全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 983~988　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0049 983
收稿 2014-02-11　　修定 2014-06-23
资助 国家星火计划项目(2012GA710001)和农业部“948”项目
(2012-S19)。
* 通讯作者(E-mail: lyy@ahau.edu.cn; Tel: 0551-65786401)。
茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析
汪进, 添先凤, 江昌俊, 李叶云*
安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室, 合肥230036
摘要: 硝酸盐转运蛋白(NRT)是植物吸收和利用硝态氮的一种关键蛋白。运用RACE技术从茶树中扩增出NRT基因的
cDNA, 并利用实时荧光定量PCR检测了CsNRT基因在不同茶树器官与品种之间的差异表达。结果表明: CsNRT基因的
cDNA全长2 061 bp, 开放阅读框为1 818 bp, 编码含由605个氨基酸组成的蛋白质, GenBank登录号为KJ160503, 属于NRT2
基因家族。CsNRT为组成型基因, 对不同处理的水培茶苗进行定量表达分析显示, 该基因在根、茎、叶中都有表达, 其
中在根部的表达水平最高, 1.0 mmol·L-1的NO3
-可诱导其表达量上升7.53倍。不同茶树品种中CsNRT基因的表达也有较
大差异, ‘龙井长叶’和‘凫早2号’的表达量较高, 前者强烈响应0.5和1.0 mmol·L-1 NO3
-的诱导, 后者的响应浓度为1.0和2.0
mmol·L-1, 而‘舒茶早’在各浓度下的表达差异不明显。
关键词: 茶树; 硝酸盐转运蛋白; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Nitrate Transporter Gene in Camellia sinensis
WANG Jin, TIAN Xian-Feng, JIANG Chang-Jun, LI Ye-Yun*
Key Laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: Nitrate transporter (NRT) is one of the key proteins involved in nitrate nitrogen assimilation in
plants. In this study, the cDNA of NRT gene in tea (Camellia sinensis) was amplified via rapid amplification of
cDNA ends (RACE) technique, and their expression levels in different organs and cultivars were quantified
with qPCR. The results showed that the full-length cDNA of CsNRT, containing a 1 818-bp open reading frame
(ORF), was 2 061 bp encoding a polypeptide of 605 amino acids. This gene belonged to NRT2 gene family, and
was named as CsNRT with the accession number KJ160503 in GenBank. CsNRT as a constitutive gene, had the
high expression level in roots compared to those in stems and leaves in tea plants. In the water-cultured tea
plantlets treated with medium concentration of nitrate nitrogen at 1.0 mmol·L-1, the expression level of CsNRT
increased 7.53 folds than that of untreated group. Moreover, their expression levels fluctuated in different tea
cultivars in which C. sinensis cv. ‘Longjinchangye’ and cv. ‘Fuzao No.2’ were higher than cv. ‘Shuchazao’.
CsNTR in cv. ‘Longjinchangye’ was greatly induced by the treatment of low and medium concentrations of ni-
trate nitrogen at 0.5 and 1.0 mmol·L-1 respectively, while CsNTR in cv. ‘Fuzao No.2’ responded to medium and
high concentrations of nitrate nitrogen at 1.0 and 2.0 mmol·L-1 respectively. However, the CsNRT expression
level in cv. ‘Shuchazao’ had no obvious changes when treated with different concentrations of nitrate nitrogen.
Key words: Camellia sinensis; nitrate transporter; gene cloning; expression analysis
茶树属山茶科山茶属, 为多年生常绿木本叶
用作物。氮素是茶树中含量最高的矿质元素, 约占
全株干重的1.5%~2.5%, 以叶片含量最高, 其对茶
树的生长和茶叶品质的优劣起着很重要的作用。
植物可吸收利用氮素主要有NH4
+、NO3
-和有机氮3
种形式。茶树表现出喜铵耐铵特性, 然而, 越来越
多的报道认为混合供应NH4
+ 和NO3
-更有利于作物
的生长和产量的形成(钱晓琴等2003)。水稻是典
型喜铵作物, 但生育后追施硝态氮能提高叶中叶绿
素含量(杨肖娥和孙羲1990)。近年来, 茶树氮素吸
收利用分子机制的研究进展缓慢(童依平等2004),
周月琴等(2013)克隆了茶树硝酸还原酶(nitrate re-
ductase, NR)基因, 并对不同茶树品种中该基因的
表达量进行了相对定量检测, 发现26个茶树品种叶
片中NR基因表达水平差异显著, 最高与最低值之
间相差22.8倍。王新超等(2005)研究发现, 茶树叶
片谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性
与氮素利用效率之间存在着显著的正相关关系。
植物生理学报984
硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter, NRT)属于
膜转运蛋白MFS (major facilitator superfamily)家
族, 参与并介导植物根系对NO3
-的吸收及其在不同
组织、器官间的再度转运。高等植物NRT基因家
族分为NRT1和NRT2两个亚家族。当外界NO3
-浓
度高于1.0 mmol·L-1时, NRT1家族发挥吸收转运作
用; 而低于1.0 mmol·L-1, NRT2家族发挥作用(Craw-
ford和Glass 1998)。由于外界环境中NO3
-浓度较
低, 故NRT2基因家族的研究成为植物氮素吸收研
究的焦点。第一个从真核生物克隆出的NRT2基因
是在构巢曲霉(Aspergillus nidulan)中的crnA (Unkles
等1991), 之后又在单细胞绿藻(Chlamydomonas
reinhartii)分离出与crnA高度同源的基因(Quesada
等1993), 这些工作都促进了高等植物NRT基因的克
隆。自Trueman等(1996)在大麦(Hordeum vulgare)
中首度分离得到高等植物的NRT2基因, 近年来又
从烟草(Nicotiana tabacum)、大豆(Glycine max)、
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、
小麦(Triticum aestivum)等高等植物中克隆得到
NRT2家族基因。
目前 , 关于NRT基因在植物氮营养的调控
(Wang等2009)、表达部位(Nakamura等2007)、植株
发育(Almagro等2008)、逆境胁迫(Popova等2003)
与侧根发育(Li等2007)等方面的表达特性研究均有
报道, 但多集中于模式植物或草本植物, 在木本植
物中的研究很少, 茶树中目前尚无报道。本文从茶
树‘龙井长叶’品种中克隆出了一个NRT基因, 并对
其序列进行了生物信息学分析, 应用定量PCR技术
研究了其在茶树不同组织和不同品种中的表达模
式, 旨在揭示茶树对硝酸盐吸收转运的分子机制,
并为茶树氮素高效利用提供一定的理论基础。
材料与方法
1 材料
选取国家茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]
品种‘龙井长叶’、‘凫早2号’、‘舒茶早’一年生无
性系茶苗, 置于含3种不同浓度NO3
-的标准水培营
养液中培养(常其硕等2008), 其中NO3
-为低浓度0.5
mmol·L-1、中浓度1.0 mmol·L-1, 高浓度2.0 mmol·L-1,
以未添加NO3
-的培养液为对照。分别取培养0 (对
照)、1、3、7、13 d的茶苗根、茎、叶样品, 放置
于–80 ℃冰箱中保存, 作为定量表达分析的材料。
RNA提取试剂盒购自天根公司, SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit购于Clontech公司, Trans-
DH5α和Trans-T1感受态细胞、DNA Marker购于全
式金公司, Taq酶、LA Taq、Premix Taq酶、高保真
酶、反转录试剂盒、克隆载体pMD18-T Simple
Vector、SYBR® Premix Ex TaqTM (实时荧光定量)、
T4连接酶购于TaKaRa公司, DNA纯化回收试剂盒
购于Axygen公司, 其他试剂均为国产分析纯。引
物由上海生工合成, 测序由英俊公司完成。
2 茶树总RNA的提取和CsNRT基因的克隆
取0.2 g茶树叶片组织, 采用植物总RNA提取
试剂盒提取茶树叶片总RNA, 经1.2%琼脂糖凝胶
电泳检测其完整性, 通过核酸定量仪检测RNA的
A260/A280及A260/A230分析纯度。
参照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit
说明书, 以高质量RNA样品为模板合成3-RACE和
5 -RACE模板 , 参照CsNRT的EST (登录号为
JK341774.1)序列, 利用Primer 5.0软件分别设计
3-RACE和5-RACE的特异引物。CsNRT的3-端克
隆外侧引物为P1 (5-TAGACAAGGCAGCGATA-
AGGACAC-3), 内侧引物P2 (5-CCAGATGAC-
CAAATCAACCCCAACG-3); CsNRT 5-端克隆外
侧引物为P 3 ( 5 - T G ATA C C G C C AT C C C A -
CAAAAG-3), 内侧引物P4 (5-AGATGGGTATC-
CAGAGACTCAGCGT-3); CsNRT全长验证引物为
P5 (5-GGGGGAGAGAAAGAGGGGTAGA-3)和
P6 (5-GGAAATAGGACATGAGAGAC-3)。第一
轮外侧PCR程序为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性
30 s, 72 ℃延伸2 min, 5个循环; 94 ℃变性30 s, 70 ℃
退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 5个循环; 94 ℃变性30 s,
70 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 25个循环。第二轮
内侧PCR程序为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性45 s,
65 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 29个循环。CsNRT
全长PCR验证程序为: 98 ℃预变性3 min; 98 ℃变
性10 s, 55 ℃退火15 s, 72 ℃延伸3 min, 共30个循
环。产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。利用DNA
回收试剂盒回收纯化目的片段, 然后与pMD18-T
Simple Vector载体连接, 连接产物转入大肠杆菌
Trans-T1感受态细胞中进行培养, 挑取阳性克隆
测序。
汪进等: 茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析 985
3 生物信息学分析
通过DNAStar软件对开放阅读框(open reading
frame, ORF)和氨基酸序列进行预测分析, 利用
ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.
html)网站计算CsNRT蛋白的分子量和理论等电点,
Protein Blast推测其结构域, SignalP 4.0 (http://
www.cbs.dtu.dk/services/signalP)预测蛋白的信号
肽, TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM/)预测蛋白的跨膜结构 , 用PtotScale
(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)预测蛋
白的疏水性, 用Sopma (http//npsa-p bil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat. plpage=npsa_sopma.html)预测蛋
白的二级结构。
4 CsNRT基因的表达分析
根据CsNRT基因序列, 设计qRT-PCR特异性引
物为P7 (5-CAAGATTCGGTCGTAGATGGG-3)和
P8 (5-GCGATAAGGACACCAGATGAC-3); 以茶
树甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基
因, 引物为P9 (5-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3)
和P10 (5-CAGTGGGAACACGGAAGC-3)。
实时荧光定量qRT-PCR的反应体系参照SYBR®
Premix Ex TaqTM说明书。按相对定量法进行基因
表达量的计算(Livak和Schmittgen 2001)。
实验结果
1 CsNRT基因的克隆及序列分析
以茶树3-RACE cDNA为模板, P1和P2为两轮
PCR的引物, 扩增出一条3-端特异性条带, 测序长
度为1 003 bp (图1-A); 以茶树5-RACE cDNA为模
板, P3和P4为引物, 扩增出一条5-端特异性条带,
测序长度为1 320 bp (图1-B)。分别将3-RACE和
5-RACE序列与NRT EST序列进行比对, 重叠序列
同源性为100%, 将3条序列拼接获得全长序列。以
P5和P6为全长验证的扩增引物, 获得一条2 061 bp
的特异条带, 与拼接全长序列相同(图1-C)。
序列分析表明, CsNRT的cDNA包含一段1 818
bp的完整ORF, 编码由605个氨基酸组成的蛋白, 蛋
白分子量为67 kDa, 等电点为9.40, GenBank登录号
为KJ160503。序列中有6个保守的蛋白激酶C的结
合位点, 属于MFS蛋白家族。跨膜结构分析表明,
CsNRT有12个跨膜区间, 其中第6和第7个区间是
由一个较长的亲水环连接, 属于跨膜蛋白(图2)。
SignalP 4.0软件分析表明, 在CsNRT蛋白中未发现
信号肽结构, 属于非分泌蛋白。ProtScale分析显示
CsNRT可能为疏水性蛋白质。采用Predict Protein
预测蛋白质的二级结构, 结果表明CsNRT中α-螺旋
(H)、延伸链(E)、β-转角(T)和无规则卷曲(L)的比
例是43.80:16.86:8.60:30.74, 由此可以看出CsNRT
的二级结构主要由α-螺旋组成。
通过BLAST比对分析可知, CsNRT编码的氨
基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)、番茄(Solanum ly-
copersicum)、蓖麻(Ricinus communis)、黄瓜(Cu-
cumis sativus)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)相似性达
到76%、73%、68%、65%、65%。利用MEGA
4.0构建CsNRT系统进化树, 结果显示, CsNRT蛋白
与大豆在一个小分支上, 相似性最高(图3)。
图1 CsNRT基因的PCR扩增产物
Fig.1 PCR products of CsNRT gene
A: 3-RACE产物; B: 5-RACE产物; C: 全长扩增产物。
植物生理学报986
图2 CsNRT的核苷酸和推测的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CsNRT
CsNRT的12个跨膜域用下划线标出; 长亲水区用波浪线标出; 方框内为保守的蛋白激酶C的识别位点(S/T-X-R/K)。
汪进等: 茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析 987
图5 不同浓度NO3
-处理下不同茶树品种中CSNRT的表达水平
Fig.5 Expression levels of CsNRT gene in different
C. sinensis cultivars under treatment of different
concentrations of nitrate nitrogen
NO3
-处理浓度分别为: 0.5 (A)、1.0 (B)、2.0 (C) mmol·L-1。
2 茶树不同器官中CsNRT基因的表达
在正常生长条件下(对照), 茶树‘龙井长叶’的
根、茎、叶中CsNRT基因均有表达, 这表明该基因
为组成型表达基因。但茶树各组织间的表达水平
差异明显, 根部的表达量最高。茶苗在含不同浓
度NO3
-的营养液中培养7 d, 其根中CsNRT基因的
表达水平被诱导升高, 其中, 在1.0 mmol·L-1的浓度
处理下, 根部CsNRT基因表达量可提高7.53倍, 而
在0.5和2.0 mmol·L-1诱导下表达量增加不显著; 叶
和茎部的表达量则在诱导后没有明显增加(图4)。
3 不同茶树品种中CsNRT表达量的差异
在0.5 mmol·L-1 NO3
-处理下, 不同茶树品种中
CsNRT基因的表达量有不同程度提高, 其中, ‘龙井
长叶’中的表达量上升明显, 处理3 d后达到最高,
为处理前的6.46倍, 而‘凫早2号’和‘舒茶早’的表达
量最大仅提高2倍左右(图5-A)。1.0 mmol·L-1 NO3
-
图3 CsNRT的系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic tree analysis of CsNRT
分支上的数值表示1 000次重复抽样符合聚类的百分数。
图4 CsNRT在不同器官中的表达水平
Fig.4 Expression level of CsNRT gene in different organs
植物生理学报988
处理下, ‘龙井长叶’中CsNRT表达水平上升更为显
著, 处理7 d时达到处理前的11.48倍, ‘凫早2号’中
的表达水平最大提高了8.42倍, 而‘舒茶早’只提高
2.22倍(图5-B)。2.0 mmol·L-1的NO3
-处理时, ‘龙井
长叶’中CsNRT表达水平最高仅上升5.7倍, ‘凫早2
号’在处理7 d时表达水平提高了10.4倍, 而‘舒茶早’
表达水平最高提高了2.85倍, 增加量仍维持在3倍
以下(图5-C)。
讨　　论
Nakamura等(2007)研究发现, 光合植物中
NRT2蛋白具有保守性, 一般含有500~600氨基酸,
少数有6个跨膜区域, 多数有12个, 且每6个为一组,
中间被一个大的亲水环连接, 属于MFS家族。徐
海荣等(2007)在研究水稻的NRT2时发现该基因含
有6个保守的蛋白激酶C的识别位点。我们从茶树
中克隆得到的CsNRT基因具有以上特性, 可能是
NRT2基因家族的新成员, 属于MFS家族。
本文结果表明, CsNRT基因在茶树不同组织
之间的表达水平存在明显差异, 无论是正常生长,
还是用不同浓度的NO3
-诱导, 根中的表达量远高于
叶中(图4); 这与Orsel等(2007)在拟南芥中研究结
果一致。随着NO3
-浓度的升高, 根部的CsNRT表达
水平明显提高, 但浓度进一步升高到2.0 mmol·L-1
时, CsNRT表达量反而降低, 表明CsNRT可能属于
高亲和力转运系统; 这与NRT2基因家族表达特性
一致。不同茶树品种中CsNRT基因表达也有较大
差异, ‘龙井长叶’与‘凫早2号’中的表达量较高, 前
者强烈响应0.5和1.0 mmol·L-1浓度NO3
-诱导, 而后
者则响应1.0和2.0 mmol·L-1 NO3
- (图5)。NR是植物
氮代谢过程中起关键作用的限速酶 , 周月琴等
(2013)发现‘龙井长叶’中该酶的表达量明显高于其
他品种, 这表明‘龙井长叶’可能有着较强的氮素吸
收利用率。
李宝珍等(2009)研究发现拟南芥和水稻中含
有50~100个NRT1家族成员, 6~7个NRT2家族成
员。Forde (2000)在研究低等植物衣藻时发现单独
的NRT2基因不能转运NO3
-, 还需要一个辅助蛋白
NAR, 随后在水稻、大豆、小麦等植物体中也发
现了NAR基因, 可见NO3
-吸收转运调控是一个相当
复杂的过程。因此, 为了解茶树硝酸盐吸收利用
的分子机制, 开展耐低氮或氮高效茶树品种的选
育工作, 还需进一步对硝酸盐转运蛋白进行系统
研究。
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