全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (4): 483~487　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0460 483
收稿 2013-12-04　　修定 2014-03-25
资助 黑龙江省森工总局科技计划项目(sgzjY2010026)和黑龙江
省科学院科学研究基金项目。
* 通讯作者(E-mail: an_fengxia@163.com; Tel: 0451-
86050321)。
萱草microRNAs生物信息学及与冷冻相关microRNAs的分析
安凤霞1,2, 卢宝伟3, 梁鸣2, 唐焕伟2, 李富恒1,*
1东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨150030; 2黑龙江省科学院自然与生态研究所, 湿地与生态保育国家地方联合工程实验
室, 黑龙江省特色动植物利用工程技术研究中心, 哈尔滨150040; 3黑龙江生态工程职业学院, 哈尔滨150025
摘要: microRNA是一类长度为16~29 nt的非蛋白质编码的内源小分子RNA (sRNA), 在植物生长发育以及逆境胁迫响应等
过程中发挥着重要作用。本文利用基于HiSeq原理的sRNA深度测序技术, 结合生物信息学方法对萱草根系中已知miRNA
的类型、丰度以及部分与冷冻胁迫相关的已知miRNA的功能进行了分析。结果表明, 在10 ℃常温和–25 ℃低温条件下萱
草根系中分别有14 843 184和16 072 575条序列信息, 代表14 064 385和15 309 725种sRNA片段, 且sRNA均呈现正态分布特
征; 在非编码RNA中转运RNA (tRNA)、核糖体RNA (rRNA)所占比例较大。低温sRNA组中得到注释的sRNA有67 411种,
共计799 994条sRNA片段; 常温sRNA组中, 得到注释的sRNA有66 524种, 共计1 055 466条sRNA片段。冷冻胁迫下, 萱草通
过提高miR393、miR397、miR396的表达量和降低miR319的表达量来增强其抗冻性。本研究为后续揭示萱草低温应答蛋
白合成的调控机理, 筛选抗冻关键调控基因提供了丰富的数据。
关键词: 萱草; miRNA; 生物信息学; 低温; 深度测序
Bioinformatics, Expression and Functional Analysis of microRNAs in Response
to Low Temperature in Hemerocallis fulva (L.) L.
AN Feng-Xia1,2, LU Bao-Wei3, LIANG Ming2, TANG Huan-Wei2, LI Fu-Heng1,*
1School of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2Natural and Ecological Institute,
Heilongjiang Academy of Sciences, National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological
Conservation, Characteristic Animal and Plant Utilization Engineering Technology Research Center of Heilongjiang Province,
Harbin 150040, China; 3Heilongjiang Vocational Institute of Ecological Engineering, Harbin 150025, China
Abstract: MicroRNAs (miRNAs), as endogenous small non-coding single-stranded RNAs of 16–29 nt, play a
prominent role in the process of growth, development and responses to environmental stresses in plants. The
miRNAs in response to low temperature in Hemerocallis fulva roots were identified using deep-sequencing
technique in combination with bioinformatics prediction. A total of 14 843 184 and 16 072 575 RNA sequences
were explored under normal and low temperature conditions, which represented 14 064 385 and 15 309 725
types of small RNA (sRNA), respectively. The sRNA showed a normal distribution. Through GenBank and
Rfam comparison analysis, rRNA and tRNA accounts for a larger proportion in non-coding RNA. Totally 799 994
sRNA in 67 411 types were annotated under low temperature, and 1 055 466 sRNAs in 66 524 types were
annotated under normal temperature. miR393, miR397 and miR396 were up-regulated and miR319 was down-
regulated at low temperature. This research provides rich data for illuminating the regulatory mechanism of
protein synthesis and screening the key regulatory genes in response to low temperature.
Key words: Hemerocallis fulva; miRNA; bioinformatics; low temperature; deep-sequencing
microRNA (miRNA)是一类来自真核生物自
身基因组的非编码小分子RNA (sRNA), 长度范围
在16~29 nt, 主要在转录后水平负向调节基因表达
(Zhang等2009a)。自2002年以来, 植物中已有大量
的miRNA相继被发现。近年来, 在前人研究基础
上发展起来的sRNA深度测序技术, 能够从全基因
组水平大范围地发掘已知和未知、保守和非保守
的miRNA, 构建样品间的sRNA差异表达谱, 是
sRNA功能研究的有力工具, 进而在植物miRNA的
发掘中得到广泛应用。越来越多的研究结果表明,
miRNA在植物的生长发育、激素调节、信号转导
植物生理学报484
及逆境胁迫反应等方面均具有重要的作用(Lauter
等2005)。然而上述研究主要集中在基因组已被解
析的拟南芥、水稻等模式植物上, 对于非模式植
物的研究较少。因此, 拓宽研究物种对于快速准
确地鉴定和系统深入地研究植物miRNA具有重大
意义。
萱草是一种无性繁殖的多年生草本宿根植物,
集抗干旱、抗寒、耐盐等多种抗逆性于一身, 有
多种抗逆基因可待发掘与利用, 且具有较高的观
赏、医疗和保健价值, 发展潜力良好。目前国内
外尚未见萱草相关miRNA的报道。miRNA在结构
和功能方面的保守性特点及深度测序技术在检测
miRNA基因表达上的成功经验, 为研究基因组信
息较少的非模式植物中的miRNA提供了重要参
考。基于此, 本项研究采用HiSeq高通量测序技术
对萱草sRNA进行数字化检测, 获得与冷冻胁迫相
关的miRNA, 以期为萱草中低温应答基因的调
控、表达与合成等提供依据, 并为今后研究萱草
的抗寒作用机制奠定基础。
材料与方法
1 材料
供试材料为萱草[Hemerocallis fulva (L.) L.]
‘红宝石’品种繁殖苗。种苗来源于东北农业大学生
命科学学院植物学研究室, 盆栽于东北农业大学生
命科学学院实验基地。
取常规管理下苗龄90 d左右、长势基本一致
的萱草‘红宝石’盆栽植株, 置于SANYO人工气候箱
(上海仪纯实业有限公司)中, 正常温度为10 ℃, “均
一化”处理14 d后进行低温处理, 即由10 ℃梯度降
温至–25 ℃处理14 d, 光照/黑暗时间为12 h/12 h, 相
对湿度控制在80%左右; 以10 ℃为对照。胁迫处理
和对照均设2次生物学重复。取同一条根作为试验
材料, 迅速放入液氮中冷冻, 置–80 ℃保存备用。
2 方法
2.1 总RNA的提取
将试验材料用无菌水冲洗干净后擦干, 采用
Trizol法提取总RNA, 核酸测量仪检测浓度及纯度,
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定其质量, 将经
胁迫处理和对照材料中提取的总RNA等量混匀后,
用Agilent 2100生物分析仪分析RNA的完整性。
2.2 sRNA文库构建及测序
分别称取等量的经胁迫处理和对照试验材
料, 各自混合均匀后作为样品材料, 提取总RNA,
用于sRNA文库构建。总RNA经15%变性PAGE分
离, 将长度范围在17~24 nt的sRNA切胶回收, 纯
化后的sRNA分别经5′接头和3′接头连接后RT-
PCR扩增, 构建成sRNA的cDNA文库, 直接用于深
度测序。深度测序采用HiSeq技术, 由华大基因公
司完成。
2.3 sRNA序列生物信息学分析
将HiSeq测序获得的sRNA序列 , 通过去接
头、去低质量、去污染、统计序列长度分布等过
程完成初级分析, 得到的序列进行分类注释, 可以
获得样品材料中包含的各组分及表达量信息。剩
余的sRNA序列与miRNA数据库(release 18)中所有
的miRNA序列进行比对, 得到样品中已知miRNA
的含量和表达丰度等信息。
结果与讨论
1 萱草miRNA生物信息学初步分析
1.1 RNA完整性
用Agilent生物分析仪检测RNA完整性的结果
显示 , 对照和经胁迫处理材料中提取R N A的
28S/18S (样品纯度)值均为1.4, RIN值分别为7.2和
7.6, 浓度分别为442和318 ng·µL-1, 符合HiSeq高通
量测序样品质控标准(植物样品纯度: 28S/18S≥1;
植物样品浓度≥100 ng·µL-1; RNA完整性: 植物和
真菌RIN值≥6.5), 说明提取的RNA未降解, 完整性
较好, 满足样品制备的要求, 可用于测序。
1.2 萱草sRNA片段类型和数量
采用MATLAB统计分析在10和–25 ℃下分别
挖掘出的14 843 184和16 072 575条萱草RNA序列信
息, 这些序列分别代表14 064 385和15 309 725种
sRNA片段, 分别占总数的94.88%和95.38% (表1)。
1.3 萱草根系中sRNA片段长度的分布
在10和–25 ℃条件下, 萱草根系中sRNA的分
布均呈现出正态分布特征, 除个别外, 不同长度
sRNA所占的比例大体一致, 其中24 nt的sRNA均
为主要类型, 分别占sRNA总数的45.53%和47.42%;
这与普遍认为的miRNA长度多集中分布在20~24
nt的结论较为一致。
安凤霞等: 萱草microRNAs生物信息学及与冷冻相关microRNAs的分析 485
本研究中两个sRNA文库的Unique sRNA序列
和sRNA序列的长度分布都存在明显差异, –25 ℃
条件下萱草根系中的sRNA片段无论在种类上还
是在数量上都较10 ℃下的多(图1), 说明低温对萱
草的sRNA表达有显著影响。
2 萱草sRNA分类注释
将本研究的测序结果与miRBase数据库进行
比对, 在–25和10 ℃条件下分别筛选出199和229种
保守的miRNA序列, 共得到13 885和8 577条干净序
列; 没有比对到任何注释信息的sRNA序列种类分
别为7 561 937和6 994 850种, 占sRNA总类型数
(14 503 620)和总数(12 996 096)的比例为94.73%和
92.40%。–25 ℃低温样品的sRNA中得到注释的有
67 411种共计799 994条sRNA片段; 10 ℃常温样品
的sRNA中, 得到注释的有66 524种共计1 055 466条
sRNA片段(表2)。
分类注释结果中核糖体RNA (rRNA)的总量可
以作为样品的质控标准, 即当所提取植物样品中的
rRNA总量占sRNA总数比例低于60%时, 认为其质
量较好, 数据可靠。本研究中萱草低温和常温样品
的rRNA总量所占比例仅为3.44%和3.55%, 均大大
低于60%, 说明sRNA质量可靠, 可用于测序分析。
3 萱草中与低温相关miRNA的表达和功能
低温胁迫下植物通过转录水平和转录后水平
共同调控基因的表达与翻译, 以响应低温胁迫, 其
中miRNA参与的转录后调控是近期研究的热点。
植物miRNA与逆境胁迫的联系促使研究者将
miRNA加入到低温胁迫基因应答的调控网络中,
以期更深刻、全面地理解植物应答低温胁迫的机
制。本研究对与萱草低温相关且目前研究较多的
几个主要miRNA的表达和功能进行了分析, 结果
如表3所示。
3.1 miR319
本研究结果显示, miR319在低温胁迫下读取次
数(表达丰度)为212次, 常温下读取次数为409次
(表3), 由此可见, 随着温度的降低, 其表达丰度呈
现下降趋势, 说明miR319在萱草的冷冻胁迫中起
负调控作用。
miR319家族有3个成员, 分别是miR319a、
miR319b和miR319c。Thiebaut等(2012)发现, 甘蔗
幼苗经4 ℃处理, miR319在根和叶中表达量均上升,
但在耐寒品种中表达延迟且表达量更低。从而说
明miR319在植物低温胁迫应答中起重要作用。
图1 萱草sRNA片段长度分布
Fig.1 The length distribution of sRNA fragments in H. fulva
A: –25 ℃; B: 10 ℃。
表1 萱草根系中sRNA片段类型、数量和百分比
Table 1 The type, number and percentage of sRNA in H. fulva roots

片段类型
–25 ℃ 10 ℃
数量 百分比/% 数量 百分比/%
总读数 16 072 575 14 843 184
高质量序列 16 051 297 100.00 14 822 609 100.00
3无效衔接蛋白 4 593 0.03 3 870 0.03
无效插入片段 1 244 0.01 1 384 0.01
5污染物衔接蛋白 19 101 0.12 13 937 0.09
小于18 nt片段 713 838 4.45 736 049 4.97
多聚腺苷酸 2 796 0.02 2 984 0.02
干净序列 15 309 725 95.38 14 064 385 94.88
植物生理学报486
3.2 miR393
由表3可见, miRNA393在常温下的读取次数
为87次, 经低温胁迫后其读取次数为102次, 随温
度降低, 表达丰度上升, 因此初步分析认为, miRNA-
393对萱草低温逆境的调控作用趋于正向调控, 这
与以往的研究结果较为一致。
冷胁迫下, 拟南芥通过提高miR393的表达量
从而增强了其抗冷性, 其主要原因是miR393的靶
基因泛素连接酶E3的表达量下调, 导致冷诱导蛋
白生成量增加(Sunkar和Zhu 2004)。Zhang等
(2009b)通过全基因组测序法与芯片杂交法证实, 低
温可以诱导miR393表达, 这与Sunkar和Zhu (2004)
的研究结果一致。miR393的靶基因转录因子与冷
响应转录激活因子(CRT/DRE binding factor, CBF)
启动子的转录因子(inducer of CBF expression 1,
ICE1)蛋白属于同一家族, 低温下ICE1结合在CBF3
的启动子区域, 激活CBF3基因的表达, 而CBF可以
激活下游众多与抗逆有关的功能基因的表达(Chi-
nnusamy等2010)。因此, 推测miR393可能在植物
表3 萱草中几个与低温胁迫相关的miRNA表达谱
Table 3 miRNA expression profiling related to low temperature stress in H. fulva
miRNA家族
读取次数
序列

10 ℃ –25 ℃
miR319 409 212 5-TTGGACTGAAGGGAGCTCCCT-3
miR393 87 102 5-TTCCAAAGGGATCGCATTGATC-3
miR396 221 441 5-TTCCACAGCTTTCTTGAACTG-3
miR397 6 15 5-TCATTGAGTGCAGCGTTGATG-3
低温胁迫应答中起重要作用(张志明等2010)。
3.3 miR396
本研究结果表明, miR396的表达丰度经过低
温胁迫后呈现显著上调表达趋势(表3), 因此推测
萱草体内可能存在一个以miR396为枢纽的调节系
统 , 将miR396基因上游调控元件及调控因子和
miR396的靶标紧密相连, 构成逆境胁迫下机体维
持自身正常代谢和自我保护的一条通路。
miR396分布于36个物种中, 属于植物中高度
保守的一类miRNA, 它广泛参与多种逆境胁迫响
应(Carlsbecker等2010)。Liu等(2008)在研究拟南
芥逆境胁迫相关miRNA时发现, miR396参与拟南
芥低温响应, 其中miR396a和miR396b的启动子区
域存在低温相关响应元件。Gao等(2011)发现
miR396c基因上游启动子区域存在防卫相关的元
件, 然而这些作用元件并没有引起下游miR396c基
因在低温胁迫条件下的上调表达。由此, 我们推
测miR396在低温下的表达模式也许是低温胁迫响
应元件与其他调控元件协同作用的结果。
表2 各类sRNA总类型数和总数
Table 2 The total number of types and total number of sRNA

分类
–25 ℃ 10 ℃
sRNA总类型数(百分比/%) sRNA总数(百分比/%) sRNA总类型数(百分比/%) sRNA总数(百分比/%)
总数 7 631 739 (100.00) 15 309 725 (100.00) 7 068 345 (100.00) 14 064 385 (100.00)
反义外显子 712 (0.01) 1 179 (0.01) 1 996 (0.03) 3 765 (0.03)
识别外显子 1 272 (0.02) 2 435 (0.02) 2 524 (0.04) 5 244 (0.04)
基因区内外显子 690 (0.01) 1 076 (0.01) 879 (0.01) 1 409 (0.01)
识别内含子 717 (0.01) 1 411 (0.01) 1 127 (0.02) 2 405 (0.02)
miRNA 199 (0.00) 110 230 (0.72) 229 (0.00) 98 950 (0.70)
转运RNA 52 982 (0.69) 526 769 (3.44) 52 998 (0.75) 499 436 (3.55)
重复序列 2 295 (0.03) 13 885 (0.09) 1 867 (0.03) 8 577 (0.06)
小核RNA 2 410 (0.03) 7 418 (0.05) 2 133 (0.03) 5 171 (0.04)
核仁小RNA 810 (0.01) 2 004 (0.01) 1 020 (0.01) 3 396 (0.02)
核糖体RNA 7 715 (0.1) 139 698 (0.91) 8 722 (0.12) 439 936 (3.13)
未注释片段 7 561 937 (99.09) 14 503 620 (94.73) 6 994 850 (98.96) 12 996 096 (92.40)
安凤霞等: 萱草microRNAs生物信息学及与冷冻相关microRNAs的分析 487
3.4 miR397
本研究中miR397随温度下降表达丰度呈现显
著上升趋势(表3), 可见, 低温胁迫可以诱导miR397
的表达。表明miR397可能在萱草抵御低温逆境过
程中起作用。
Zhang等(2009b)证实低温可以诱导miR397表
达。Sunkar和Zhu (2004)发现miR397在低温胁迫下
表达 , 同时miR397在高盐环境中也同样表达。
miR397的靶基因与低温适应过程密切相关(张志明
等2010)。
通过上述研究推测, 当萱草遭遇低温恶劣外
界条件时, 通过调控miRNA的表达, 改变相应的靶
基因表达活性, 使机体代谢向有利于自身生长的
方向进行, 防止低温胁迫对机体的伤害。
本研究结果为系统分析萱草miRNA抗冻反应
机制奠定了基础, 还将为后续深入揭示萱草抗逆
应答蛋白合成的调控机理、关键调控基因的筛选
以及其他相关的代谢途径和基因的获得, 提供数
据支持。
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