着6-BA浓度的增加, 出
表 1 不同浓度 6-BA对大豆子叶节出芽率的影响
Table 1 Effects of different concentrations of 6-BA on the
shoot regeneration frequencies of soybean cotyledonary node
出芽率 /%
6-BA/mg·L-1
‘黑农 35’ ‘黑农 41’ ‘黑农 58’
0.5 63.4bc 85.6a 70.2b
1.0 68.9bc 94.5a 87.5a
1.5 71.2b 80.3ab 74.1b
2.0 61.5c 68.7bc 57.5c
3.0 41.7d 52.3c 36.7d
　　同一测定项目数值标有不同小写字母表示在 α=0.05水平上
差异显著。下表同此。
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芽率逐渐增大, 在 6-BA为 1.0 mg·L-1时, ‘黑农 41’
和 ‘黑农 58’的出芽率达到最大, 分别为 94.5%和
87.5%, 而 ‘黑农 35’在 6-BA为 1.5 mg·L-1时, 出芽
率达到最大的71.2%。随着6-BA浓度的继续增加,
子叶节的出芽率反而下降, 在6-BA为3.0 mg·L-1时
下降到最低。3个品种中, ‘黑农 41’出芽率最高。
1.2 6-BA对大豆子叶节出芽数和芽伸长数的影响
培养4周后, 统计5个浓度下子叶节出芽数和芽伸
长数。从表 2可以看出 ‘黑农 35’和 ‘黑农 41’在
6-BA浓度为 1.5 mg·L-1时, 每个外植体分化出的丛
生芽数最多, 分别为 14.78和 16.89个; ‘黑农 58’在
6-BA浓度为 1.0 mg·L-1时, 每个外植体分化出的丛
生芽数最多, 为 15.36个。‘黑农 35’在 6-BA浓度
为 1.5 mg·L-1时, 每个外植体上的平均芽伸长数最
多, 为 6.83个; ‘黑农 58’在 6-BA浓度为 1.0 mg·L-1
时, 每个外植体上的平均芽伸长数最多, 为7.43个。
而 ‘黑农 41’虽然在 6-BA浓度为 1.5 mg·L-1时, 每
个外植体分化出的丛生芽数最多, 但在6-BA浓度为
1.0 mg·L-1时, 每个外植体上的平均芽伸长数最多,
为 8.67 个。
表 2 不同浓度 6-BA对大豆子叶节出芽数和芽伸长数的影响
Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA on shoot regeneration number and
shoot elongation number of soybean cotyledonary node
每个外植体上的平均出芽数 /个 每个外植体上的平均芽(≥ 0.5 cm)伸长数 /个
6-BA/mg·L-1
‘黑农 35’ ‘黑农 41’ ‘黑农 58’ ‘黑农 35’ ‘黑农 41’ ‘黑农 58’
0.5 11.48c 14.33b 13.34b 5.67c 7.60ab 6.80b
1.0 12.21bc 15.25a 15.36a 6.33bc 8.67a 7.43ab
1.5 14.78ab 16.89a 14.84ab 6.83b 8.30a 7.14b
2.0 11.54c 14.07b 13.90b 5.00cd 7.56ab 5.50c
3.0 9.62c 12.31bc 10.28c 3.40d 6.20bc 4.30d
表 3 不同浓度 6-BA对大豆胚尖出芽率的影响
Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA on the
shoot regeneration frequencies of soybean embryonic tip
出芽率 /%
6-BA/mg·L-1
‘黑农 35’ ‘黑农 41’ ‘黑农 58’
0.2 60.0b 85.7a 80.0a
0.4 54.5b 74.0a 55.7b
0.6 45.5c 73.3a 55.5b
0.8 30.0d 75.0a 28.6d
综上所述, 考虑出芽率、出芽数和芽伸长数
这3个因素, 确定‘黑农35’的子叶节最适芽诱导培
养基中 6-BA浓度为 1.5 mg·L-1, ‘黑农 41’和 ‘黑农
58’的子叶节最适芽诱导培养基中6-BA浓度为1.0
mg·L- 1。
2 大豆胚尖再生体系的优化
2.1 6-BA对大豆胚尖出芽率的影响 对3个品种的
胚尖进行了 4个 6-BA浓度的出芽率测定试验。从
表3可以看出, 3个大豆品种在不同6-BA浓度的培
养基中都能分化出丛生芽, 但出芽率存在较大差
异。‘ 黑农 35’ 在 4 个浓度中出芽率都不高, 在
30%~60%之间; ‘黑农 58’除了在 6-BA浓度为 0.2
mg·L-1时出芽率达到 80%外, 其他 3个浓度出芽率
也不高; 而 ‘黑农 41’在 4个浓度中, 出芽率都达到
了 70%以上, 在 6-BA浓度为 0.2 mg·L-1时出芽率
达到最高, 为 85.7%。三个品种中, ‘黑农 41’出
芽率最高。
2.2 6-BA对大豆胚尖出芽数和芽伸长数的影响 对
3个品种的出芽数和芽伸长数进行比较(表4), 可以
看出: ‘黑农 35’在 6-BA浓度为 0.4 mg·L-1时平均
出芽数和平均芽伸长数均达到最多; ‘黑农58’在6-
BA浓度为0.4 mg·L-1时平均出芽数最多, 为3.87个,
在6-BA浓度为0.2 mg·L-1时平均芽伸长数最多, 为
2.98个; ‘黑农 41’在 6-BA浓度为 0.2 mg·L-1时平
均出芽数最多, 达到了 5.61个, 平均芽伸长数也达
到最多, 为4.22个, 远远高于‘黑农35’和‘黑农58’。
综上所述, 考虑出芽率、出芽数和芽伸长数这
3个因素, 确定 ‘黑农 35’的胚尖最适芽诱导培养基
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中 6-BA浓度为 0.4 mg·L-1, ‘黑农 41’和 ‘黑农 58’的
胚尖最适芽诱导培养基中 6-BA浓度为 0.2 mg·L-1。
3 ‘黑农 41’子叶节和胚尖丛生芽不定根的诱导与
再生植株的形成
当芽伸长至 3~5 cm后, 将其转至 IBA浓度为
2.0 mg·L-1的MSB5生根培养基中培养, 待根长出2~3
条时, 将瓶盖打开炼苗 2~3 d, 然后栽于塑料盆中,
获得再生植株。由胚尖获得的丛生芽茎较细弱, 由
子叶节获得的丛生芽茎较粗壮, 生根时间也比较短,
相同时间内得到的根数也较多。
4 ‘黑农 41’子叶节和胚尖两种再生体系的比较
‘黑农 41’的两种外植体在出芽率、出芽数和
芽伸长数上均远高于 ‘黑农 35’和 ‘黑农 58’, 表现
出很强的再生能力。比较 ‘黑农 41’的子叶节和胚
尖两种再生体系在最适芽诱导培养基中的各项指标
(表5)可知, 在丛生芽的伸长率上, 子叶节再生体系
低于胚尖再生体系。这是因为子叶节虽然出芽数
多, 但大部分的芽较易成为封顶芽, 因此伸长率只
有 56.8%, 而胚尖正相反, 出芽数不高, 但伸长率却
高达 75.2%, 且生长较整齐。另外, 在丛生芽的发
生时间上, 由于子叶节外植体的获得需要生长 5~6
d的无菌苗, 因此胚尖丛生芽发生时间较短, 优于
子叶节。但子叶节再生体系的前 3个指标却远远
高于胚尖再生体系, 这是高效的再生体系应该具备
的基本条件, 因此可以采用子叶节作为遗传转化的
外植体。
表 5 ‘黑农 41’子叶节和胚尖两种再生体系的比较
Table 5 Comparison on the cotyledonary node and embryonic tip systems of ‘Heinong 41’
外植体 出芽率 /% 每个外植体上的平均出芽数 /个 每个外植体上的平均芽(≥ 0.5 cm)伸长数 /个 伸长率 /%
子叶节 94.5 15.25 8.67 56.8
胚尖 85.7 5.61 4.22 75.2
表 4 不同浓度 6-BA对大豆胚尖出芽数和芽伸长数的影响
Table 4 Effects of different concentrations of 6-BA on shoot regeneration number and
shoot elongation number of soybean embryonic tip
每个外植体上的平均出芽数 /个 每个外植体上的平均芽(≥ 0.5 cm)伸长数 /个
6-BA/mg·L-1
‘黑农 35’ ‘黑农 41’ ‘黑农 58’ ‘黑农 35’ ‘黑农 41’ ‘黑农 58’
0.2 3.05b 5.61a 3.23b 1.94b 4.22a 2.98a
0.4 3.58ab 4.53a 3.87a 2.58a 3.63a 1.87b
0.6 2.37b 3.45ab 2.77b 2.03b 2.55a 1.53c
0.8 1.33c 2.69b 2.35b 0.67d 1.58bc 1.09c
讨　　论
本试验采用的 3个大豆品种均为黑龙江省农
科院大豆所培育, 是东北主栽品种, 其中 ‘黑农 41’
和 ‘黑农 58’的再生体系研究尚未见报道。‘黑农
35’由于选育时间较早, 对其子叶节的研究较多。
李文霞等(2007)对 ‘黑农 35’的子叶节再生的影响
进行了研究, 结果表明丛生芽诱导培养基中6-BA的
最适浓度为1.7 mg·L-1, 本试验结果为1.5 mg·L-1, 与
之相近。但目前对 ‘黑农 35’胚尖再生体系的研究
还未见报道。胚尖作为大豆组培的外植体是由Liu
等(2004)首先研究报道的, 在近几年的大豆再生及
农杆菌介导的大豆遗传转化中有所应用(Dang和
Wei 2007)。马晓红等(2008)以 ‘合丰 46’、‘东农
42’和 ‘合丰 48’为材料, 对大豆子叶节和胚尖再生
体系进行了比较研究, 结果表明以胚尖为外植体, 出
芽数一般为 3~6个, 本试验的 3个品种胚尖的平均
出芽数在3.58~5.61个之间, 基本相符, 而子叶节的
平均出芽数在 14.78~16.89个之间, 远远高于胚尖,
这也印证了卜云萍等(2003)在对大豆品种 ‘吉林
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43’、‘黑农 36’和 ‘黑农 37’的研究中得出的子叶
节平均出芽数为15~20个的结论。李海燕等(2007)
对 ‘合丰35’和 ‘北京小黑豆 ’子叶节和茎出芽的研
究, 证实为获得高分化率, 选择子叶节作为外植体
较适合, 本研究的结果与之一致。本试验中 ‘黑农
41’表现出了很强的再生能力, 它不但具有高脂
肪、高产、抗灰斑病及抗逆性强等特点, 还是一
个优秀的大豆转基因受体材料。
参考文献
卜云萍, 李明春, 胡国武, 张飙, 王广科, 邢来君(2003). 大豆子叶
节组培再生系统与农杆菌介导的基因转化系统的比较研究.
南开大学学报(自然科学版), 36 (1): 103~108
李海燕, 武小霞, 刘淼, 韩英鹏(2007). 大豆子叶节、胚尖再生植
株的研究. 大豆科学, 26 (5): 709~712
李明春, 蔡易, 赵桂兰, 财音青格乐, 周皓, 孙伟, 邢来君(2006). 改
良大豆子叶节再生体系的研究. 作物学报, 32 (2): 223~227
李文霞, 宁海龙, 李文滨, 吕文河(2007). 6-BA对大豆子叶节再生
的影响. 核农学报, 21 (5): 502~505
马晓红, 姚陆铭, 武天龙(2008). 大豆整个子叶节外植体再生体系
的建立及与子叶节、胚尖再生体系的比较. 大豆科学, 2 7
(3): 373~378
南相日, 刘文萍, 刘丽艳, 吕晓波, 何云霞, 卫志明(1998). PEG介
导 BT 基因转化大豆原生质体获转基因植株. 大豆科学, 17
(4): 326~330
周思军, 尹光初, 雷勃钧, 何志鸿(1989). 从大豆幼胚诱导胚胎发
生再生植株. 大豆科学, 1: 39~45
Barwale UB, Kerns HR, Widholm JM (1986). Plant regeneration
from callus cultures of several soybean genotypes via em-
bryogenesis and organogenesis. Planta, 167: 473~481
Cheng TY, Saka H, Voqui-Dinh TH (1980). Plant regeneration
from soybean cotyledonary node segments in culture. Plant
Sci Lett, 19: 91~99
Christianson ML, Warnick DA, Carlson PS (1983). A morphoge-
netically competent soybean suspension culture. Science,
222: 632~634
Dang W, Wei ZM (2007). An optimized Agrobacterium-medi-
ated transformation for soybean for expression of binary
insect resistance genes. Plant Sci, 173: 381~389
Dhir SK, Dhir S, Widholm JM (1992). Regeneration of fertile
plants from protoplasts of soybean (Glycine max L. Merr.):
genotypic differences in culture response. Plant Cell Rep,
11: 285~289
Kim J, LaMotte CE, Hack E (1990). Plant regeneration in vitro
from primary leaf nodes of soybean (Glycine max) seedlings.
J Plant Physiol, 136: 664~669
Lazzeri PA, Hildebrand DF, Collins GB (1985). A procedure for
plant regeneration from immature cotyledon tissue of
soybean. Plant Mol Biol Rep, 3: 160~167
Liu HK, Yang C, Wei ZM (2004). Efficient Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of soybeans using an
embryonic tip regeneration system. Planta, 219: 1042~1049
McCabe DE, Swain WF, Martinell BJ, Christou P (1988). Stable
transformat ion of soybea n (Gly cine m ax ) by parti cle
acceleration. Nat Biotechnol, 6: 923~926
Wei ZM, Xu ZH (1988). Plant regeneration from protoplasts of
soybean (Glycine max L.). Plant Cell Rep, 7: 348~351
Wright MS, Williams MH, Pierson PE (1987). Initiation and
propagation of Glycine max L. Merr.: plants from tissue-
cultured epicotyls. Plant Cell, 8: 83~90