全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期，2010 年 1 月 1 7
收稿 2009-09-25 修定 　2009-12-29
资助 国家支撑计划 ( 2 0 0 7 B A D 5 9 B 0 2 ) 、转基因专项
( 2 0 0 8 Z X 0 8 0 0 9 - 0 0 1 、2 0 0 8 Z X 0 8 0 0 4 - 0 0 5 、
20 08ZX0 801 0-0 04 )、“8 63 ” 项目(2 00 6AA10Z10 7、
2 0 0 6 A A1 0 A1 1 1、2 0 0 7 A A1 0 Z 1 1 9 )和 “ 9 7 3 ” 项目
(20 04CB1 1720 6)。
致谢 陈其军先生提供 pG WC 载体。胡瑞波先生和范成明先
生给予技术支持和实验帮助。
* 通讯作者(E-mail: xinjian@371.net, fuyf@caas.net.cn;
Tel: 0371-63558722)。
大豆GmCOL8基因的克隆及表达分析
马锦花 1, 张清哲 1, 陈新建 1,*, 傅永福 2,*
1 河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002; 2 中国农业科学院作物科学研究所, 农作物基因资源与基因改良国家重大科学
工程, 北京 100081
提要: 从大豆品种 ‘垦农18’中克隆了一个CONSTANS-like基因, 命名为GmCOL8。进化树分析表明它属于CONSTANS-like
亚家族 1的成员。mRNA表达分析显示, GmCOL8在短日下具有明显的生物钟节律性表达特性, 其表达高峰出现在凌晨。
GmCOL8主要在复叶中表达, 表达高峰出现在开花时期。
关键词: 大豆; CONSTANS-like; 生物钟节律; 生物信息学
Cloning and Expression Analysis of GmCOL8 Gene in Soybean (Glycine max L.)
MA Jin-Hua1, ZHANG Qing-Zhe1, CHEN Xin-Jian1,*, FU Yong-Fu2,*
1College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2National Key Facility for Crop Gene
Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: A CONSTANS-like gene, named GmCOL8, was cloned from soybean (Glycine max) cultivar
‘Kennong 18’ in the study. The analysis of phylogenetic tree showed that GmCOL8 was a member of soybean
CONSTANS-like subfamily group 1. The mRNA expression pattern revealed that GmCOL8 had rhythmicity of
circadian clock under the condition of short day, and reached a peak at dawn. It expressed mainly in trifoliolates,
and the maximum level appeared at the stage of flowering.
Key words: Glycine max; CONSTANS-like; circadian clock; bioinformatics
CONSTANS (CO)是植物光周期开花途径中的
关键基因之一, 它位于光周期生物节律钟基因
(circadian clock genes, 如: GIGANTEA, GI)与下游
开花调节基因(如: Flowering Locus T, FT)之间, 控
制着光信号到成花信号的转换, 从而控制着植物由
营养生长向生殖生长的转变(Koornneef 等 1991;
Putterill 等 1995; Kardailsky 等 1999; Suarez-Lopez
等2001; Yanovsky和Kay 2002; Klejnot和Lin 2004;
Abe 等 2005; Jaeger 等 2006; Thomas 2006)。CO
基因编码一个具有锌指结构的转录因子, 其N端有
两个与蛋白之间相互作用有关的 B-box 锌指结构
(C-X2-C-X16-C-X2-C) (Borden 1998; Torok和Etkin
2001), C端有一个与CO蛋白核定位有关的富含45
个碱性氨基酸的 CCT (CO, CO-like, TOC1)域
(Strayer 等 2000; Robson等 2001; Griffiths等 2003),
CCT 域还可能与 HAP3 和 HAP5 形成复合体有关
(Wenkel 等 2006)。CO 同源基因广泛存在于植物
界中, 如水稻、大麦、小麦、牵牛、甜菜、衣
藻等(Liu等2001; Griffiths等2003; Nemoto等2003;
Chia 等 2008)中均检测到CO同源基因的存在。拟
南芥中有 16 个 CONSTANS-like 成员, 其中大部分
成员的具体作用还不清楚。
CO 具有生物钟节律表达特性, 且在长日和短
日条件下的表达变化存在差异(Samach 等 2000;
Suarez-Lopez 等 2001; Hayama 和 Coupland 2004)。
在长日条件下, 拟南芥CO mRNA的峰值出现在凌
晨和光照后 16 h, 而在短日条件下, 其峰值出现在
光照后 12~20 h之间(Suarez-Lopez 等 2001)。光照
条件下, 光受体 CRY2和 PHYA调节 CO蛋白的稳
定而不被降解; 而在暗中, CO 蛋白被 E3 泛素连接
酶 COP1 (constitutive photomorphogenic 1)泛素化
后在蛋白酶体(proteasome)中降解(Jang等2008; Liu
植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期，2010 年 1 月1 8
等 2008)。在长日条件下, 高水平积累的 CO 蛋白
激活了 FT 基因的表达, 从而促进拟南芥在长日条
件下开花; 短日条件下, CO mRNA只在暗中才能达
到高峰, CO蛋白无法积累, 故不能在短日条件下诱
导开花(Hayama 和 Coupland 2004)。水稻中 CO 基
因的功能与拟南芥中相反, 长日条件下, 水稻 CO
的同源基因Hd1 (heading date 1) mRNA的高水平
积累出现在午间到黄昏之间, Hdl蛋白在黄昏时能
稳定积累达到峰值, 高水平积累的 Hdl 蛋白抑制
OsFTL2 (Hd3a)的表达和开花; 而在短日条件下,
Hd1 mRNA峰值出现在暗中, Hd1蛋白被降解而不
能稳定积累, 因而 Hd3a 得以表达, 最终诱导开花
(Kojima等2002; Hayama和Coupland 2004; Tamaki
等2007)。从拟南芥和水稻的开花促进途径对比中
可知, 长日和短日植物的开花促进途径有很强的保
守性, 同时又存在各自的特殊性(Yano 等 2000;
Izawa等2002; Kojima等2002; Hayama和Coupland
2004)。
大豆是起源于我国的短日植物, 其光周期现象
明显, 因而种植范围受到限制。所以研究大豆光周
期形成的机制, 改变其光周期习性, 有一定的理论
和实践意义。目前大豆 CO 的研究尚属空白。本
文克隆到了一个大豆的 CONSRANS-like 基因——
GmCOL8 , 并用生物信息学方法确定其为大豆
GmCOL家族的一员, 用Real-time PCR的方法分析
其在不同光周期诱导、不同发育阶段及不同组织
器官表达变化, 显示GmCOL8具有明显生物钟节律
和组织器官特异表达模式。本文目的在于为进一
步解析CO基因在大豆开花的光周期诱导过程中的
作用机制积累基础性资料。
材料与方法
植物材料为大豆品种‘垦农18’ (Glycine max L.
‘Kennong 18’)。取大田土壤与有机肥以 2:1 的比
例混匀, 在花盆中种植, 温室培养, 温度为25~28 ℃,
光照分为短日(SD, 8 h光照 /16 h黑暗)条件与长日
(LD, 18 h 光照 /6 h 黑暗)条件, 光源由荧光灯提供
(TLD 18 W/54, Philips), 光照强度为 40~90 μmol·
m- 2 ·s - 1。
生物节律实验(LD/SD 条件)只取样品的单叶,
将种子分别种植于长日和短日条件下, 从单叶完全
展开时开始, 每隔 2 h 一次, 各取 24 个时间点(48
h), 随后将幼苗分别转移至连续光照(LL)和连续黑
暗(DD)条件下培养, 每隔 2 h 取一次样, 各取 24 个
时间点(共 48 h)。所有样品取后立即用液氮冷冻
后贮于 -80 ℃下备用。
组织特异性取样(SD 条件)以特征叶片完全展
开为标志, 按照大豆叶片的发育时期分别进行取
材。在单叶展开之前(播种后 8 d)取地上部分的幼
苗, 在单叶期(播种后 14 d)取根、下胚轴、上胚
轴、子叶、单叶和茎尖(包括顶端分生组织和幼
叶), 分别于单叶期、第 1 复叶期、第 2 复叶期、
第3复叶期、开花期(即第4复叶期)取地上部分, 在
开花期(播种后 45 d)取根、茎、单叶、第 1 复叶、
第 2 复叶、第 3 复叶、侧生叶和花, 分别于开花
后 7、14 和 21 d 取不同发育时期的荚和种子。样
品及其缩写见表 1。所有样品均在光照开始后 0.5
h取样, 取后立即用液氮处理后贮于-80 ℃下备用。
根据拟南芥CONSTANS基因的蛋白序列, 在大
豆基因组蛋白数据库(http://www.phytozome.net/
soybean)中进行候选基因的筛选。对于所得不完
整的基因在 Softberry 服务器上用 FGENESH 程序
重新预测(http://www.softberry.com/berry.phtml)。
根据预测基因GmCOL8的UTR及CDS序列, 设计
特异引物(表 2)。Trizol法提取 ‘垦农 18’大豆幼苗
cDNA 进行 PCR 扩增。其反应程序如下: 94 ℃预
变性5 min; 94 ℃ 30 s, 50~55 ℃ 30 s , 72 ℃ 1~2 min
循环 25~35 次; 最后 72 ℃延伸 8 min。
回收 PCR 产物, 与 Gateway T载体(pGWG-T)
连接、转化大肠杆菌DH5α, 挑取阳性克隆测序(在
北京三博生物技术公司进行测序)。
根据拟南芥CO家族成员(17个)及部分已报道
的其他物种CO家族与GmCOL8蛋白全长序列, 用
MEGA 4.0 (Tamura 等 2007)构建系统发育树。采
用Neighbor-joining (NJ)算法的Complete deletion模
式建树, Bootstrap 值取 1 000。
GmCOL8的表达特性分析采用Trizol法提取大
豆 ‘ 垦农 18’ 不同处理样品的总 RNA, 反转录合成
cDNA 后作为 qPCR (quantitative PCR)扩增模板。
利用 Beacon Designer 7.0 软件设计引物(表 2), 用
SYBR Green I 染料, 在 ABI StepOne 仪上进行。数
据处理采用 ABI 2 中的 2-ΔΔCT 方法计算基因相对表
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达量。qPCR 用两步法, 程序参数如下: 95 ℃ 10 s,
热启动; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 1 min, 40 个循环。在扩增
循环结束后做熔解曲线, 其程序为: 95 ℃, 15 s; 60 ℃,
1 min; 95 ℃, 15 s; 温度以每个循环 0.5 ℃递增。
实验结果
1 大豆GmCOL8的克隆
将拟南芥CONSTANS基因的蛋白序列, 在大豆
蛋白数据库(http://www.phytozome.net)中进行比对
分析, 预测到 12 个大豆 CONSTANS-like 家族基因,
暂命名为 GmCOL1~GmCOL12 (数据未列出)。其
中 GmCOL8 基因(大豆基因组网站预测序列号为
Glyma17g07420.1)位于第17条染色体上, 基因全长
表 1 不同发育时期和组织器官的样品
Table 1 Samples of different tissues/organs and developmental stages
样品 样品缩写 样品 样品缩写
播种后 1 周幼苗 幼苗 第 1 复叶期单叶 T1 -U
单叶期根 U-R 第 2 复叶期单叶 T2 -U
单叶期下胚轴 U-HH 第 3 复叶期单叶 T3 -U
单叶期上胚轴 U-EH 第 1 复叶期第 1 复叶 T1 -T 1
单叶期子叶 U-C 第 2 复叶期第 1 复叶 T2 -T 1
单叶期单叶 U-U 第 3 复叶期第 1 复叶 T3 -T 1
单叶期茎尖 U-SAM 第 2 复叶期第 2 复叶 T2 -T 2
开花期根 F-R 第 3 复叶期第 2 复叶 T3 -T 2
开花期茎 F-St 第 3 复叶期第 3 复叶 T3 -T 3
开花期侧生叶 F-L 开花后 7 d 的种子 7 DAF
开花期单叶 F-U 开花后 14 d 的种子 14 DAF
开花期第 1 复叶 F-T1 开花后 21 d 的种子 21 DAF
开花期第 2 复叶 F-T2 成熟期种子 M
开花期第 3 复叶 F-T3 单叶期地上部 U-A
开花期第 4 复叶 F-T4 第 1 复叶期地上部 T1 -A
花蕾 F 第 2 复叶期地上部 T2 -A
开花后 7 d 的荚 Pd1 第 3 复叶期地上部 T3 -A
开花后 14 d 的荚 Pd2 开花期地上部 F-A
开花后 21 d 的荚 Pd3
　 　
表 2 引物序列及其用途
Table 2 Primer sequences and their roles
基因名称 上游引物(5 → 3) 下游引物(5 → 3) 用途
GmCOL8-UTR GGAGCAAAAGTAGAGGCAGT TAAACAGAAAGGCAACC 克隆 GmCOL8
GmCOL8-CDS ATGGGAATTGAAAGAGG CTAAAACGATGGTACGAC 克隆 GmCOL8
CYP2 GCCTCTGGATCCTGCTCAAG ACCTCCTCCTCAAACTCCTCTC 荧光定量 RT-PCR
ACT11 ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC GCTGGTCCTGGCTGTCTCC 荧光定量 RT-PCR
GmCOL8 ACAGCGTCGTTCCAGTTC CACCACTCCAACATCAAGC 荧光定量 RT-PCR
1 911 bp, CDS 长 1 125 bp, 包含 1 个内含子(847~
936 bp), 2 个外显子(103~846 bp和 937~1 317 bp),
编码一个由 375 个氨基酸组成的蛋白。根据大豆
基因组网上序列, 先对位于 33 bp 处的 3 UTR 和
1 500 bp 处的 5 UTR 区域设计特异引物(表 2), 以
大豆 ‘垦农 18’幼苗 cDNA为模板, 通过 PCR扩增,
获得含有部分UTR的cDNA片段, 测序结果表明该
cDNA片段与大豆基因组中的GmCOL8一致, 说明
大豆 ‘ 垦农 18 ’ 的 Gm COL 8 的与 Wil l iams 的
Glyma17g07420.1 属同一基因。再以此片段为模
板, 通过PCR扩增获得完整编码区序列。GmCOL8
基因的蛋白序列具有CO家族的典型保守结构: 含有
2 个完整的B-box, 均在第一个外显上, CCT domain
植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期，2010 年 1 月2 0
在第二个外显子处, 且在碳末端含有 6个保守氨基
酸的 T-motif。该序列已提交 GenBank, 登录号为
GQ864262。
2 大豆GmCOL8的亲缘关系分析
将大豆 GmCOL8 与部分已报道的具有完整
CDS序列的CO同源基因进行蛋白比对分析并构建
系统发育树。由比对结果可知, GmCOL8 与 AtCO
的相似性为38.8%, 与OsA (Hd1)的相似性为35.5%,
与 PpCO L1 的相似性为 4 9 . 7%。GmCOL8 与
AtCOL5 相似性最高为 59.2%。CO 基因家族按照
其保守结构的不同可以分成 3个亚家族(group), 目
前被广泛研究的主要是 Group 1 中的 CO 基因, 本
文中的GmCOL8也隶属于该组中。大豆的GmCOL8
与拟南芥CO基因家族的Group1成员聚在同一支,
且与 AtCOL5 亲缘关系最近, 与小立碗藓(Physco-
mitrella patens)处在同一个进化枝上。
图 1 GmCOL8 系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of GmCOL8
拟南芥(Arabidopsis thaliana): AtCO (At5G15840), AtCOL1 (At5G15850), AtCOL2 (At3G02380), AtCOL3 (At2G24790),
AtCOL4 (At5G24930), AtCOL5 (At5G57660), AtCOL6 (At1G68520), AtCOL7 (At1G73870), AtCOL8 (At1G49130), AtCOL9
(At3G07650), AtCOL10 (At5G48250), AtCOL11 (At4G15250), AtCOL12 (At3G21880), AtCOL13 (At2G47890), AtCOL14
(At2G33500), AtCOL15 (At1G28050), AtCOL16 (At1G25440); 水稻(Oryza sativa): OsA (AB041840.1), OsB (AB001887.1); 大麦
(Hordeum vulgare): HvCO1 (AF490467.1), HvCO2 (AF490469.1); 小麦(Triticum aestivum): TaHd1-1 (BAC92735.1); 番茄(Lycopersicon
esculentum): LeCO (AY490253.1); 小立碗藓(Physcomitrella patens): PpCOL1 (AB185925.1); 牵牛(Ipomoea nil): InCO (AF300700.1);
甜菜(Beta vulgaris): BvCOL1 (EU437782.1); 衣藻(Chlamydomonas reinhardtii): CrCO (AM940003.1); 萝卜(Raphanus sativus):
RsCOL1 (AAC35496.1)。
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3 GmCOL8特异性表达分析
大豆 GmCOL8 mRNA 主要在叶中表达, 整体
趋势是开花期表达量高于单叶期(图 2)。在不同组
织器官中, GmCOL8 在根、茎、叶中均有表达, 花
和荚中表达量较低, 在开花期复叶中表达量较高, 尤
其在开花期第 2 复叶中表达量达到峰值(图 2-a)。
不同发育时期的叶片中, GmCOL8在单叶中的表达
量随着大豆的生长呈下降趋势, 在单叶期的单叶表
达量最高, 在开花期的第2复叶中表达量最高(图2-
c)。GmCOL8 在不同发育时期的种子和地上部分
的表达中, 在成熟种子中的表达量明显高于未成熟
种子(图 2-b), 地上部表达量在复叶期较高, 第 3 复
图 2 GmCOL8 特异性表达分析
Fig.2 Specific expression profiles of soybean GmCOL8
a: 不同组织器官的相对表达量; b: 不同组织发育时期种子的相对表达量; c: 不同发育时期叶片的相对表达量; d: 不同发育时期地
上部的相对表达量。样品缩写见表 1 。
叶期达到峰值(图 2-d)。
4 GmCOL8生物节律钟表达分析
GmCOL8 mRNA表达水平在长短日条件下有明
显差异, 短日下的表达丰度比长日下低。GmCOL8
具有明显的生物钟节律。长日条件下, GmCOL8
mRNA表达量随着光照快速上升, 在6 h (光周期第
6小时), 出现表达高峰, 随后下降直到黑暗开始时。
在黑暗条件下, 表达量有小的上升趋势(光周期第18
小时), 随后又下降到下一个光周期开始(光周期第
24 小时) (图 3-a、b)。短日条件下, mRNA 表达
高峰出现在凌晨(光周期第 0 小时), 随后 2 h 内出
现降低, 然后又快速回升出现第二个峰(光周期第
4~6 小时)。在黑暗开始后第 8 h (即光周期第 18
小时)开始上升, 直到这个光周期结束时到达高峰
(光周期第 24 小时) (图 3-c、d)。将长日 / 短日条
件下的幼苗分别移至连续光照或连续黑暗下 ,
GmCOL8的mRNA在连续光照条件下均表现出与
长日 / 短日条件下相似的节律性, 而连续黑暗条件
下的表达节律要弱得多(图 3)。由此可以看出, 该
基因主要受生物钟的调节, 同时也受光照调节。
讨　　论
根据保守结构的差异, 拟南芥的CO家族可以
分为3个亚家族(Group): Group 1包括CO和COL1~
COL5, 有 2个保守的B-box锌指结构, 1个CCT域,
并在C末端含特有的6个保守氨基酸的T-motif (G-
I/V–V-P–S/T-F); Group 2 包括 COL6、COL8 和
COL16, 只含有 1 个保守的 B-box 锌指结构, 1 个
CCT 域; Group 3 包括 COL9~COL15, 有 1 个保守
的 B-box 和 1 个变异的锌指结构, 1 个 CCT 域
(Robson等 2001)。大豆GmCOL8有 2个保守的B-
box 锌指结构, 2 个 CCT 域, 且 GmCOL8 在 C 末端
含有 Group 1 特有的 T-motif, 因此, GmCOL8 属于
CO 家族的 Group 1。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期，2010 年 1 月2 2
已知拟南芥的 AtCO 主要在茎和叶中表达,
AtCOL1、AtCOL2、AtCOL5 在叶中表达量比茎
中多, 且 AtCOL5 具有部分互补 CO 基因的功能
(Hassidim等2009)。萝卜的CO同源基因mRNA分
析显示抽薹期花芽中的表达量最高, 当花芽成熟后降
低, 在叶与根中均有表达(Moon等 1998)。GmCOL8
表达与 AtCOL5非常相似, GmCOL8也是在叶中的
表达量高, 花、荚以及种子中几乎均不表达, 尤其
在开花期复叶中表达量达到高峰(图2), 此时正是大
豆由营养生长向生殖生长转变的关键时期, 表明
GmCOL8 可能在大豆由营养生长向生殖生长转变
过程中起作用。
拟南芥和水稻CO mRNA具有明显的节律变化
(Hayama 和 Coupland 2004)。GmCOL8 mRNA 的
表达特征与水稻类似。在长日和短日条件下 ,
GmCOL8 mRNA 的表达丰度有差异, GmCOL8
mRNA 的表达丰度在长日条件下高, 短日条件下
低。长日条件下, GmCOL8 mRNA 表达量随着光
照快速上升, 在 6 h 出现表达高峰, 随后下降, 直到
黑暗开始。这些与水稻 CO 同源基因类似。但是,
在短日条件下, 大豆GmCOL8表达峰值出现在凌晨
及光周期第 4~6 小时, 这与水稻 CO 同源基因的表
达模式不同, 与拟南芥 AtCOL5 短日下的表达也不
同, 却与拟南芥AtCO长日下的表达类似, 只是表达
峰值出现的时间点不同(图 3-c、d)。这说明大豆
CO 基因的表达模式有别于拟南芥和水稻。
总之, GmCOL8具有CONSTANS家族的典型特
征, 其在大豆开花中具体作用尚待进一步研究。
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图 3 GmCOL8 mRNA在长 / 短日(LD/SD)条件下昼夜节律表达
Fig.3 Expression levels of soybean GmCOL8 mRNA under LD/SD
a: 长日转连续光照(LD-LL); b: 长日转连续黑暗(LD-DD); c: 短日转连续光照(SD-LL); d: 短日转连续黑暗(SD-DD)。
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