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中 国 药 科 大 学 学 报
Jo ur n aloi f C hn aP h arm ae e uti e al Uni v er si t y20 0 2
,
3 3 ( 5 )
: 4 1 2 ~ 4 1 5
黄花倒水莲中 T E N U IFI LI N 的毛细管电泳分析
刘 峻 , 徐宏江 , 朱丹妮 `
(中国药科大学中药复方研究室 , 南京 2 1 0 0 3 8)
摘 要 目的 建立 了毛细管电泳测定黄花倒水莲 中 eT im i ifl in 皂等含量的方法 。 方法 采用胶束 电动毛细
管电泳 ( 40 c m 义 75 以m 未涂层石 英毛细 管 ) 对不 同来源得黄花倒水莲提取物中 eT nu if l jn 皂等 的含量进行 了测定 ,
电泳分离条件 : 2 8 m m o z / L 硼砂缓冲液 , 5 0 m m o l / L S D S , p H 8 . 9 , 分 离电压 1 5 k v , 检汉,1波长 2 1 4 n m 。 结果 在 10 m l n
内可 以 完成样品 中皂普的含量测定 , 线性 范围」一 10 陀 / m1 , 各产地黄花倒水莲 中 eT im iifl in 的含量在 1 . 02 一 3 . 科
陀 / g 之 间 。结论 该方法可 用 于黄花倒水莲的质量控制 。
关键词 黄花倒水莲 ; 皂普 ; 毛细 管电泳
中图分类号 : R Z s d . l 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 0 一 5 0 4 8 ( 2 0 0 2 ) 0 5一 0 4 1 2一 0 4
黄花倒水莲为远志科远志属植物黄花倒水莲
( oP lyga 故 fa ha
`
H
e m .sl ) 的干燥根 , 广泛分布于华南 ,
西南等地 , 民间多用于治疗病后体虚 、 急 J漫性肝炎 、
肾炎水肿 、 子宫脱垂等疾病 〔`」。 现代研究表明 ,其根
含有皂昔 、 多糖 、 有机酸 、 氨基酸等成分 ,具有抗衰
老 、 改善心肌缺 血 , 免疫调节等作用 〔 2一” 〕。 近来临床
上用于调节血脂取得了良好的效果 。
本研究室对黄花倒水莲进行了一系列的基础
研究 ,并从中分离得到 T en ul ifl in s[] 。本文首次报道
用毛细管 电泳测定广西产黄花倒水莲中 eT n u if iln
含量的方法 ,为黄花倒水莲的质量控制及进一步开
发利用提供科学依据 。
水
实验部分
仪器及试剂
1
.
1 仅器
毛细管电泳仪 ( B e e k m a n e o u l t e r 公司 ) , o A o 检
测器 ,未涂层毛细管柱总长 47 c m ,有效柱长 40 c m ,
内径 75 拼m (河北永年光导纤维厂 ) 。
1
.
2 试剂与样品
黄花倒水莲采 自广西 ,经中国科学院江苏植物
所 徐 增 莱 博 士 鉴 定 , 对 照 品 T en iu ifl in 自制 ,
经 `H N M R , ` 3 C N M R , D EPT 谱鉴定并与文献对照 〔5 〕
为 T en ul ifl in ,经 H P L C 面积归一法测定纯度为 98 %
以上 , 其他所用试剂均为分析纯 ,实验用水为重蒸
2
.
1 供试品制备
取黄花倒水莲粗粉 2 9 , 用 10 倍量水浸泡 h3 后 ,
煎煮 hl ,过滤 ,药渣重复煮 2次 , 合并水提液 , 上 D , 。 l
大孔树脂柱 , 用水冲至费林试剂无糖反应 , 然后用
不同浓度的乙醇洗脱 ,收集 70 % 乙醇洗脱液 , 回收
乙醇至干 ,备用 。
2
.
2 电泳条件
将所提取的样 品用水溶解 为 1 m g / ml 溶液后
直接进样 。样品溶液 ,对照品溶液 ,缓冲液在进样前
均需预先用 0 . 2 件m 微孔滤膜过滤 ,未涂层毛细管
柱运行前均用 0 . 1 m ol / L N a o H 溶液和重蒸水分别
冲 洗 s m in , 每 次运 行 前均 用 硼砂 缓 冲 液 冲洗 2
m in
, 以 15 k v 作为操作 电压 , 控制 毛细 管柱温 为
25 C
,在 p H 8 . 9 、 28 m m of / L 硼砂缓 冲液条件中添
加 5 0 m m o 一/ L 5 0 5 , 检 测 波 长 2 1 4 n m 。 供试 品 中
T e n u i f i一i n 皂普与其他成分获得较好分离 , T e n u if i li n
皂昔对照品及黄花倒水莲供试 品毛细管电泳分离
见图 1 。
2
.
3 线性范围考察
精密称取 T en iu ifl in 对照品适量 ,置于量瓶 中 ,
用甲醇溶解并用水稀释至刻度作为对照品储备液 ;
收稿 日期 2 0 0 2一 0 2一 2 0 二通讯作者 T e l : 0 25 一 5 3 9 1 04 2 E 一 : n a i一: s h l j n g a o @ j l o n 一i n e . c o m
5期 刘 峻等 :黄花倒水莲中 T EN ul FI LI N 的毛细管电泳分析 4 1 3
分别 精 密吸取上 述溶 液 , 用 水稀 释成 每 l m l 含
T e n u i f il i
n 1 0睁g 的标准溶液 。 精密量取 l , 2 , 4 , 6 , 1 0
m l
, 用水稀释到 10 m l ,在上述 电泳条件下测定 , 以
迁移时间平均为 8 . 13 8 m i n , R S D 为 0 . 8 5% , 峰面积
平均为 3 5 6 7 , R S o 为 1 . 7% 。结果见表 l 。
T a 走〕 1 . R e P r o d u e i b l l l t y d a t a f o r T e n 日 i f j l in
峰面积 ( A )为纵坐标 , 浓度 印g / m )J 为横 坐标 , 得线
性 回归方程为 : 了一 27 2 . 3 x 一 19 . 94 , 7一 0 . 9 9 9 2 ( 。
二 6 ) ; T e n u i f i l in 的线性范围一 1 0 尽g / m l 。信噪比为
3时其检测限为 0 . 5 妙g /叫 。
2
.
4 进样精密度试脸
取适当浓度 T en iu ifl in 对照品溶液 ,连续进样 6
次 ,分别用迁移时间 ( T : )和峰面积 ( A ) 考察精密度 , 一
M ig
r a t i o n t宜m e
( m i n )
P e a k a r e a r a t i o
8
.
2 0 8
8
、
14 2
8
.
1 4 6
8
.
2 0 8
8
.
1 0 0
8
.
0 2 5
35 39
36 0 4
3 4 6 8
3 6 2 5
3 6 15
3 5 5 2
0 0 0 2 0
0 0 0 18
0 0 0 16
0 0 0 14
0 0 0 12
0刀 0 10
0刀 0 0 8
0 0 0 2 6
0
.
0 0 2 4
O乃0 2 2
0 0 0 2 0
O乃0 18
0 0 0 16
O乃 0 14
0 0 0 12
5刀 6 0 7刀 8 0 9 0
t / m In
1 0
.
0 11 0 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 8
.
5 9 0 9 5 10
.
0 10
.
5
l / m In
F 19 1一 1
.
E l e e t r o Ph o r o g r a m a t l a s o f e x t r a e t i o n f r o m P A D
.
P e a k 2
.
T e n u i f i l i n
.
2
.
5 稳定性试验
取上述对 照品溶液 , 每隔 l h 进样一次 , 共考
察 6 h , 计算峰 面积 , T e n u i f i l in 峰面积的 R S D 分别
为 1 . 6% 。
2
.
6 重复性试验
取 6份样品溶液 , 分别测定 T en ul ifl in 的含量 ,
结果表 明重复性 较好 , eT nu if h n 皂普含量为 3 . 15
尽g / m g , R s D 为 2 . 9% 。
2
.
7 加样回 收率试验
取 已知含量 的样 品溶液 , 定量加 入 T e n u if l in
对照品适量 ,按含量测定方法进行测定 ,计算回收
率 ,平均为 9 9 . 2 % , R S D 为 2 . 1% 。结果见表 2 。
T a b 2
.
R e e o v e r y o f T e一l u if i l i n
F 19
_
2
.
E ]e e t r o Ph o r o g r a r n o f s t a n d a r d
将不同产地的黄花倒水莲 (均产 自广西 )按 2 . 1
供试品制备项下提取 ,制成含提取物 1 m g /ml 的溶
液 ,在以上条件下进样分离 ,测定各产地黄花倒水
莲中含该皂普的含量 , 结果表明各地黄花倒水莲中
T o n u i f i l in 的含量有差别 , 根中 T e n u i f i li n 含量比茎
中略高 ,各地药材 中 T en iu ifl in 的含量见表 3 。
T a b 3
.
C o n t e n t o f T e n u i f i l i n i n d i f f e r e n t s a m P l e s
C o n t e n t ( , g / m l )
S O U r C e
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走心 Il g s h e n g
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\ V 之I n t i a n
2
.
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3 4 1
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2 2 1
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S a m P Ie
a m o U n t
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A d d e d F O U fl d
(协g / m ! ) ( 协g / m 一)
R e e o v e r y
(写 )
A v e r a g e
(% ) 3 讨 论
2
.
8 不 同产地黄花倒水莲中 eT mi if l in 含量测定
在中药的毛细管 电泳分析 中 , 使用 M E C C (胶
莱 电的毛细管电泳 )法分离的报道较 多 , M E C C 可
妙、使中性成分也能分离 . 本实验采用了 M E C C 分离
黄花倒水莲中皂昔类成分 ,条件优化前对温度影响
进行了预实验 , 发现随着温度升高 ,样品迁移时间
缩短 , 部分峰有重叠 ,而在 2 5 ` C 时分离较好 ,原因在
41 4中 国 药 科 大 学 学 报 3 3卷
大热效应 。缓冲液对迁移时间的影响见图 3。
n气é U 0ù U n工、ó八é 1 0住从 9民 8认 6它 .ó` . J. 1
u lu l泛
。日一侧 uo l-门ì助工芝
于高温下缓冲液私度减小 , 电渗流相应增加 。 因此
在实验过程中均采用 2 5 ` C 。 同时选择样品分离图中
相近的 3个组分峰 , 对 p H 、 缓冲液浓度 、 S D s 浓度等
影响因素进行了考察 。
3
.
1 P H 影响
缓冲液酸碱度对样品组分的电泳行 为有较大
影响 。 因 p H 可影响毛细管 内壁的硅醇基含量 ,进
而影响到 电渗流 ( E O F ) , 而电渗流是样 品在缓冲液
中迁 移的推动力 。 因此 ,对缓冲液 的 p H 调节与控
制往往可 以有效优化分离 。缓冲液 p H 对样品分离
的影响见图 2 。
三已七
。tUll uoll门J沙芝
8 7 8
.
8 8 9 9
.
0
PH v a lu e
9 1 9 3 9 5
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八曰Q子矛On01,才.了幻乙UJ.1
一 . 一 T e n u i f i l i n
F 19 2
,
E l e e t r o Ph o r e s i s m i g r a t i
o n t im
e o f 3 e
o
m P
o n e n t s i n d i f f e r e n t P H
v a l u e 40 m m
o l / L b o r a x
,
40 m m o l / L S D S
,
1 5 k v
, e f f e e t i v e e a p i l l a r y
l e n g t h 15 4 0 e m
.
d e t e e t i o n w a v e l e n g t h 2 1 4 n m
·
实验中比较了各样 品在不同 p H 缓冲液 中的
迁移行为 ( p H 8 . 7 ~ 9 . 5 ) , 可以看出 , p H S . 7时组分
2
、
3不能达到正常的基线分离 , 随着 p H 增加 , 各组
分迁移时间逐渐增大 , 2 、 3之间分辨率得到改善 ,但
当 p H> 9 · 1后 ,峰型变差 ,组分 3对电渗流的改变较
敏感 , 与后面的峰相重合而不能分开 。 因此最后选
择了 p H 8 . 9的缓冲液来进行下一步优化 。
3
.
2 缓冲液浓度影响
选用 4 0 m m o l / L S D s 的 缓 冲液 , 在 1 5 一 4 0
m m ol / L 间选用了 6个浓度来进行优化 。从结果可以
看 出 , 缓冲液浓度增加 , 可使组分的迁 移时间明显
延长 ,并使峰型及分辨率也有较大变化 , 低浓度时 ,
组分 2 、 3不能分开 ,高浓度时各组分均能较好的分
开 。 这是由于缓冲液浓度增加 ,使毛细管壁双 电层
中扩散层变薄 , ez at 电位降低 , 电渗流减少而致 。但
当其浓度 > 30 m m of / L 时 , 其 电流过大 。 由于电流
大会使管 内温度增加 , 产生热效应 ,使分离组分径向
扩散增加 ,对分离不利 。最后选择 28 m m ol / L bo r aX 的
缓冲液 ,可保证在得到较好分离度的同时不产生较
B o r a x C / 一n m o 】· I J `
一 . 一 T e n u i f i l j n
F i g 3
.
E le e t r o p h o r e s i s m ig r a t i o n t im e o f 3 e o m P o n e n t s j n d i f f e r e n t b o r a x
e o n e e n t r a t i o n P H 8
.
9
, o t h e r e o n d i t i o n s a s F i g 1
.
3
.
3 S D S 浓度的影响
在 M E C C 的分离过程中 , 样品组分的分离与其
分子量大小及疏水性有关 。疏水性不同的样品在缓
冲液和相对疏水的胶束 内部之间分配 ,然后以不同
迁移速度通过毛细管 。 使用该方法可以排除高含量
组分的干扰 , 并能分离在 C Z E 中无法分离的电中
性药物 , 因此 在天然药物及 中成药分离中使 用较
多 。在本实验 中对 25 一 60 m m ol / L S D S 进行 了选
择 , 在较低浓度下 , 组分 2 、 3不能分离 , 甚至相互重
合 , 在浓度达到 40 m m ol / L 以后 , 3个组分分离较完
全 , 最后选用了 50 m m ol / L 的 S D S 为分离条件 , 能
使各峰分离较好 。 s D S 对组分分离影响见图 4 。
日资
。utz倒uoll.ó妙芝
2 5 3 5 4 0 5 0 6 0
S D S C 八n m o l · L ’
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才ū21 1
一 . 一 T e n u i f j l j n
F i g 4
.
E l e e t r o p h o r e s i s m i g r a t j o n t im
e o f 3 e
o
m P
o n e n t s i n d i f f e r e x飞 t S D S
e o n e e n t r a t i o n P H 8
.
9
, 2 8 m m
o l / L b o r a x
, o t h e r e o n d i t i o n a s F i g 2
.
3
.
4 毛细管电泳在中药复杂成分分析中的应用不
断增加对于无紫外吸收的皂普类成分的分离应用
有较好效果 ,本文进行 了黄花倒水莲中皂昔类成分
的含量测定 , 为黄 花倒水莲的质量 控制提供 了依
据 。
参 考 文 献
[月 中国药科大学主编 . 中药辞海 〔M 〕 ,第三卷 . 北京 : 中国医药科
5期 刘 峻等 :黄花倒水莲中 TE Nu IF I班N 的毛细管电泳分析 组 1 5
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H e t a n o d a i
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e m
.
R E S U L T S S
e P a r a t i o n e a n b e e o m P l e t e d w i t h i n 8 m i n a r l d e a n b e w e l l t o d e t e r m i n e t h e t e n e u i f o li n i n s a m Pl e
.
C O N C L U S IO N T h e s a P o n i n e a n b e e f f i e i e n t l y s e P a r a t e d b y M E C C
.
K E Y W O R D S OP ly ga 勿 af ha x H e m s l ; t e n e u i f o l i n ; C a Pi l la r y 三l e e t r o P h o r e s i s
会 讯 。
中国制药工业发展论坛
暨 “ 中国制药工业药理学会20 周年学术会议 ”
2 0 0 2年 1 0月 18 一 2 日 , 由中国药理学会制药工业 专业委员会 _」三力、的 “ 中国制药工业发展论坛 ” 暨 “ 中国制药工业药理学
会 20 周年学术会议 ” 在成都举行 ,来自全国新药研发权威机构与制药工业界代表近三百人参加会议 , 会议取得圆满成功 。
会议议题与演讲嘉宾 : ①多中心临床试验与桥接研究 (中国药品生物制品检定所所长 桑国卫 ) ; ②创新药物研究的现
状与特点 (中国药品生物制品检定所名誉所长 周海钧 ) ; ③《药品管理法实施条例 分中涉及药品注册条款的理解及贯彻意 见
(国家药品监督管理局注册司司 长 曹文庄 ) ; ④药品不 良反应监涣 经作的现状与展望 ( 国家药品不 良反应监测中心 , s D A 药
品评价中心副主任 曹立亚 ) ; ⑤新药药理毒理审评的思路和观念 ( S D A 药品审评中心二部药理毒理组组长 彭 健 ) ; ⑥国
家“ 卜五 ” 创新药物研发重点任务和申报技术要求 (国家科技部中国 2 1世纪议程管理中心处长 曲凤宏 ) ;⑦ G L P 实施中的监
督检查 (国家药品监督管理局安监处 李茂忠 ) ; ⑧中药现 代化 “ 十五 ” 进展情况 ( 国家中医药管理局科技教育司中药科技处
副处长 杨龙会 ) ;⑨中药专利保护 ( 国家知识产权局化学审查一部中药处处长 张伟波 ) ; L新药的研究 与开发 (中国药科
大学教授 廖清江 ) ; @ 药物代谢和动力学在新药设 计及研究中的作用 ( 中国药科大学副校长 王广基 ) ; L药物制剂研发的
分子生物药剂学基础 (中国药科大学药学院院长 平其能 ) ; L血脑屏障与 P 一糖蛋白 (中国药科大学教授 刘 国卿 ) ; L中药
指纹图谱的研究 一与实践 (北京大学中医药现代化研究中心副主任 屠鹏飞 ) ;L中药新药临床前安全性评价 ( 中国药科大 学
国家新药筛选屯点实验室主任 张陆勇 ) ;L基因芯片技术及其在 J冲瘤和新药研究中的应用 (上海 医药工业研究院药理 室主
任 刘全海 ) 。
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