全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 349–355　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0688 349
收稿 2015-12-25　　修定 2016-01-31
资助 广东省林业科技创新项目(2015KJCX037)和绍兴文理学院
校级项目。
* 通讯作者(E-mail: h.f.chen@scbg.ac.cn)。
黄花倒水莲的组织培养和快速繁殖
杨国1, 罗洁3, 莫亿伟1, 陈红锋2,*
1绍兴文理学院生命科学院, 浙江绍兴312000; 2中国科学院华南植物园, 广州510650; 3绍兴文理学院元培学院, 浙江绍兴
312000
摘要: 以黄花倒水莲无菌实生苗的胚轴、茎段和叶片为外植体, 研究了不同植物生长调节剂对不同外植体的不定芽诱导的
影响, 以及光照、有机添加物对不定芽增殖和生长的影响。结果表明: 培养基MS+BAP 2.0 µmol·L-1+NAA 0.2 µmol·L-1最利
于茎段和胚轴诱导不定芽发生; 叶片在MS+2,4-D 4.0 µmol·L-1培养基上培养30 d可诱导出愈伤组织, 转入MS+BAP 2.0
µmol·L-1+NAA 0.2 µmol·L-1培养基中培养20 d能分化成不定芽。当培养光照达到100 µmol·m-2·s-1时, 最利于黄花倒水莲芽
苗生长, 培养基中分别添加1 g·L-1蛋白胨、50 g·L-1椰汁和50 g·L-1香蕉, 均有壮苗的效果; 最佳的生根培养基是MS+2,4-D 0.5
µmol·L-1, 生根率达95.3%, 且根系生长良好; 移栽到混合基质(蚯蚓粪:黄泥土=2:1)中, 生长良好, 成活率达95%。
关键词: 黄花倒水莲; 药用植物; 离体快繁; 组织培养
黄花倒水莲(Polygala fallax)是远志科远志属
灌木或小乔木 , 分布于湖南、福建、广西、江
西、广东和云南。黄花倒水莲属于珍贵中药材,
有土党参、黄花参等美称, 其根能滋补、强壮、
祛风湿和舒经络, 治病后体虚、腰肌劳损、风湿
关节痛、跌打损伤、急慢性肝炎、子宫下垂和月
经不调(谢万宗等1996)。其根含有皂苷类、糖脂
类、酮类、有机酸类等物质, 具有抗氧化、抗衰
老、抗炎活血、调节血脂、抗病毒等作用(黄锋等
2006; 李浩等2007)。黄花倒水莲夏季开花, 大而长
的黄色总状花序异常美丽 , 具有较高的观赏价
值。据世界健康组织统计, 发展中国家80%人口的
基本医疗保障都依赖于草药(Shinwari和Gilani
2003), 黄花倒水莲药用价值高, 更因早被民间所认
知, 市场需求量大, 黄花倒水莲资源来源均依靠野
生, 但野生资源有限, 过度的采集导致了黄花倒水
莲资源严重短缺, 已被《中国的珍稀植物》评为
近危种(邢福武2005)。因此, 人工繁育成为该植物
资源合理保护、持续开发利用的必要途径。徐宏
江等(2003)在广西调查发现黄花倒水莲在平地田
间栽培不易成活, 而在与野生环境相似的山坡生
境中较易栽培成活; 饶卫芳等(2015)利用IBA处理
使黄花倒水莲扦插生根率达到95%以上。因此, 利
用组织培养离体快繁技术短时间内生产出大量优
质的种苗, 才能缓解野生黄花倒水莲资源不足, 为
黄花倒水莲的开发利用与保护都提供可靠的保
障。前人以黄花倒水莲含腋芽的茎段为外植体进
行组织培养和快繁技术研究已取得成功(刘秀芳等
2012)。本文以黄花倒水莲胚轴、茎段和叶片3种
不同外植体进行组织培养离体快繁技术的研究,
其中利用胚轴诱导丛生芽和利用叶片诱导愈伤组
织进行不定芽分化均是第一次报道, 从多方面、
多途径建立了黄花倒水莲的离体快繁再生体系,
解决了黄花倒水莲繁育问题。
材料与方法
1 试验材料及培养条件
本试验以黄花倒水莲(Polygala fallax Hemsl)
成熟种子为材料, 种子于2012年采自广东省龙门
南昆山省级自然保护区(113°90E, 23°61N), 将成
熟和未成熟的种子用自来水洗净, 用纸擦干, 70%
酒精擦拭30 s, 然后放入0.1%升汞溶液中消毒8
min, 无菌水冲洗5遍后用无菌滤纸吸干水分, 在无
菌操作台上用小刀将种子外种皮去掉 , 接入
MS+BAP 1.0 µmol·L-1 (单位下同)培养基中, 置于
12 h·d-1光周期、光照50 µmol·m-2·s-1、温度25°C的
培养室中培养。7 d左右, 种子开始萌发, 到20 d左
右时, 取幼苗的胚轴为外植体, 30 d左右, 取幼苗茎
段、嫩叶为外植体。
培养基主要成分: MS无机盐、维生素、3%
(W/V)蔗糖和0.6%琼脂, 将pH调节到6.0。
2 试验方法
2.1 黄花倒水莲胚轴外植体诱导不定芽发生
以20 d大的幼苗胚轴为外植体, 分别接入表1
植物生理学报350
中的5种含不同浓度及组合激素的MS培养基中。
培养30 d后观察结果, 记录不定芽诱导率(诱导出
了不定芽的外植体数/外植体总数), 平均不定芽数,
以及不定芽生长状况。
2.2 黄花倒水莲茎段外植体诱导不定芽发生
以1个月大的黄花倒水莲无菌试管苗茎段为
外植体, 将它们切成1.5~2.0 cm大小的茎段, 依次
接入表2中的12种含不同浓度及组合植物生长调
节剂的MS培养基中。每个处理20个外植体, 共4
瓶(12 cm×8 cm), 每个处理重复3次, 30 d后观察结
果, 记录不定芽诱导率, 繁殖系数, 以及不定芽生
长状况。
表1 黄花倒水莲胚轴外植体诱导不定芽发生
Table 1 Effect of PGRs on shoot organogenesis from hypocotyl explants of P. fallax
植物生长调节剂/μmol·L-1 不定芽诱导率/% 平均不定芽数 芽苗生长状况
BAP 2.0 95.3±4.14ab 7.5±0.60b 芽的生长状况良好
TDZ 2.0 85.2±5.01ab 4.6±1.74c 芽瘦小, 生长状况不佳
BAP 2.0+NAA 0.2 100a 12.2±0.80a 少量愈伤, 芽苗生长良好
TDZ 2.0+NAA 0.2 80.2±9.40bc 6.2±1.04bc 大量白色愈伤, 芽生长不佳
BAP 5.0+NAA 0.2 94.6±4.99ab 4.1±1.60c 有部分玻璃化苗产生
　　不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 下表同。
表2 黄花倒水莲茎段诱导不定芽发生
Table 2 Effect of PGRs on shoot organogenesis from stem segment explants of P. fallax
植物生长调节剂/μmol·L-1 不定芽诱导率/% 繁殖系数 芽苗生长状况
BAP 2.0 95.3±4.75ab 3.8±1.14bc 生长状况良好
TDZ 2.0 75.3±13.19bc 2.8±1.35c 基部愈伤化, 芽长势较差
KT 2.0 91.8±7.45abc 3.8±1.51bc 生长状况良好
ZT 2.0 70.1±7.37c 1.7±0.26c 芽瘦弱, 基部有愈伤
BAP 2.0+NAA 0.2 97.2±2.55a 8.0±0.84a 芽苗深绿色、健壮, 生长良好
TDZ 2.0+NAA 0.2 77.4±11.73abc 3.1±0.76c 长势不佳, 有愈伤化
BAP 5.0+NAA 0.2 90.2±6.41abc 3.1±0.76c 叶片、茎干透明, 部分玻璃化
TDZ 5.0+NAA 0.2 72.9±3.55c 1.8±0.35c 叶片、茎干透明, 苗玻璃化
KT 2.0+NAA 0.2 97.9±3.64a 7.8±1.19a 芽苗深绿色、纤细, 生长良好
ZT 2.0+NAA 0.2 77.1±4.45abc 2.5±0.50c 芽苗瘦弱, 生长状况不佳
BAP 2.0+IBA 0.2 91.3±3.63abc 5.9±1.28ab 芽苗深绿色、健壮, 生长良好
TDZ 2.0+IBA 0.2 74.8±12.38bc 2.4±1.06c 芽苗瘦弱, 生长状况不佳
2.3 黄花倒水莲叶片外植体诱导愈伤组织形成
将种苗的叶片分别接入表3中12种含不同浓
度和不同组合激素的MS培养基中。每个处理20个
外植体, 每个处理重复3次, 培养30 d后记录愈伤诱
导率(诱导出了愈伤的外植体数/外植体总数), 将质
量好的愈伤转接至培养基MS+BAP 2.0+NAA 0.2
中, 诱导不定芽发生。
2.4 不同光照强度和有机添加物对黄花倒水莲茎
段增殖和生长的影响
以MS+BAP 2.0+NAA 0.2为基本培养基, 黄花
倒水莲茎段(3 cm)为外植体。将茎段分别放入光
照为0、30、70、100、130 µmol·m-2·s-1的培养室
中培养; 设置MS对照、分别添加蛋白胨1 g·L-1、
香蕉50 g·L-1、椰子汁50 g·L-1为壮苗培养基, 每个
处理20个外植体, 每个处理重复3次, 培养30 d后观
察结果, 统计茎段的增殖系数、每个外植体的鲜
重和茎段平均长度。
2.5 黄花倒水莲试管苗的生根和移栽
以MS为基本培养基, 将3~4 cm高的茎段转接
到IBA 5.0、NAA 5.0、IAA 5.0、2,4-D 5.0、2,4-D
1.0、2,4-D 0.5 μmol·L-1的生根培养基中。30 d后统
计生根率及根系生长状况, 将生根小苗基部清理干
净, 移栽至遮阴温室的混合基质1 (河沙:蛭石:腐殖
质=1:1:2)和混合基质2 (蚯蚓粪:黄泥土=2:1)中, 各
杨国等: 黄花倒水莲的组织培养和快速繁殖 351
100株, 30 d后统计各处理的组培苗移栽成活率。
2.6 数据分析
数据分析和数据处理采用Excel和SPSS16.0软
件, 同列数据后小写英文字母不同者表示经LSD法
检验差异显著(P<0.05), 百分数的差异显著性分析
经过反正弦转换。
实验结果
1 胚轴外植体诱导不定芽发生
由表1可知 , 当以胚轴为外植体时 , 放入含
BAP的MS培养基中, 15 d左右, 外植体开始膨大,
随后形成较多凸起 (图1-A) ; 培养基MS+BAP
2.0+NAA 0.2 (单位μmol·L-1)最利于胚轴诱导不定
芽发生, 诱导率为100%, 平均不定芽数量达12.2个
(图1-B)。BAP浓度增加到5.0时, 不定芽的诱导率
有所下降, 不定芽数量大幅度减少, 而且不定芽分
化出较多无用的愈伤, 芽苗的长势较差, 有部分芽
苗透明水渍状。胚轴在含TDZ 2.0的MS培养基里
诱导产生的不定芽生长状况不佳, 基部白色疏松
愈伤较多。
2 茎段外植体诱导丛芽的发生
由表2可知, 在培养基中单独使用BAP、TDZ、
KT和ZT时, 茎段都能够诱导出不定芽(图1-C), 其
中诱导率最高的是BAP 2.0, 诱导率达到了95.3%,
繁殖系数为3.8; 当这些植物生长调节剂分别和
NAA 0.2结合使用时, 不定芽的诱导率和增殖系数
均高于单独使用, 其中以MS+KT 2.0+NAA 0.2和
MS+BAP 2.0+NAA 0.2这两种培养基的诱导效果
最好, 不定芽诱导率均达97%以上, 后者增殖系数
为8.0, 芽苗深绿色, 生长状况较好(图1-D); 当培养
基中BAP的浓度升高时, 不定芽的诱导率和繁殖系
数则明显下降, 茎段基部容易形成白色、疏松、
水渍状的愈伤, 新形成的芽苗也部分出现玻璃化,
长势较差; TDZ和NAA结合使用时, 芽苗长势差,
诱导效果不理想。
3 叶片外植体诱导愈伤形成
由表3可知, 叶片在2,4-D 2.0的MS培养基培养
15 d, 叶片表面形成大量凸起, 培养30 d, 叶片形成
嫩黄色的愈伤, 较疏松; 将培养基2,4-D浓度升高到
4.0 μmol·L-1时, 培养叶片形成黄绿色紧密的愈伤
组织(图1-E), 诱导率达到54.4%。当BAP、TDZ、
ZT与NAA结合使用, 叶片愈伤的诱导率都比较低,
诱导得到的愈伤质量较差, 无法进一步分化, 若将
诱导出的愈伤转接到MS+BAP 2.0+NAA 0.2培养
基上培养30 d, 发现只有2,4-D诱导出的愈伤组织
可以分化成不定芽(图1-F), 其他的均不能形成不
定芽。
4 不同光照和有机添加物的壮苗效果
在黑暗条件下培养30 d, 茎段的增殖系数非常
低, 芽苗生长缓慢, 80%的芽苗都发生黄化; 当提高
光照到30、70、100或130 µmol·m-2·s-1时, 它们的
增殖系数并无显著差异, 说明在有光条件下, 光照
强弱对不定芽诱导并无影响, 但它们芽苗的生长
状况却存在一定差异, 在30 µmol·m-2·s-1光照培养
30 d时, 芽苗比瘦小且叶片发黄, 当光照增强到70
µmol·m-2·s-1时, 芽苗生长状况有所好转; 光照为100
表3 黄花倒水莲叶片诱导愈伤
Table 3 Effect of PGRs on induction of callus from leaf explants of P. fallax
植物生长调节剂/μmol·L-1 愈伤诱导率/% 愈伤生长状况
BAP 2.0 0e 无
TDZ 2.0 13.5±2.7cd 绿色, 较硬
ZT 2.0 13.7±4.0cd 绿色, 较硬
2,4-D 2.0 39.8±4.7b 嫩黄色、疏松
2,4-D 4.0 54.4±6.5a 黄绿色, 较紧密, 少许不定根
BAP 2.0+NAA 0.2 0e 无
TDZ 2.0+NAA 0.2 14.3±3.3cd 绿色, 较硬
ZT 2.0+NAA 0.2 17.8±2.8cd 白色, 疏松
TDZ 5.0+NAA 0.2 20.7±3.3c 白色, 疏松
BAP 5.0+NAA 0.2 7.1±6.3de 白色, 疏松
TDZ 2.0+2,4-D 0.2 45.3±9.8ab 绿色, 较紧密
BAP 2.0+2,4-D 0.2 11.8±2.7cde 绿色, 较少
植物生理学报352
µmol·m-2·s-1时, 芽苗生长状况最好, 茎段的增殖系
数达8.1, 平均每个外植体的总生物量鲜重为2.1 g,
芽苗平均高达3.0 cm (表4, 图1-G)。
由表5可知, 培养基中添加适量的有机物对茎
表4 不同光照强度对茎段增殖和生长的影响
Table 4 Effect of light intensity on shoot proliferation and growth of P. fallax
光照强度/µmol·m-2·s-1 茎段增殖系数 外植体鲜重/g 平均茎段长度/cm
0 1.9±0.36b 0.4±0.06d 1.2±0.21c
30 7.4±0.36a 1.0±0.15c 1.6±0.15b
70 7.7±0.44a 1.5±0.15b 2.6±0.17a
100 8.1±0.78a 2.1±0.13a 3.0±0.30a
130 7.7±0.32a 1.9±0.16a 2.9±0.21a
段的增殖系数并无影响, 但这三种有机添加物对
不定芽的生长有较大影响, 均能够增加茎段的长
度和鲜重, 其中壮苗效果最好的是50 g·L-1椰子汁,
平均每个外植体的鲜重和芽苗长度最大。
图1 黄花倒水莲不同外植体的离体快繁
Fig.1 Rapid propagation in vitro via different explants of P. fallax
A: 黄花倒水莲胚轴外植体在MS+BAP 2.0培养基上培养15 d左右; B: 胚轴在MS+BAP 2.0+NAA 0.2培养基上培养30 d后的不定芽丛; C:
茎段外植体; D: 茎段外植体在MS+BAP 2.0+NAA 0.2培养基上培养30 d后的芽丛; E: 叶片外植体在MS+2,4-D 4.0培养基上培养30 d后的愈
伤; F: 叶片愈伤组织转接到MS+BAP 2.0+NAA 0.2培养基上继续培养20 d, 形成的不定芽; G: 茎段在MS+BAP 2.0+NAA 0.2培养基上增殖;
H: 茎段在MS+2,4-D 0.5培养基上培养30 d左右, 根系形成; I: 黄花倒水莲幼苗移栽到混合基质(蚯蚓粪:黄泥土=2:1)中, 1个月后长大的植
株。图中标尺=2 mm。
杨国等: 黄花倒水莲的组织培养和快速繁殖 353
表6 黄花倒水莲的生根培养
Table 6 Rooting of P. fallax
植物生长调节剂/μmol·L-1 生根率/% 平均生根数量
NAA 5.0 40.5±8.15c 1.6±0.60c
IBA 5.0 36.6±4.74c 2.0±0.56bc
IAA 5.0 37.6±11.19c 1.3±0.20c
2,4-D 5.0 76.8±6.53b 2.8±0.66b
2,4-D 1.0 90.9±4.72a 3.9±0.40a
2,4-D 0.5 95.3±5.91a 4.5±0.51a
5 黄花倒水莲生根和移栽
将4 cm左右的芽苗接入各类生根培养基中,
研究发现, NAA、IBA、IAA、2,4-D这几种生长素
都能够诱导黄花倒水莲生根, 其中2,4-D的生根效
果较好(表6), 当使用2,4-D 0.5时, 生根率达95.3%,
平均生根数量为4.5 (图1-H), 2,4-D浓度高于0.5
μmol·L-1时, 芽苗基部容易形成愈伤, 不易生根。
有类似的发现, Thomas和Shankar (2009)研究发现
培养基MS+BAP 4.0+NAA 1.0最利于药用植物Sar-
costemma brevistigma丛生芽的诱导, 同样, BAP对
美国红叶紫薇、楝树、穿心莲等丛生芽的诱导作
用明显(陈怡佳等2015; Husain和Anis 2009; Pur-
kayastha等2008)。本研究发现2,4-D有利于黄花倒
水莲叶片外植体愈伤的诱导, 而2,4-D也大量应用
于其他植物的愈伤诱导中, Gueye等(2009)发现
2,4-D对枣椰树叶片愈伤的诱导有着较佳的效果,
甘蔗茎尖在2,4-D培养基上能诱导出黄色、紧密、
节状的愈伤组织(Tahir等2011)。通过植物愈伤组
织培养获取次生代谢产物的技术已得到了广泛的
应用(Robles-Martínez等2016), Cetin (2014)研究发
现紫外线处理能显著地提升了葡萄的愈伤组织次
生代谢产物的积累; 同样, 愈伤组织的培养也是获
得转基因植株的关键因素之一(Lai等2014)。添加
适量的有机添加物能够促进黄花倒水莲芽苗的生
长, 有壮苗的效果。在兰科植物的组培中, 有机添
加剂经常用于促进原球茎和不定芽的生长, 添加
适量的有机添加物能有效的改善万代兰原球茎的
增殖(Gnasekaran等2012)。
随着人类对药用植物的需求增加, 野生的药
用植物资源已经无法满足市场的需求, 特别是一
些珍稀的药用植物, 受到人类无节制的采集, 其种
群数量和生境面积已日益减少。组织培养离体快
繁技术已成为保护和利用这些珍稀药用植物资源
必不可少的技术手段, 大量的珍稀药用植物已经
通过组培离体快繁技术实现了资源的保存, 并解
决了市场的需求(Amoo等2009; 马英姿等2015;
Guo等2007)。本文从多角度研究了黄花倒水莲组
织培养和离体快繁技术, 解决了这种珍稀药用植
物繁育问题, 能够短时间内生产出大量优质的种
苗, 缓解了黄花倒水莲野生资源的压力, 为黄花倒
水莲的开发利用与保护提供了可靠的保障, 黄花
表5 不同有机添加物对茎段增殖和生长的影响
Table 5 Effect of organic additions on shoot proliferation and growth of P. fallax
有机添加物 茎段增殖系数 外植体鲜重/g 平均茎段长度/cm
MS对照 7.4±0.56a 1.43±0.15c 1.8±0.26c
蛋白胨1 g·L-1 8.0±0.71a 1.87±0.12b 2.6±0.40b
香蕉50 g·L-1 8.0±0.85a 1.80±0.20b 2.4±0.35b
椰子汁50 g·L-1 8.3±0.96a 2.40±0.17a 3.3±0.15a
选取生长良好的生根幼苗, 用自来水将生根
的黄花倒水莲幼苗基部清理干净, 再将小苗移栽
至遮阴温室的混合基质1 (河沙 :蛭石 :腐殖质
=1:1:2)和混合基质2 (蚯蚓粪:黄泥土=2:1)中, 30 d
后。结果发现, 混合基质1的幼苗成活率达85.0%,
混合基质2的幼苗成活率达95.0% (图1-I)。
讨　　论
本试验以黄花倒水莲的胚轴、茎段、叶片三
种材料作为外植体, 通过两种途径构建了黄花倒
水莲的植物再生体系, 第一种是丛生芽的诱导, 第
二种是通过愈伤组织诱导器官发生。本研究发现
BAP和NAA结合的MS培养基非常利于丛生芽的
诱导, 胚轴在MS+BAP 2.0+NAA 0.2培养基上, 丛
生芽的诱导率达到100%, 不定芽诱导数为12.2, 茎
段在相同培养基上, 丛生芽的诱导率也高达97.2%,
增殖系数为8.0; 在其他植物的组织培养研究中也
植物生理学报354
倒水莲愈伤组织的成功诱导也为日后次生代谢产
物的提取以及转基因育种方面的研究奠定了实验
基础。
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Tissue culture and rapid propagation in vitro of Polygala fallax
YANG Guo1, LUO Jie3, MO Yi-Wei1, CHEN Hong-Feng2,*
1Shaoxing University, Academy of Life Science, Shaoxing, Zhejiang 312000, China; 2South China Botanical Garden, Chinese
Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 3Shaoxing University, Academy of Yuanpei, Shaoxing, Zhejiang 312000, China
Abstract: The regeneration system of tissue culture of Polygala fallax was established by utilizing its in vi-
tro-derived hypocotyl, stem and leaf as explants. We analyzed the differentiations characteristics of different
explants, and discussed affecting factors of tissue culture of hormone, light and additional nutrient. The results
showed that MS+BAP 2.0 µmol·L-1+NAA 0.2 µmol·L-1 was most suitable for adventitious buds induction from
stem and hypocotyl explants, the callus were induced on MS+2,4-D 4.0 µmol·L-1 from the leaf explants, and
achieved 54.4% induction rate after 30 days, adventitious buds appeared from the surface of callus induced on
MS+BAP 2.0 µmol·L-1+NAA 0.2 µmol·L-1 after 20 days. The plantlets grew well when the light was 100
µmol·m-2·s-1, 1 g·L-1 peptone, 50 g·L-1 coconut juice and 50 g·L-1 banana were good for cultivating strong seed-
ling. The best rooting medium was MS+2,4-D 0.5 µmol·L-1, the rooting rate has reached 95.3%, Plantlets were
transplanted to a potting mixture (2:1, wormcast: yellow mud) in trays with about 95% survival percentage.
Key words: Polygala fallax; medicinal plant; tissue culture; rapid propagation in vitro
Received 2015-12-25 Accepted 2016-01-31
This work was supported by Forestry Scientific Innovation Project of Guangdong (Grant No. 2015KJCX037) and Project of Shaoxing University.
*Corresponding author (E-mail: h.f.chen@scbg.ac.cn).