全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月1114
收稿 2010-05-05 修定 　2010-09-26
资助 国家林业局 “948”项目(2006-4-72)、国家 “十一五 ”科
技支撑计划课题(2006BAD24B04)和国家 “863”计划项
目(2 00 9AA1 0Z10 7)。
* 通讯作者(E-mail: zhangzy@bjfu.edu.cn; Tel: 010-62338502)。
毛白杨悬浮细胞系的建立及再生植株的获得
姚娜 1,2, 安新民 1, 杨凯 3, 张志毅 1,*
1北京林业大学林木育种国家工程实验室, 林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 国家林业局树木花卉育种与生物工程重
点开放实验室, 北京 100083; 2中国林业科学研究院林业研究所国家林业局林木培育重点实验室, 北京 100091; 3北京农学院
农业应用新技术北京市重点实验室, 北京 102206
提要: 以毛白杨基因型TC152无菌苗为材料, 研究毛白杨悬浮细胞系建立与植株再生, 结果表明, 通过悬浮培养和固体培养
两种方法诱导毛白杨悬浮细胞分化不定芽, 最终获得无菌生根苗。愈伤组织在MS+1.5 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖的液体培
养基中振荡培养, 12 d可建立悬浮细胞系; 悬浮细胞系继代培养基为MS+0.8 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖, 继代周期为7 d, 悬
浮细胞在MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5~1.0 mg·L-1 ZT+30 g·L-1蔗糖培养基中悬浮培养, 可分化大量不定芽, 每个
培养瓶中可得到40~50个芽, 个别不定芽玻璃化; 不定芽在1/2MS+0.6 mg·L-1 IBA+20 g·L-1蔗糖+5.5 g·L-1琼脂培养基上可分
化不定根。悬浮细胞通过固体平板培养增殖为愈伤组织块后, 在MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 ZT+30 g·L-1
蔗糖+5 g·L-1琼脂的固体培养基上, 不定芽分化率可达到70.00%。
关键词: 毛白杨; 悬浮细胞; 再生; 组织培养
Establishment of Suspension Cell Line of Populus tomentosa Carr. and Plant
Regeneration from Cells
YAO Na1,2, AN Xin-Min1, YANG Kai3, ZHANG Zhi-Yi1,*
1National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory for Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental
Plants, Ministry of Education, The Tree and Ornamental Plant Breeding and Biotechnology Laboratory of State Forestry
Administration, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State
Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 3Key Laboratory of
Agricultural New Technology and Application in Beijing, Beijing Agricultural College, Beijing 102206, China
Abstract: The establishment of suspension cell line and plant regeneration from cells were studied by using the
in vitro explants of Populus tomentosa genotype TC152. Two methods for regeneration, suspension culture and
solid culture were used to obtain regenerated plants. The suspension cell line could be established by inoculating
calli in the medium of MS+1.5 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1 sucrose after 12-d shaking culture. The subculture me-
dium was MS+0.8 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1 sucrose. And the subculture cycle was 7 d. Large numbers of adven-
titious buds could be acquired when the cells were cultured in the liquid medium of MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1
mg·L-1 NAA+0.5–1.0 mg·L-1 ZT+30 g·L-1 sucrose. There were 40–50 buds in every bottle. Some of the buds
were vitrified. The adventitious buds could root on the medium of 1/2MS+0.60 mg·L-1 IBA+20 g·L-1 sucrose+
5.5 g·L-1 agar. The calli which were acquired after suspension cells being cultured in solid medium would
regenerate adventitious buds on the medium of MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 ZT+30 g·L-1
sucrose+5 g·L-1 agar. The regeneration rate was 70.00%.
Key words: Populus tomentosa; suspension cell; regeneration; tissue culture
毛白杨属杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus), 是
我国北方重要的乡土树种, 具有木材洁白、纤维
长、生长速度快、抗病虫能力强等优良性状和重
要的生态价值(朱之悌 2006)。前人研究认为毛白
杨可能为多杂交组合形成的复合体, 但目前为止还
没有准确结论。近年来, 随着植物生物技术的发
展, 毛白杨遗传转化研究逐渐深入(郝贵霞等 1999;
邓伟等 2009), 这为毛白杨的定向改良开辟了新的
途径。建立高效、稳定的毛白杨离体再生体系,
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月 1115
有助于其遗传转化的顺利进行。此外, 作为林木研
究的模式植物, 对杨树遗传改良的研究也可为其他
木本植物提供经验(Taylor 2002; 张勇等 2006)。
目前, 杨树遗传转化主要以叶片(Confalonieri
等 1998; Dai等 2003)、茎段(Nishiguchi等 2006)和
愈伤组织(Deng等 2009)为受体。通过器官途径再
生植株, 具有再生效率高、不易产生变异等优点;
但存在培养周期长、材料继代工作量大等问题。
植物悬浮细胞具备分散性好、细胞形状及细胞团
大小大致相同、生长迅速、重复性好、培养条
件易于控制等有利因素, 常被用作遗传转化受体
(Ogawa等 2008)。近年来, 已通过侵染悬浮细胞获
得了拟南芥(Arabidopsis thaliana) (Menges和
Murray 2004)、水稻(Oryza sativa) (Cao等 1992)、
谷子(Setaria italica) (董云洲和段胜军 1999)、甘
薯(Ipomoea batatas) (Yu等 2007)、香蕉(Musa
nana) (Khanna等 2004)和白檀(Santalum album)
(Shekhawat等 2008)等植物转基因阳性株系。一直
以来, 悬浮细胞再生植株在木本植物中是一个难
点。虽然目前杨树组织培养和器官再生研究较为
透彻, 但其悬浮细胞再生植株的报道仍相对较少, 仅
见于杨属中的银白杨(P. alba) (Park和 Son 1988)、
缘毛杨(P. ciliata) (Cheema 1989)、胡杨(P. euph-
ratica)和俄罗斯杨(P. russkii) (谢华永 2004)等。有
关毛白杨悬浮细胞再生植株的研究目前未见系统报
道。本文以具有器官高效再生性状的毛白杨基因
型TC152无菌苗为材料建立悬浮细胞系, 探讨了悬
浮细胞再生不定芽情况, 为拓展毛白杨遗传转化受
体类型和转化方法提供技术保障, 也为今后毛白杨
原生质体来源细胞的遗传转化铺平道路, 以期最终
解决毛白杨遗传转化中易出现嵌合体的问题。
材料与方法
1 材料
毛白杨(Populus tomentosa Carr.)基因型TC152
组织培养苗外植体于2005年采自山东省国营冠县
苗圃全国毛白杨基因库。该基因型具备较高的器
官再生效率。
2 方法
2.1 愈伤组织诱导 取毛白杨无菌苗新展叶片, 切成
0.5 cm×0.5 cm, 接种在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+5 g·L-1
琼脂 +30 g·L-1蔗糖的固体培养基上诱导愈伤组织,
培养25 d后, 挑选无褐化现象的愈伤组织作为悬浮
细胞系建立起始材料。
2.2 细胞悬浮培养 取生长旺盛的愈伤组织, 夹碎后
接种在装有80 mL液体培养基的150 mL三角瓶中,
110 r·min-1振荡培养, 初始培养基为MS+1.5 mg·L-1
2,4-D+30 g·L-1蔗糖。细胞悬浮培养初期, 12 d继
代一次。继代前将悬浮培养物静置 2 h, 倒掉上层
培养液, 用新鲜培养基将下层细胞重悬, 分装至无
菌三角瓶中, 再添加液体培养基至 80 mL。待悬
浮细胞系可稳定增殖后, 继代前将悬浮培养物过60
目细胞筛, 得到的细胞悬浮液用漏斗抽滤后称取一
定鲜重的细胞接种。
2.3 细胞生长量测定 细胞密实体积(packed cell
volume, PCV): 细胞悬浮培养物过 60目筛, 将得到
的细胞悬浮液充分悬起, 倒入10 mL刻度离心管中,
20×g离心 10 min, 读取细胞所占体积。细胞鲜重
(fresh weight, FW): 细胞悬浮培养物过60目筛后用
漏斗抽滤细胞悬浮液, 所得细胞在 1/100精度的光
电天平上称取质量。
2.4 悬浮细胞分化不定芽 悬浮培养时, 将毛白杨悬
浮细胞接种在附加不同浓度植物生长调节剂的液体
培养基(表 1)中, 光照培养, 每 20 d继代一次, 观察
悬浮细胞生长和分化情况。固体平板培养时, 用滤
纸将悬浮细胞分离出, 接种在约 40 ℃、融化状态
下的固体培养基(表 2)中, 震荡使细胞充分悬浮后,
倒入直径为 9 cm的培养皿中, 光下培养 30 d, 选有
分化趋势的愈伤组织接种在分化培养基(表3)上, 诱
导不定芽, 观察不定芽分化情况。
2.5 不定芽生根培养 选择无玻璃化或玻璃化较弱
的不定芽, 剪至约1 cm长, 接种在生根培养基1/2 MS+
0.6 mg·L-1 IBA上, 诱导不定芽生根。
2.6 培养基和培养条件 固体培养基: 以MS为基本
培养基, 碳源为 30 g·L-1食用蔗糖, 5 g·L-1琼脂固
化。生根培养采用MS培养基无机盐含量减半(表
示为 1/2MS), 20 g·L-1食用蔗糖, 5.5 g·L-1琼脂固
化。液体培养基附加 30 g·L-1蔗糖。培养基灭菌
前 pH值调至 6.3, 分装后于 121 ℃、1.5×105 Pa灭
菌 20 min。固体培养时, 光照时间为 9 h·d-1。悬
浮细胞于散射光下培养, 光照时间为 12 h·d-1; 悬浮
细胞再生于强光下培养, 光照时间 12 h·d-1。各阶
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段培养温度均为昼(25±1) ℃, 夜(16±1) ℃。摇床
转速 110 r·min-1。
2.7 统计方法及数据处理 悬浮培养和细胞平板培
养, 每处理重复 4次, 每重复每皿接种 5瓶; 愈伤组
织再生不定芽试验, 每处理重复 3次, 每重复接种
15块外植体。试验所得百分数结果经反正弦转换
(θ=arcsin x )后, 用 SPSS 13.0软件进行方差分析,
采用 LSD法进行多重比较。
实验结果
1 毛白杨悬浮细胞系的建立
将质地疏松、无褐化的愈伤组织夹碎, 接种
在MS+1.5 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖液体培养基
中振荡培养12 d后, 液体培养基中出现大量浅黄色
悬浮细胞, 细胞无褐化现象。
从稳定的悬浮细胞系中称取2.0 g (FW)悬浮细
胞, 接种在附加0.8 mg·L-1 2,4-D的继代培养基中培
养 10 d。用密实体积法测量细胞生长量, 绘制悬
浮细胞生长曲线(图 1)。结果表明, 毛白杨悬浮细
胞增殖情况良好(图2-B), 细胞生长量随着培养时间
的变化呈现 “S”形曲线, 可划分为迟滞期(1~4 d)、
对数生长期(4~7 d)、减慢期(7~10 d)。悬浮细胞
最佳继代时间为 7 d。
2 悬浮培养法诱导细胞分化不定芽
毛白杨悬浮细胞接种在分化培养基中, 振荡培
养, 继代 3~5次后, 淡黄色的细胞聚集成黄绿色或
绿色细胞团(图 2-C), 部分细胞团分化出不定芽。
由表1可见: 培养基1-2和1-3均可使毛白杨悬浮细
胞分化不定芽(图2-D), 分化效率较高, 平均每个三
角瓶中有40~50个不定芽; 不定芽在培养基中生长
迅速, 但伴有玻璃化现象。培养基 1-1中细胞团先
分化不定根, 再分化不定芽; 培养基 1-4中细胞团
很难分化不定芽。因此, 可以选择MS+1.0 mg·L-1
6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5~1.0 mg·L-1 ZT通过细胞
悬浮培养获得大量的不定芽。
挑选毛白杨悬浮细胞系中玻璃化现象不严重
的不定芽, 接种在生根培养基1/2MS+0.6 mg·L-1 IBA
上, 观察悬浮细胞再生不定芽生根情况(图 2-E和
F)。由于玻璃化现象存在, 毛白杨不定芽芽体纤
细, 生根困难, 并容易出现生长失去向地性的毛状
根; 继代 2次以后, 不定芽生长趋于正常。因此,
由于玻璃化现象存在, 不定芽生根需要几代的驯化
培养, 才能保证不定芽和根系的正常生长。
3 固体平板培养
长期的高浓度2,4-D培养基环境可能会导致植
物细胞再分化困难。本研究发现, 将毛白杨悬浮细
胞植板于不含2,4-D的平板培养基中, 光下培养, 可
促进细胞分化, 但很难分化出不定芽; 将有分化趋
势的细胞团转接至分化培养基上, 较植板培养更容
易分化不定芽。由表 2可知, 毛白杨悬浮细胞在 2-
图 1 毛白杨悬浮细胞生长曲线
Fig.1 The growth curve of P. tomentosa suspension cells
表 1 毛白杨细胞通过悬浮培养法在不同培养基中分化不定芽情况
Table 1 Differentiation of P. tomentosa cells by suspension culture in different media
培养基编号 培养基成分 不定芽诱导情况
1-1 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 细胞团生根, 诱导出不定芽
1-2 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 ZT 出现大量不定芽
1-3 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 ZT 出现大量不定芽
1-4 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT 细胞团没有明显变化
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表 2 毛白杨细胞在不同固体培养基上生长情况
Table 2 Growth status of P. tomentosa cells inoculated on different solid media
培养基编号 培养基成分 重复 1 重复 2 重复 3 重复 4
2-1 MS 绿色, 部分褐化 绿色 绿色, 褐化 绿色, 黄化
2-2 MS+1.0 mg·L-1 2,4-D 黄色 黄色, 褐化 黄色, 褐化 黄色
2-3 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 黄色, 褐化 绿色 黄色和少量绿色 黄色和少量绿色
2-4 MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 少量绿色 绿色 黄色和绿色 绿色
2-5 MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT 绿色 绿色 少量绿色 少量绿色
2-6 MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT 黄色 绿色 绿色 绿色
4和2-5两种培养基中植板培养效果最好, 悬浮细胞
可由淡黄色转变为黄绿色, 无褐化现象发生, 细胞
团进入分化状态(图2-G); 悬浮细胞在培养基2-2中,
生长速度快, 细胞团颜色保持淡黄色; 在不含植物
生长调节剂的MS培养基上褐化现象严重, 细胞生
长速率慢, 仅有少量细胞开始分化。
将植板培养的黄绿色细胞团接种在不定芽诱
导培养基上, 培养20 d后细胞团生长成坚硬致密的
深绿色愈伤组织(图 2-H), 培养 30 d后有不定芽从
愈伤组织分化出(图 2-I), 不定芽多为单芽, 形态正
常, 无畸形或玻璃化现象。培养 50 d后, 统计不
定芽诱导情况(表3), 培养基3-3诱导不定芽效率高
图 2 毛白杨悬浮细胞系的建立及植株再生
Fig.2 Establishment of suspension cell line of P. tomentosa and plant regeneration
A: 愈伤组织; B: 悬浮细胞; C和D: 悬浮细胞分化不定芽; E和 F: 不定芽生根; G: 悬浮细胞平板培养; H: 悬浮细胞固体培养形成的
愈伤组织诱导分化; I : 不定芽分化。
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于其他处理, 达到 70.00%; 3-1和 3-4诱导效率最
低, 为 0。经方差分析可知, ZT对毛白杨愈伤组织
再生不定芽影响达到极显著水平, 毛白杨愈伤组织
在含有 1.0 mg·L-1 ZT培养基中再生效率极显著高
于其他处理。因此, 可选择MS+1.0 mg·L-1 6-BA+
0.1 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 ZT作为毛白杨愈伤组
织不定芽分化培养基。
讨　　论
毛白杨为近年来我国北方大力推广的速生丰
产和工业用材树种之一。对其现有品种进行改良,
提高抗病虫害和抗非生物胁迫能力尤为重要。由
于毛白杨育种周期长、异花授粉和杂交不亲和等
原因, 常规育种改良耗时较长。通过基因工程手段
对毛白杨进行遗传改良具有诸多优势。而建立取
材便捷、再生高效的转化受体系统是成功进行毛
白杨转基因研究的重要基础。
近年来, 随着生物技术的发展, 植物悬浮细胞
培养体系已被用于生理学、生物化学、细胞学、
发育生物学、遗传学及分子生物学研究。尤其是
以水稻、小麦为代表的禾本科植物, 细胞悬浮系以
其繁殖速度快、颗粒均一、操作方便等优点而被
认为是其转基因的理想受体之一, 也是体细胞无性
系变异和突变体筛选的优良材料。杨树作为木本
植物研究的一个热点材料, 在悬浮细胞系遗传转化
与突变体筛选等领域相对薄弱, 其主要原因在于木
本植物悬浮细胞系建立与再生存在一定难度。本
文以毛白杨愈伤组织为材料, 建立了稳定的悬浮细
胞系, 并通过振荡培养和固体培养两种方法诱导悬
浮细胞再生不定芽。这为今后毛白杨悬浮细胞系
遗传转化与体细胞突变体筛选建立了技术平台。
植物生长调节剂一直被视为组织培养中的关
键调控因子之一。有研究表明, 2,4-D对植物器官
的脱分化、愈伤组织的增殖与体细胞胚诱导具有
促进作用; 而在一定程度上抑制了愈伤组织分化不
定芽。毛白杨悬浮细胞系的启动需要较高水平的
2,4-D (1.5 mg·L-1), 但悬浮细胞的继代培养在低水
平 2,4-D (0.8 mg·L-1)下就可完成。因此, 毛白杨
悬浮细胞继代培养时可适当降低 2,4-D浓度, 以减
少 2,4-D对细胞的损伤, 避免细胞长期在高浓度
2,4-D中发生变异。在诱导悬浮细胞分化过程中需
采取逐渐降低直至去除2,4-D的策略来促进细胞分
化, 适当提高细胞分裂素的浓度, 将分散的细胞团
改造成紧凑致密的愈伤组织, 进而促使植株再生(王
海波等 1996)。在缘毛杨悬浮细胞分化过程中, 也
报道了首先需要经过几代预培养, 降低细胞中 2,4-
D含量; 草莓(Fragaria ananassa)悬浮细胞需要通
过调整植物生长调节剂, 使细胞聚集成颗粒状细胞
团后再诱导不定芽的分化(张洁等 2005)。
一般而言, 细胞分裂素促进了愈伤组织分化不
定芽, 杂种杨树(P. alba×P. grandidentata cv.
‘Crandon’)悬浮细胞增殖为愈伤组织后, 在附加
TDZ的WPM培养基中可以分化不定芽(Howe等
1994); 银白杨原生质体来源的愈伤组织在附加KT
或TDZ的MS培养基上分化不定芽(Qiao等 1998);
欧洲山杨(P. tremula)愈伤组织在附加ZR和IAA的
MS 培养基中不定芽分化效率最高(Peternel 等
2009); 美洲黑杨(P. deltoides)在附加0.25 mg·L-1 KT
的培养基中再生效率最高(Yadav等2009)。在本研
究中, 通过调整分化培养基中植物生长调节剂种类,
添加细胞分裂素, 降低细胞培养环境中的2,4-D, 可
以促进悬浮细胞形成绿色细胞团, 继续培养细胞团
几代后可诱导出不定芽。悬浮细胞来源的愈伤组
织在附加 6-BA、ZT和NAA培养基上不定芽分化
表 3 毛白杨愈伤组织在不同固体培养基上的再生情况
Table 3 Regeneration of P. tomentosa calli on different solid media
培养基编号 培养基成分 不定芽诱导率 /%
3-1 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 0C
3-2 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 ZT 36.67±6.67B
3-3 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 ZT 70.00±5.77A
3-4 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT 0C
　　A、B、C 代表 0 .0 1 水平差异显著。不定芽诱导率 = (分化不定芽愈伤组织数 / 接种愈伤组织数) × 1 0 0 %。
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效率最高; ZT在毛白杨愈伤组织分化不定芽中起着
较为关键的作用。在今后的研究中, 还需通过优化
植物生长调节剂的种类和浓度, 进一步提高毛白杨
愈伤组织分化效率。
悬浮培养法诱导不定芽分化, 操作简单, 仅需
在液体培养状态下不连续继代; 诱导时间较短, 分
化效率较高。然而长期的液体培养会导致个别不
定芽玻璃化, 对此, 在今后的研究中可通过调节培
养基渗透势、植物生长调节剂或摇床转速等影响
因素进行缓解, 也可在生根过程中通过控制培养环
境和增加继代次数, 最终转化为正常植株。固体平
板法可有效地避免不定芽玻璃化, 但是诱导周期较
长。此外, 由于平板培养空间有限, 单位面积内细
胞数量多, 培养基消耗快, 诱导过程中需根据细胞
分化状态及时挑选有分化趋势的愈伤组织转接至三
角瓶中继续诱导分化, 操作步骤较液体培养法繁
琐。毛白杨离体再生研究是为遗传转化做准备, 两
种再生培养方法均以悬浮细胞为受体, 具有增殖速
度快、颗粒均一等优势。在不同的转化操作中又
拥有其自身的优势: 悬浮培养法再生不定芽, 细胞
团与培养基充分接触, 可提高遗传转化后的抑菌和
抗生素筛选效率; 固体培养法将大量的悬浮细胞通
过植板法固定在平皿中, 便于基因枪法转化悬浮细
胞(陈军营等 2007)。
在植物组织培养中, 染色体数目异常是一个普
遍现象。在对荔枝(Litchi chinensis) (黄素华和赖
钟雄 2003)、银鹊树(Tapiscia sinensis) (陈发菊等
2007)和新疆紫草(Arnebia euchroma) (计巧灵和王
卫国2001)的组织、再生植株中均检测出不同程度
的染色体变异。本文中毛白杨悬浮细胞再生体系
是为遗传转化所用, 培养过程中的变异情况将影响
到转基因株系的遗传基础。因此, 在今后的研究
中, 还需要对毛白杨悬浮细胞系及其再生植株进行
染色体观察, 了解其在组织培养中的变异情况。
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