全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (12): 1764~1768　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.10341764
收稿 2014-10-15　　修定 2014-12-04
资助 国家大麦青稞产业技术体系(CARS-05)和上海市农业科学
院学科领域建设专项(LY11)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: sw1@saas.sh.cn; Tel: 021-62201032)。
青稞的小孢子离体培养和植株再生
陆瑞菊1,*, 高润红1,*, 郭桂梅1, 何婷1, 陈志伟1, 徐红卫1, 李颖波1, 黄亦辰1,2, 杨沙沙1,2, 刘成洪1,
黄剑华1,**
1上海市农业科学院生物技术研究所, 上海市农业遗传育种重点实验室, 上海201106; 2上海海洋大学水产与生命学院, 上海
201306
摘要: 以6份青稞品系为供试材料, 研究提取和预处理过程中在提取液中添加ABA和秋水仙碱对小孢子活力的影响, 以及诱
导培养基中添加不同浓度亚精胺、2,4-D和麦芽糖对愈伤组织诱导和绿苗分化产量的影响。结果表明在提取和预处理过
程中提取液中添加秋水仙碱均可以提高青稞小孢子活力, 诱导培养基中添加亚精胺可以提高愈伤组织诱导和绿苗分化产
量, 愈伤组织诱导培养基中2,4-D 1.5~2.0 mg·L-1和麦芽糖60~90 g·L-1浓度比较适合青稞小孢子的培养。
关键词: 青稞; 小孢子培养; 愈伤组织产量; 绿苗产量
Microspore Culture and Plantlet Regeneration of Highland Barley (Hordeum
vulgare var. nudum)
LU Rui-Ju1,*, GAO Run-Hong1,*, GUO Gui-Mei1, HE Ting1, CHEN Zhi-Wei1, XU Hong-Wei1, LI Ying-Bo1, HUANG Yi-Chen1,2,
YANG Sha-Sha1,2, LIU Cheng-Hong1, HUANG Jian-Hua1,**
1Shanghai Key Lab of Agricultural Genetics and Breeding, Biotech Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences,
Shanghai 201106, China; 2College of Fishery and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract: The six lines of highland barley was used to investigate the effect of abscisic acid (ABA) and colchi-
cines in extraction buffer on the microspore viability in the process of extraction and pretreatment, and the ef-
fects of spermidine, 2,4-D and maltose concentration in induction medium on the yields of callus and green
plantlets. The results showed that the microspore viability in the process of extraction and pretreatment could
be improved by the addition of colchicines in extraction buffer, and the yields of callus and green plantlets
could be increased by the supplement of spermidine in induction medium. The induction medium supplemented
with 2,4-D 1.5–2.0 mg·L-1 and maltose 60–90 g·L-1 was suitable for highland barley microspore culture.
Key words: highland barley; microspore culture; callus yield; green plantlet yield
青稞(Hordeum vulgare var. nudum)又称裸大
麦, 为禾本科大麦属作物, 原产我国, 是青藏高原
的特色物种(栾运芳等2009), 更是藏区农牧民的主
要粮食(苟安春2004)。小孢子培养技术可以为青
稞的遗传改良提供加倍单倍体育种方法(黄剑华
2003), 为青稞的分子生物学研究提供永久性作图
群体。青稞的组织培养和花药培养已获成功(张金
辉等2005; 王亦菲等2010), 与花药培养相比, 小孢
子培养由于去除了药壁组织, 解除了小孢子个体
之间的营养和空间竞争, 因而培养效率更高, 但技
术也更为复杂, 由于没有了花药壁的保护, 完全暴
露在提取液中的小孢子活力受到严重影响, 小孢
子活力的下降又影响到愈伤组织的形成, 尚未见
到青稞小孢子培养再生植株的研究报道。本实验
室以大田种植的青稞为材料, 通过多年的研究, 获
得了游离小孢子培养再生植株的研究结果。本文
报道了在提取液中添加ABA和秋水仙碱对小孢子
活力的影响以及诱导培养基中添加不同浓度的亚
精胺、2,4-D和麦芽糖对青稞小孢子培养形成的愈
伤组织产量以及分化培养后绿苗产量的影响。
材料与方法
1 材料
供试材料为大田种植的6个青稞(Hordeum
vulgare L. var. nudum Hook. f.)品系Z-1026、
陆瑞菊等: 青稞的小孢子离体培养和植株再生 1765
Z-0671、P8、喜马拉雅19号、P181和P183。
2 方法
2.1 小孢子提取和预处理
从大田选取中部小花中小孢子发育处于单核
早期、中期的穗子, 放入冰箱冷藏15 d。接种时,
穗子用饱和的漂白粉溶液消毒15 min, 无菌水冲洗
3~4次。每个试管接10个穗子, 倒入15 mL提取液,
用高速分散器超速旋切, 用150目筛网过滤, 滤液
以100×g、5 min低速离心, 重复3次, 收集小孢子。
小孢子在提取液中在25 ℃下黑暗预处理2 d。
小孢子提取液以6%甘露醇溶液添加CaCl2 1.1
g·L-1和MES 0.976 g·L-1作为对照, 以添加ABA 1
mg·L-1或秋水仙碱125 mg·L-1作为处理。提取液采
取过滤灭菌。
小孢子活力采用FDA (fluorescein diacetate)法
测定。先将FDA母液配成1 mL丙酮溶液中含5 mg
FDA, 置于4 ℃冰箱中保存。测定时用0.3 mol·L-1
的甘露醇溶液配成4 µg·mL-1的工作液, 取10 µL小
孢子悬浮液于载玻片上, 加10 µL FDA工作液, 10
min后盖上盖玻片, 在倒置荧光显微镜下观察。
2.2 愈伤组织诱导
将预处理后的小孢子用诱导培养基洗涤1次,
然后用诱导培养基将小孢子密度调节至1.0×105·mL-1,
取1 mL小孢子悬浮液接种于培养皿(35 mm×15
mm), 用封口膜封口, 25 ℃暗培养。培养21 d时吸
干培养液后测定愈伤组织重量, 单位为mg·皿-1。
诱导培养基以改良的N6培养基为基本培养基,
添加KT 0.5 mg·L-1、2,4-D 1.0 mg·L-1、麦芽糖90
g·L-1, 以此培养基作为对照, 另添加不同浓度的亚
精胺、2,4-D或麦芽糖作为处理培养基。诱导培养
基采取过滤灭菌,
2.3 愈伤组织分化与生根
将诱导培养基上培养21 d的愈伤组织, 转接到
分化培养基上, 25 ℃培养, 每天光照12 h, 10 d左右
开始形成绿苗, 以每个培养皿中愈伤组织在45 d之
内分化出的绿苗数量作为绿苗产量, 单位为株·皿-1。
待分化形成的绿苗长至1.5~2.0 cm高时, 及时
转移至生根培养基上, 培养温度及光照同分化, 3 d
后植株基部陆续发根, 30 d左右进行生根率的统计
并炼苗移栽。
分化培养基以MS为基本培养基, 添加6-BA
0.5 mg·L-1、KT 1.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1、麦
芽糖30 g·L-1。生根培养基以1/2MS为基本培养基,
添加NAA 0.05 mg·L-1、矮壮素3 mg·L-1、蔗糖30
g·L-1, 分化和生根培养基用6 g·L-1琼脂粉固化, 121
℃高温灭菌15 min。每个实验设3个重复。
实验结果
1 提取和预处理过程中在提取液中添加ABA和秋
水仙碱对小孢子活力的影响
在大田栽培条件下, 青稞的小孢子活力较低,
2份供试材料(Z-1026和Z-0671)的小孢子活力均低
于20%, 在提取液中添加ABA 1 mg·L-1后2份材料
的小孢子活力明显下降, 与对照相比差异达到显
著水平, 而且Z-0671的小孢子活力更低; 在提取液
中添加秋水仙碱125 mg·L-1后2份供试材料的小孢
子的活力与对照相比均显著提高(图1-A)。在相同
的提取液中经过25 ℃、2 d的预处理后, 小孢子活
力明显下降, 特别是在添加了ABA的提取液中, 小
孢子全部死亡; 在添加秋水仙碱的提取液中, 与预
处理后的对照相比2份供试材料的小孢子活力显
著提高, 材料Z-1026的小孢子活力提高幅度达到
图1 提取液中添加ABA和秋水仙碱对小孢子活力的影响
Fig.1 Effect of abscisic acid and colchicines in extraction buffer on the microspore viability
A: 提取液中小孢子活力; B: 提取液中经25 ℃、2 d预处理后小孢子活力。各图的柱形上不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 下图同。
植物生理学报1766
90%, 材料Z-0671的小孢子活力的提高幅度达到
139% (图1-B)。因此在提取和预处理过程中提取
液中添加秋水仙碱都有利于提高青稞小孢子的活
力。另外本研究中2 d的预处理虽然使小孢子的活
力下降, 但是活下来的小孢子更容易形成愈伤组
织和分化成绿苗(陆瑞菊等2001)。
2 诱导培养基中添加亚精胺对青稞小孢子培养愈
伤组织诱导和绿苗产量分化的影响
以P8和喜马拉雅19为供试材料, 比较了诱导
培养基中添加亚精胺21.8 mg·L-1对愈伤组织产
量诱导和绿苗产量分化的影响, 从图2可以看出,
诱导培养基中添加亚精胺对青稞小孢子培养的
愈伤组织形成和绿苗分化有很大的促进作用, 尤
其是绿苗产量分化。在不含亚精胺的对照培养
基上尽管可以形成愈伤组织, 但这些愈伤组织没
有分化出绿苗, 而在添加亚精胺的诱导培养基上
不仅愈伤组织产量有了大幅度提高, 在分化培养
基上还分化出了绿苗。以P181为材料 , 进一步
优化了诱导培养基中亚精胺浓度 , 结果表明在
10.9~32.7 mg·L-1浓度范围内, 添加亚精胺的培养
效果优于不添加的 , 最佳的亚精胺浓度为21.8
mg·L-1。
图2 诱导培养基中添加亚精胺对青稞小孢子培养愈伤组织和绿苗产量的影响
Fig.2 Effect of spermidine in induction medium on the yields of callus and green plantlets
图3 诱导培养基中2,4-D浓度对愈伤组织诱导和绿苗产量分化的影响
Fig.3 Effect of 2,4-D concentration in induction medium on the yields of callus and green plantlets
3 诱导培养基中2,4-D浓度对青稞小孢子培养愈伤
组织诱导和绿苗产量分化的影响
以P183为材料, 比较了诱导培养基中2,4-D浓度
对青稞小孢子培养愈伤组织诱导和绿苗产量分化
的影响。从图3可以看出, 愈伤组织诱导和绿苗产量
分化总体上随着诱导培养基中2,4-D浓度的上升而
增加, 诱导培养基中2,4-D浓度为1.5 mg·L-1时愈伤组
织产量最高, 2,4-D浓度为2.0 mg·L-1时愈伤组织分化
成绿苗的产量最高, 因此诱导培养基中较高的2,4-D
浓度(1.5~2.0 mg·L-1)有利于青稞的小孢子培养。
4 诱导培养基中麦芽糖浓度对青稞小孢子培养愈
伤组织诱导和绿苗产量分化的影响
以P183为材料, 比较了诱导培养基中麦芽糖
浓度对青稞小孢子培养愈伤组织和绿苗产量的影
响。从图4可以看出诱导培养基中麦芽糖浓度为60
g·L-1时, 愈伤组织产量诱导最高, 绿苗产量分化也
最高。从图4还可以看出 , 麦芽糖浓度在60~90
g·L-1时, 愈伤组织产量和绿苗产量的变化趋势虽有
差异, 但相差不大, 当培养基中麦芽糖浓度上升至
105 g·L-1时愈伤组织和绿苗产量分化下降明显, 因
陆瑞菊等: 青稞的小孢子离体培养和植株再生 1767
此在所测试范围内适合青稞小孢子培养的诱导培
养基中的麦芽糖浓度为60~90 g·L-1。
5 青稞小孢子再生植株的生根与移栽
青稞小孢子在诱导培养基上培养5~7 d时形成
多细胞结构(图5-A), 培养14~18 d时形成肉眼可见
的愈伤组织, 将培养21 d的愈伤组织(图5-B)转移至
分化培养基后10 d左右开始分化形成绿苗(图5-C),
长至1.5~2.0 cm高时, 及时转移至生根培养基上, 3
d后植株基部陆续发根, 30 d左右就能长成根系发
达的再生植株(图5-D), 生根率可达80%, 这些根系
发达的再生植株经过炼苗后移栽至盆钵, 成活率
在95%以上。
讨　　论
本文从影响小孢子培养的几个关键步骤着手,
进行了提高小孢子活力、愈伤组织诱导和绿苗分
化的研究, 结果表明提取液中添加秋水仙碱有助
于提高青稞小孢子的活力, 诱导培养基中添加亚
精胺可以提高愈伤组织产量诱导和绿苗产量分化,
适合青稞小孢子培养的2,4-D浓度为1.5~2.0 mg·L-1,
诱导培养基中适宜的麦芽糖浓度为60~90 g·L-1。
秋水仙碱处理小孢子可以提高胚状体诱导产量和
绿苗分化产量, 已在油菜(Zhao等1996)、水稻(Ale-
manno和Guiderdoni 1994)、玉米(Saisingtong等
1996)、小麦(Barnabás等1991)和大麦(陆瑞菊等
2001)上证实, 青稞是裸大麦, 秋水仙碱在青稞小孢
子培养中同样具有增益效应。亚精胺预处理可以
减轻NaCl胁迫对青稞幼苗造成的伤害(段辉国等
2009), 本研究结果表明在青稞的小孢子培养中添
加亚精胺可以提高愈伤组织诱导产量和绿苗分化
产量, 或许亚精胺的添加有利于小孢子体内某些
氨基酸的增加。诱导培养基中添加2,4-D有利于
小孢子的脱分化启动, 麦芽糖不仅起碳源作用, 还
对培养基的渗透压有调节作用, 因而2,4-D和麦芽
糖浓度对小孢子培养的成功与否有着十分关键的
作用。
参考文献
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图5 青稞小孢子培养愈伤组织诱导及植株再生
Fig.5 Callus induction and plants regeneration of isolated microspore culture
A: 培养5 d时小孢子形成多细胞结构; B: 培养21 d的愈伤组织; C: 愈伤组织分化形成绿苗; D: 根系发达的再生植株。
图4 诱导培养基中麦芽糖浓度对愈伤组织诱导和绿苗产量分化的影响
Fig.4 Effect of maltose concentration in induction medium on the yields of callus and green plantlets
植物生理学报1768
陆瑞菊, 黄剑华, 孙月芳, 王亦菲, 周润梅(2001). 秋水仙碱对大麦
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