全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1000~10081000
收稿 2013-05-17 修定 2013-07-30
资助 国家自然科学基金(31270713)和海南省自然科学基金
(312028)。
* 通讯作者(E-mail: hnzrz@aliyun.com; Tel: 0898-23300776)。
产胶植物橡胶转移酶的研究进展
代龙军, 曾日中*
中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地, 海
南儋州571737
摘要: 天然橡胶合成中, 橡胶转移酶催化异戊二烯焦磷酸的多聚化过程, 这一过程对天然橡胶的品质及产量至关重要。橡
胶转移酶及其性质、橡胶生物合成分子机理及橡胶的分子量大小决定机制是亟待解决的重要科学问题。本文介绍了以巴
西橡胶树为主的产胶植物橡胶转移酶的性质和生物学功能, 对橡胶转移酶的分离与鉴定及其活性调节等研究进展进行了
综述。
关键词: 天然橡胶; 橡胶转移酶; 产胶植物; 巴西橡胶树
Research Advances in Rubber Transferases of the Rubber-Producing Plants
DAI Long-Jun, ZENG Ri-Zhong*
Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources
of Rubber Tree, Ministry of Agriculture/State Key Laboratory Incubation Base, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract: Rubber transferase, a cis-prenyltransferase catalyzing the incorporation of isopentenyl pyrophosphate
into rubber molecules, is critical to the quality and the yield of natural rubber. However, the identity of the
rubber transferase, and the mechanisms related to polymerization and the determination of the molecular mass
of natural rubber remain equivocal. This article provides an overview of the rubber transferases of Hevea
brasiliensis and other rubber-producing plants from aspects of the biological function, the purification, the
characterization, and the regulation of the catalytic activity.
Key words: natural rubber; rubber transferase; rubber-producing plants; Hevea brasiliensis
世界上存在约2 500种产胶植物, 只有少数物
种产生的天然橡胶(顺式-1,4-聚异戊二烯, cis-1,4-
polyisoprene)的物理性能符合工业生产需要(Mooi-
broek和Cornish 2000), 如: 巴西橡胶树(Hevea bras-
iliensis, 以下简称橡胶树)、银胶菊(Parthenium
argentatum)和橡胶草(Taraxacum kok-saghyz和T.
brevicorniculatum)。天然橡胶品质取决于分子量,
分子量越高, 品质越好, 上述3种植物所产天然橡
胶平均分子量超过1×106 Da, 即聚合度大于14 700
个异戊二烯单体(Schmidt等2010a; Swanson等
1979)。生长于热带的橡胶树因其天然橡胶物理性
能好、胶乳产量高、胶乳收获便捷, 已成为商业
用途天然橡胶的唯一来源(Cornish 2001a; Gron-
over等2011)。银胶菊、橡胶草等二战期间开始利
用的温带替代产胶植物也受到研究者的重视。而
印度榕(Ficus elastica)所产天然橡胶分子量小于
1×105 Da (Cornish等2000), 品质不高, 因此被当作
对照研究物种。产胶植物无花果(Ficus carica)、
孟加拉榕树(Ficus benghalensis)及莴苣(Lactuca
serriola和L. sativa), 产天然橡胶的分子量分别约为
1.19×105、1.5×106和平均大于1×106 Da, 也有少量
报道(Kang等2000a, b; Bushman等2006)。另外, 杜
仲(Eucommia ulmoides)所产杜仲胶(反式-1,4-聚异
戊二烯)的反式长链是有序的, 易于有序聚集而结
晶, 不像顺式-1,4-聚异戊二烯的长链分子可形成无
规线团结构, 形成高次结构时能形成无定形弹性
胶团, 因此需要使杜仲胶硫化或异构化, 将其变为
弹性体以提高工业应用价值(严瑞芳1995)。
天然橡胶是一种重要的工业原料和战略物资,
虽然对以巴西橡胶树为主的产胶植物做了大量研
究, 但橡胶生物合成的分子机理、橡胶转移酶的
鉴定与特征、橡胶分子量大小的决定机制仍是有
待解决的重要科学问题(van Beilen和Poirier 2007)。
代龙军等: 产胶植物橡胶转移酶的研究进展 1001
橡胶转移酶是天然橡胶合成的重要参与者, 它催
化异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)
的多聚化过程, 因此, 探明橡胶转移酶的性质及其
生物学功能对揭示橡胶生物合成的分子机理及橡
胶分子量大小的决定机制具有重要意义。然而,
目前关于橡胶转移酶的研究还存在争议, 橡胶转
移酶的本质及其亚细胞定位仍不清楚。分离和鉴
定不同产胶植物的橡胶转移酶及其基因, 确定橡
胶转移酶的亚细胞定位及其功能, 将有助于橡胶
树和其他产胶植物的优质新品种的选育和改良。
本文从橡胶转移酶的生物学功能及其分离鉴
定和活性调节等方面对以巴西橡胶树为主的产胶
植物橡胶转移酶的研究历史及最新进展进行了
综述。
1 橡胶转移酶的生物学功能及性质
1.1 橡胶转移酶的作用
天然橡胶合成发生于产胶植物的乳管细胞
(如橡胶树、印度榕和橡胶草)或皮层薄壁细胞(如
银胶菊)。天然橡胶合成过程主要是: 光合作用产
生的蔗糖被运送到乳管细胞或薄壁细胞, 并在其中
被转化酶(亦称β-呋喃果糖苷酶)水解为葡萄糖和
果糖两种单糖; 葡萄糖和果糖进入糖酵解途径, 被
转化为乙酰辅酶A; 乙酰辅酶A经甲羟戊酸(meval-
onate, MVA)途径转化为IPP; IPP经过IPP异构酶作
用转化为二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyro-
phosphate, DMAPP); 反式-异戊烯转移酶(trans-
prenyltransferase, TPT)催化数量不等的IPP单体以反
式构型头尾相接地掺入DMAPP, 生成牻牛儿基焦
磷酸(geranyl pyrophosphate, GPP)、法尼基焦磷酸
(farnesyl pyrophosphate, FPP)及牻牛儿基牻牛儿基
焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)等呈
反式构型的烯丙基焦磷酸(allylic pyrophosphate)引
发底物; 结合于橡胶粒子上的橡胶转移酶连续地
将IPP单体以顺式构型头尾相接地添加到引发底物
上, 形成顺式-1,4-聚异戊二烯; 最后, 橡胶聚合反应
终止, 末端的磷酸基团被移除(Cornish 2001a, b;
Venkatachalam等2013)。GPP、FPP和GGPP等化
合物亦可衍生为单萜、甾醇、植保菌素、脱落
酸、叶绿素、胡萝卜素和赤霉素等次生代谢产物
(Cornish 2001b; Gronover等2011)。天然橡胶合成
中IPP的多聚化过程如图1所示。
1.2 橡胶转移酶的性质
两种异戊烯转移酶参与天然橡胶的合成过程:
TPT负责引发底物的合成, 所掺入的C5单体呈反式
构型; 橡胶转移酶负责催化IPP多聚化, 是一种特
定的顺式-异戊烯转移酶(cis-prenyltransferase, CPT),
所掺入的C5单体呈顺式构型。
据推测, 天然橡胶合成过程中橡胶转移酶催
化IPP多聚化(Archer和Audley 1967; Archer等
1963), 但迄今未能对其进行有效分离和鉴定。本
质上, 橡胶转移酶是一种CPT, 它可能是CPT家族
的一员; 同时, 它能催化合成高分子量天然橡胶,
有别于一般的CPT。橡胶转移酶可能是单一的蛋
白质, 也可能是蛋白质复合体(Cornish 2001a)。已
图1 IPP的多聚化过程
Fig.1 Incorporation of IPP to natural rubber
根据文献(Cornish 2001a, b; Mooibroek和Cornish 2000)改画。TPT包括GPP合成酶、FPP合成酶及GGPP合成酶等。分子式中左侧括
号内1~3个反式双键来自引发底物, 右侧括号内为多聚化过程中形成的顺式双键, 右侧的羟基表示焦磷酸基已被移除。
植物生理学报1002
有的研究表明, IPP多聚化过程除需要橡胶转移酶
外, 还需要其他蛋白质与金属离子等辅助因子及
橡胶粒子等细胞器参与。IPP多聚化形成长链橡胶
分子的过程相当复杂, 是橡胶转移酶及天然橡胶
合成机理之谜至今未能解开的重要原因。
2 橡胶转移酶的分离与鉴定
目前, 已有许多关于产胶植物橡胶转移酶分
离纯化及酶活性研究的报道; 然而, 迄今为止对橡
胶转移酶的本质及其亚细胞定位仍不十分清楚。
2.1 橡胶转移酶活性测定方法
橡胶转移酶活性测定方法起始于1960年代
(Archer等1961, 1963; Archer和Cockbain 1969), 主
要由Arhcer等建立, 并一直为其他研究者沿袭使
用。该方法使用放射性标记的[14C]-IPP作为单体
底物, 有效地监测新掺入的IPP, 反映了橡胶合成速
率及橡胶转移酶活性。Archer等(1963)首次将
[14C]-IPP分别加入橡胶树胶乳高速离心后获得的3
个组分——橡胶粒子 (上层 )、C-乳清 (cen t ra l
serum, 中间层)及黄色体(lutoid, 下层)所组成的体
外反应体系, 以监测天然橡胶合成, 认为IPP单体在
橡胶粒子表面掺入延伸中的含有烯丙基焦磷酸末
端的橡胶分子上; 这一结论成为橡胶转移酶活性
测定的基础。橡胶粒子是该体外反应体系的必需
组分, 橡胶粒子的半单位膜结构为天然橡胶合成
提供水相-有机相分界面: 橡胶粒子的亲水表面为
催化聚合反应的酶或酶复合物提供附着点, 酶或
酶复合物从水相接受引发底物和IPP; 同时, 不断增
长的疏水天然橡胶长链从远端(即长链的起始端)渐
渐进入橡胶粒子内部。
橡胶转移酶活性检测过程是: 将洗涤过的橡
胶粒子(washed rubber particles, WRP)和[14C]-
IPP、引发底物、镁离子等组成体系进行橡胶体外
合成; 用苯或已烷等溶解已合成的顺式-1,4-聚异戊
二烯; 采用液体闪烁计数器检测放射标记的新合
成顺式-1,4-聚异戊二烯(Archer等1963; Archer和
Cockbain 1969)。Mau等(2000)开发出一种底部带
有截留膜的96孔板, 可在橡胶体外合成实验后快
速实现顺式-1,4-聚异戊二烯的收集和检测, 实现了
检测体系微量化与检测过程快捷化。
陈守才等试图把这一技术用于生产实践, 他
们研究了橡胶转移酶活性与橡胶树产胶能力之间
的关系(陈守才等1994), 认为可以利用橡胶转移酶
活性对橡胶树产胶能力进行早期预测(陈守才等
1996)。
然而, 这一检测体系也存在不足, 因为使用
WRP导致不同实验结果之间没有可比性。一方面,
制备WRP没有统一的标准, 各研究者所使用的缓
冲液、离心力、稀释比等参数各不相同; 另一方
面, 通过离心, 难以将橡胶粒子与C-乳清、黄色体
及Frey-Wyssling粒子等彻底分离。McMullen和
McSweeney (1966)的研究表明, 洗涤过程的稀释倍
数不同, 所获得橡胶粒子的蛋白质组成也不同。
2.2 各种产胶植物中的橡胶转移酶
2.2.1 橡胶树橡胶转移酶
2.2.1.1 可溶性的橡胶转移酶 McMullen和McS-
weeney (1966)在Archer等(1963)的研究基础上, 采用
更精细的方法制备WRP: 最高离心力达到170 000×g,
洗涤的总稀释倍数(橡胶粒子离心后形成的乳酪状
橡胶粒子层含C-乳清水相成分, 需要反复洗涤进
行稀释)最高达到1014。电镜观察发现分离到的
WRP有大(组分II)、中(组分III)、小(组分IV)三种
直径。稀释倍数为103时获得的WRP组分II或组分
III, 加入橡胶体外合成体系后不表现橡胶合成活
性, 但补充C-乳清后天然橡胶合成活性可以恢复;
随着稀释倍数增加, 所获得的WRP组分中同样加
入C-乳清, 橡胶合成活性逐渐降低; 直到稀释倍数
达到1014, 所获得的WRP组分中同样加入C-乳清,
橡胶合成速度为0。因此, 他们认为负责IPP多聚化
反应的酶存在于未洗涤的橡胶粒子表面和C-乳清
中, 负责IPP多聚化反应的酶是可溶的。他们的研
究结果还表明, 橡胶粒子体积越小, 单位表面积的
橡胶合成活性越高。
Archer和Audley (1967)及Archer和Cockbain
(1969)采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤和离子交换层
析等方法, 从胶乳的C-乳清中分离了一个分子量
约为60 kDa的水溶性蛋白质, 并将该蛋白质命名为
橡胶转移酶(依照国际生物化学联合会酶学委员会
系统命名规则命名为cis-1,4-polyisoprene pyropho-
sphate:cis-1,4-isoprenyltransferase, 系统命名编号为
EC 2.5.1.20)。
Light和Dennis (1989)重复了Archer等分离纯
化橡胶转移酶的步骤, 从橡胶树胶乳C-乳清中纯
代龙军等: 产胶植物橡胶转移酶的研究进展 1003
化了一个分子量约为38 kDa的可溶蛋白质(不同于
Archer等分离的60 kDa蛋白质), 亦将该蛋白质称
为橡胶转移酶, 该酶生理状态下以二聚体形式存
在。他们采用凝胶过滤层析对胶乳进行分离, 以
获取具有较低内生橡胶转移酶活性的脱蛋白橡胶
粒子。在由纯化的橡胶转移酶、脱蛋白的橡胶粒
子、底物及辅助因子等组成的体外橡胶转移酶活
性测定体系中, 所纯化的蛋白质表现橡胶转移酶
活性; 而当体外合成体系中无橡胶粒子存在, 但有
DMAPP存在时, 该蛋白质可催化合成GPP和全反
式FPP, 表现为TPT活性。为了说明所纯化的“橡胶
转移酶”同时具有CPT及TPT活性, Light等(1989)设
计合成了手性、氚标记的单体底物([14C, 2S-3H]-
IPP)进行橡胶体外合成实验, 以验证该酶的双重立
体选择性。Dennis和Light (1989)进一步指出, 存在
于橡胶粒子上的橡胶延伸因子(rubber elongation
factor, REF)是负责橡胶转移酶立体选择性转换的
蛋白质: REF存在时该酶表现CPT活性; 而无REF
结合到橡胶粒子时该酶呈现TPT活性。
2.2.1.2 橡胶粒子结合的橡胶转移酶 Cornish (1993)
否定了橡胶转移酶兼具CPT和TPT两种功能的观
点, 并提出了新的解释: TPT是水溶性酶, 催化合成
GPP、FPP和GGPP等反式烯丙基焦磷酸引发底物;
橡胶转移酶(一种CPT)则结合于橡胶粒子膜上, 在
橡胶粒子表面催化IPP多聚化反应以形成橡胶分子
的顺式长链。因而, Archer等(1963)、McMullen和
McSweeney (1966)及Light等(1989)所分离的可溶
性“橡胶转移酶”可能是TPT。
2.2.1.3 黄色体膜结合的橡胶转移酶 尽管已有研
究表明天然橡胶多聚化过程发生于橡胶粒子表面
(Archer等1963; McMullen和McSweeney 1966;
Cornish 1993, 2001a; Light和Dennis 1989), 但
Tangpakdee (1997a, b)、Wititsuwannakul等(2003,
2004)的研究却表明BF组分[bottom fraction, 胶乳
经高速离心后沉淀于管底的细胞器组分, 主要含
黄色体和少量Frey-Wyssling粒子与核糖体]中也存
在橡胶转移酶活性。Wititsuwannakul等(2003)认为
不能排除橡胶粒子之外存在天然橡胶生物合成的
可能性。
Tangpakdee等(1997a, b)使用BF成分和C-乳清
分别进行了体外合成实验, 发现橡胶树胶乳的BF
组分存在橡胶转移酶活性。这一结果与Archer等
(1963)的结果完全相反。
Wititsuwannakul等(2003)比较了洗涤过的BF
粒子及WBM (BF粒子经冻融破碎处理及洗涤后获
得BF膜成分)的橡胶合成活性, 认为BF粒子的橡胶
合成催化活性在WBM上。他们用WBM替代WRP
进行橡胶体外合成活性测试, 发现当WBM在70 ℃
下孵育30 min后加入体外合成体系, 橡胶合成活性
会突然增加; 向上述体系添加阴离子去垢剂SDS,
使SDS达到临界胶束浓度, 可显著增强橡胶合成,
而添加非离子去垢剂Triton X-100或Tween-20则不
能增强橡胶合成活性。
Wititsuwannakul等(2004)发现WBM比WRP
橡胶合成活性更高; SDS能促进WBM参与的橡胶
体外合成, 但抑制WRP参与的橡胶体外合成; 含55
个碳原子的烯丙基焦磷酸(C55-PP)是WBM参与的
体外橡胶合成的有效引发底物, 却不是WRP参与
的体外橡胶合成的有效引发底物; 从WBM提取
的蛋白质与2% SDS组成的小囊具有橡胶生物合成
活性。
关于橡胶转移酶的定位存在上述3种截然不
同甚至相互矛盾的观点, 可能是因为体外合成体
系过于复杂 , 不易精确控制。橡胶粒子、C-乳
清、黄色体及Frey-Wyssling粒子等组分难以通过
离心、洗涤彻底分离, 从而影响到这些组分参与
的体外橡胶生物合成活性的测定。橡胶粒子易于
在剪切力作用下破裂而发生凝聚, 因此不能耐受
高强度的反复洗涤; 胶乳中另外一类细胞器黄色
体则对渗透压的变化敏感, 离心及重悬操作易导
致黄色体破裂并释放内容物, 其中的黄色体蛋白
质对橡胶粒子有很强的结合力(代龙军等2012)。
无论是橡胶粒子或黄色体的洗涤, 都必须在洗涤
程度与得率之间有所取舍, 因此研究者通常以有
限次数及有限体积的缓冲液进行洗涤。McMullen
和McSweeney (1966)制备橡胶粒子时所采用的严
格的洗涤方式几乎没有被其他研究者采用。
2.2.1.4 候选的橡胶转移酶CPT Asawatreratanakul
等(2003)对所克隆的2个橡胶树CPT基因HRT1和
HRT2进行了Northern blot与RT-PCR分析, 发现
HRT1和HRT2主要在胶乳表达, 其他组织表达较
少。橡胶粒子参与的体外橡胶转移酶活性分析表
植物生理学报1004
明, 原核表达的重组CPT可催化合成的顺式-1,4-聚
异戊二烯分子量为2×103~1×104 Da; 而在BF成分存
在的情况下, 所合成顺式-1,4-聚异戊二烯的分子量
增加到2×105~1×106 Da。他们还主张HRT2可能在BF
膜成分的某些因子作用下催化顺式-1,4-聚异戊二烯
从头合成。原核表达的HRT1和HRT2主要以不溶状
态存在, 疏水性分析表明HRT1和HRT2可能存在跨
膜区, 因此推测HRT1和HRT2是膜结合的CPT。
Takahashi等(2012)将HRT1和HRT2基因在酿
酒酵母和拟南芥(Arabidopsis T87)中进行了表达,
发现重组的HRT1和HRT2具有CPT活性, 首次发现
重组表达的CPT在不添加橡胶树胶乳组分的体外
合成体系中可催化合成长度为C80~C100 (折合
5.4×103~6.8×103 Da)的顺式-1,4-聚异戊二烯; 而向
体外合成体系添加胶乳组分如WRP、WBM或C-
乳清均不能增强其聚合活性。他们认为Asawatrera-
tanakul等(2003)经原核表达的CPT在未添加胶乳组
分时不具备活性的原因可能是原核表达的蛋白质
未经过翻译后修饰, 或缺少存在于真核生物中的
辅助因子。
Asawatreratanakul等(2003)的研究表明, 原核
表达的HRT2在体外能够催化合成的天然橡胶分子
量为2×105~1×106 Da, 已经接近植物体内合成的天
然橡胶分子量大小, 暗示HRT2可能是橡胶转移酶;
但是, Takahashi等(2012)真核表达的HRT1、HRT2
重组蛋白质在添加胶乳组分即WRP、C-乳清、BF
的情况下均不能增强其聚合活性。
Ko等(2003)进行了胶乳转录组分析, 所获得
的胶乳EST库却未包含他们先前鉴定的4个CPT核
酸序列, 推测是因为这些CPT基因在胶乳中表达水
平过低。Rahman等(2013)发表了橡胶树基因组测
序结果, 从基因组中鉴定了8个CPT基因。此前已
有一些橡胶树CPT基因序列向NCBI提交, 而进行
过功能研究的仅有HRT1和HRT2 (Asawatrera-
tanakul等2003; Takahashi等2012)。Dai等(2013)提
取了洗涤过的橡胶粒子蛋白质并进行了蛋白质组
学分析, 鉴定了6个CPT蛋白, 为寻找橡胶转移酶提
供了线索。
我们从NCBI蛋白质库中检索并获得橡胶树
HRT1及HRT2的非冗余同源蛋白质序列及T. brevi-
corniculatum的3个CPT蛋白质序列, 进行序列比对
并构建系统发生树(图2)。
总之, 橡胶树橡胶转移酶的性质与亚细胞定
位尚无定论, 其分离与鉴定仍有待深入研究。早
图2 橡胶树及橡胶草的CPT进化分析
Fig.2 Phylogenetic tree for CPTs of H. brasiliensis and T. brevicorniculatum
括号中的数字表示氨基酸残基数; ★表示Dai等(2013)在橡胶粒子蛋白质组学研究中鉴定的蛋白质; ●表示HRT1及HRT2。系统树采用
MEGA 5软件生成, 算法为neighbor-joining method, 进化距离计算依据Poisson correction method。
代龙军等: 产胶植物橡胶转移酶的研究进展 1005
期关于橡胶转移酶的报道均未提供氨基酸序列信
息, 然而在当前技术条件下, 分离相关蛋白质, 并
获得其氨基酸序列与核酸序列已经比较容易, 因
此, 有必要对早期分离鉴定橡胶转移酶的尝试进
行重复和验证, 并获得相关蛋白质的氨基酸序列
和核酸序列信息, 以便进行转基因研究。
2.2.2 银胶菊橡胶转移酶 Benedict等(1990)及Mad-
havan和Benedict (1984)测定了银胶菊橡胶粒子中
的橡胶转移酶活性。Benedict等(1990)采用含兼性
离子去垢剂CHAPS的溶液提取了洗涤过的银胶菊
橡胶粒子含量最高的膜结合的52 kDa蛋白质, 称其
为橡胶转移酶。Pan等(1995)获得了该蛋白质的部
分氨基酸序列及部分cDNA序列信息, 序列分析表
明该蛋白质为细胞色素P450 CYP74家族成员, 其
氨基酸序列与细胞色素P450家族成员丙二烯氧合
酶(allene oxide synthase, AOS)十分相似, 酶活性研
究表明该蛋白质具有很强的AOS活性, 从而否定
了该蛋白质为膜结合橡胶转移酶的观点。
2.2.3 橡胶草橡胶转移酶 Schmidt等(2010a)从T.
kok-saghyz (实为T. brevicorniculatum) (Hillebrand
等2012; Post等2012)克隆了3个CPT基因TkCPT1~3,
并在酿酒酵母和烟草中实现了表达 , 他们认为
TkCPT1~3催化T. kok-saghyz (实为T. brevicornicu-
latum)橡胶合成中的IPP多聚化过程, 这3个基因的
功能可能完全一样(Schmidt等2010b)。
Post等(2012)通过RNAi实验, 抑制T. brevi-
corniculatum植株的TkCPT1~3基因表达, 发现转
化植株的天然橡胶产量显著下降而三萜及菊糖
(inulin, 一种贮藏多糖)合成量却显著增加; 同时,
转化植株的甲羟戊二酸单酰CoA还原酶活性也显
著降低, 所含橡胶粒子数量较野生型植物减少。
橡胶草是进行转基因研究的理想产胶植物,
它生命周期较短, 易进行组织培养及转化, 6个月
内就可观察植株的表型变化(Mooibroek和Cornish
2000)。因此, 用橡胶草进行转基因研究是验证产
胶相关基因功能的有效手段。
3 橡胶转移酶的活性调节
尽管目前对橡胶转移酶活性调节机制还知之
甚少, 但借助橡胶体外合成体系及转基因技术, 已
获得了有关橡胶树等产胶植物橡胶转移酶活性调
节的有意义的结果。
3.1 橡胶树的REF
橡胶树的REF曾被认为是天然橡胶合成的关
键蛋白质, 因此被命名为橡胶延伸因子。Dennis和
Light (1989)关于REF负责同一个酶在CPT和TPT
两种活性间切换的观点已被Cornish (1993)否定。
代龙军等(2012)比较了存在于橡胶粒子的REF家
族蛋白质和油体(一种具有半单位膜结构的细胞
器, 内部储存疏水的甘油三酯)的结构蛋白oleosin,
提出REF家族蛋白质可能是橡胶粒子结构蛋白质
的观点。REF的首要功能可能是维持橡胶粒子结
构, 尤其是维持半单位膜的水相-有机相分界面, 从
而保证天然橡胶生物合成的进行。橡胶粒子为负
责天然橡胶多聚化的酶或酶复合体提供亲水的附
着表面; 为已合成及正在合成的天然橡胶分子提
供储存场所, 使疏水的天然橡胶分子包裹在橡胶
粒子内。然而, REF在天然橡胶合成过程中的确切
作用仍不清楚。
3.2 橡胶树的SRPP及其他产胶植物的SRPP类似物
小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,
SRPP)是橡胶树橡胶粒子仅次于REF的高丰度表
达蛋白质。Oh等(1999)克隆了其基因并发现, 向体
外合成体系加入原核表达的重组SRPP有助于天然
橡胶合成; 向体外合成体系加入抗SRPP抗体则抑
制天然橡胶合成。Kim等(2004)在银胶菊中发现了
SRPP的类似物, 命名为GHS (guayule homologue of
SRPP), GHS与SRPP的保守区序列高度同源(序列
相似性为50%), 原核表达的重组GHS蛋白对天然
橡胶体外合成有促进作用。他们认为, SRPP或类
似分子可能是合成高聚合度天然橡胶所必需的蛋
白质, 可能与橡胶转移酶组成复合体发挥作用。
Schmidt等(2010a)在橡胶草T. kok-saghyz (实
为T. brevicorniculatum)中发现了SRPP同源蛋白
TkSRPP1~5 (应为TbSRPP1~5)。Hillebrand等
(2012)采用免疫胶体金电镜技术证实TkSRPP1~5
定位于橡胶粒子表面; 针对TbSRPP1~5的RNAi试
验表明, RNAi植株干胶产量下降40%~50%, 但平
均分子量及分子量分布均无变化, RNAi植株的橡
胶粒子变得不稳定、容易快速凝集 , 因此推测
SRPP的作用可能是维持橡胶粒子结构, 从而有利
于天然橡胶合成及储存。
TbSRPP3是存在于T. brevicorniculatum橡胶粒
植物生理学报1006
子的高丰度蛋白质。Collins-Silva等(2012)发现
TbSRPP3基因过表达植株根部的天然橡胶产量增
加, 而TbSRPP3基因沉默植株根部的橡胶合成产量
则显著下降, 所产生的橡胶分子量也急剧下降。
这表明该基因在植物体内的表达不仅与橡胶的产
量相关, 也与橡胶的聚合程度相关。
Singh等(2003)的研究表明, 抗SRPP抗体与F.
carica和F. benghalensis的橡胶粒子均不存在免疫
识别反应, 因此认为, 这两种植物橡胶粒子的表面
可能没有与SRPP同源的蛋白质。
3.3 天然橡胶多聚化的底物
烯丙基焦磷酸引发底物的分子量越大, 天然
橡胶合成速度越快(DMAPP
主要引发底物被认为是FPP, 因为与其他引发底物
相比, FPP具有更低的结合常数(Cornish 2001b)。
体外橡胶合成实验表明, 反应体系中引发底
物与IPP的浓度比值影响顺式-1,4-聚异戊二烯分子
合成的起始与终止(Castillón和Cornish 1999)。例
如, 当IPP的浓度有限, 而FPP浓度较高时, 合成短
链顺式-1,4-聚异戊二烯; 相反, 当IPP浓度较高, 而
FPP浓度较低时, 则合成长链顺式-1,4-聚异戊二烯
(Castillón和Cornish 1999; da Costa等2005)。
在体内条件下, 橡胶树与银胶菊合成的天然
橡胶分子量远大于印度榕; 但在相同条件(FPP、
IPP浓度)的体外橡胶合成体系中, 橡胶树与银胶菊
橡胶粒子合成的顺式-聚异戊二烯分子量只有印度
榕橡胶粒子合成的一半(Cornish等2000)。这一现
象说明, 尽管橡胶转移酶是天然橡胶多聚化反应
的执行者, 却不是决定分子量的首要因素; 导致这
一现象的原因可能是, 当FPP存在时印度榕橡胶转
移酶对IPP有较高亲和力(Cornish等2000)。
Mau等(2003)发现chaetomellic acid A同系物
和α-hydroxyfarnesylphosphonic acid两类FPP类
似物对橡胶树和银胶菊橡胶粒子参与的橡胶体外
合成有抑制作用, 这表明橡胶转移酶的引发底物
结合位点与以FPP为底物的其他酶的底物结合位
点结构相似。DeGraw等(2007)使用光激活的FPP
类似物标记从橡胶树胶乳获得的蛋白质粗提物,
结果表明, 在天然橡胶合成过程中, REF直接与FPP
作用。
3.4 橡胶生物合成中的蛋白质抑制剂
Archer和Audley (1987)将初步离心后获得的
C-乳清用凝胶过滤层析技术分离, 得到3个组分(按
出峰顺序): 组分A (橡胶粒子)、组分B (蛋白质)、
组分C (蛋白质及其他成分)。将上述组分重新组
合进行体外橡胶合成实验发现, 组分C对组分A参
与的体外天然橡胶合成有增强作用, 组分B对组分
A参与的体外天然橡胶合成则有强烈的抑制作用,
具体而言, 起抑制作用的是一个分子量约为50 kDa
的可热变性蛋白质。
3.5 橡胶生物合成中的金属离子
金属离子通过调节产胶植物橡胶转移酶活性
影响IPP多聚化反应(Kang等2000a, b; Scott等
2003)。橡胶转移酶有多种金属辅助因子, 其中
Mg2+浓度比Mn2+高3个数量级, 因而Mg2+是主要的
金属辅助因子(Scott等2003)。Mg2+或Mn2+浓度影
响IPP掺入合成中的天然橡胶分子的速度; 在橡胶
树、银胶菊和印度榕3种植物中, 橡胶转移酶能结
合FPP、FPP-金属离子或单独结合金属离子, 但不
能单独结合IPP分子(Scott等2003)。在体外合成的
条件下, Mg2+浓度可显著影响橡胶树和银胶菊所
合成天然橡胶的分子量, 但是橡胶树合成天然橡
胶的分子量对Mg2+浓度更敏感(da Costa等2006)。
3.6 橡胶转移酶活性的低温诱导
在Bonner (1943)发现银胶菊橡胶转移酶活性
需要低温诱导的基础上, Benedict等(1983)发现
2-(3,4-dichlorophenoxy)-triethylamine可替代低温
的作用, 诱导银胶菊橡胶转移酶活性。Cornish和
Backhaus (2003)发现夜晚约20 ℃的低温对成熟银
胶菊植株橡胶转移酶活性有诱导作用, 但不能诱
导小于200天龄幼苗产生橡胶转移酶活性。
4 展望
由于橡胶生物合成机理的复杂性, 产胶植物
橡胶转移酶迄今未能得到分离和鉴定, 关于橡胶
转移酶活性的调节也仅有一些间接的实验证据。
橡胶生物合成可能存在共同的机制, 因此, 不同植
物橡胶转移酶、橡胶生物合成分子机理及橡胶分
子量大小决定机制的研究结果可相互借鉴与印证。
目前, 橡胶树基因组数据已经公布, 胶乳转录
组数据亦趋于完善, 这些研究进展使得通过蛋白
质组学技术鉴定更多胶乳或橡胶粒子的低丰度蛋
代龙军等: 产胶植物橡胶转移酶的研究进展 1007
白质成为可能, 从而有助于获得橡胶转移酶及其
辅助蛋白因子的序列信息。全面开展橡胶树等产
胶植物胶乳中的亚细胞结构及全胶乳蛋白质组学
研究, 将为鉴定橡胶转移酶及其辅助因子并最终
阐明橡胶生物合成的分子机理奠定基础。
转基因和RNAi技术可在植物体内对CPT等基
因的生物学功能进行验证, 从而获得产胶相关的
重要功能基因, 这些基因功能的信息将有助于橡
胶树和其他产胶植物的新品种选育和改良。
参考文献
陈守才, 邵寒霜, 胡东琼, 郑学勤(1994). 橡胶转移酶活性与橡胶树
产胶能力关系的研究. 热带作物学报, 15 (增刊): 1~6
陈守才, 郑学勤, 吴坤鑫, 邵寒霜, 胡东琼(1996). 利用橡胶树橡胶转
移酶活性早期预测橡胶树产胶能力的研究. 热带作物学报, 17
(2): 1~4
代龙军, 项秋兰, 黎瑜, 聂智毅, 康桂娟, 段翠芳, 曾日中(2012). 巴西
橡胶树橡胶粒子蛋白质的16-BAC/SDS-PAGE双向电泳及质
谱分析. 中国农业科学, 45 (11): 2328~2338
严瑞芳(1995). 杜仲胶研究进展及发展前景. 化学进展, 7 (1): 65~71
Archer BL, Audley BG (1967). Biosynthesis of rubber. Adv Enzymol
Relat Areas Mol Biol, 29: 221~257
Archer BL, Audley BG (1987). New aspects of rubber biosynthesis.
Bot J Linn Soc, 94 (1~2): 181~196
Archer BL, Audley BG, Cockbain EG, McSweeney GP (1963).
The biosynthesis of rubber. Incorporation of mevalonate and
isopentenyl pyrophosphate into rubber by Hevea brasiliensis-
latex fractions. Biochem J, 89 (3): 565~574
Archer BL, Ayrey G, Cockbain EG, McSweeney GP (1961).
Incorporation of [I-14C]-isopentenyl pyrophosphate into
polyisoprene. Nature, 189: 663~664
Archer BL, Cockbain EG (1969). Rubber transferase from Hevea
brasiliensis latex. Methods Enzymol, 15: 476~480
Asawa t r e r a t anaku l K , Zhang YW, Wi t i t suwannaku l D ,
Wititsuwannakul R, Takahashi S, Rattanapittayaporn A, Koyama
T (2003). Molecular cloning, expression and characterization of
cDNA encoding cis-prenyltransferases from Hevea brasiliensis.
A key factor participating in natural rubber biosynthesis. Eur J
Biochem, 270 (23): 4671~4680
Benedict CR, Madhavan S, Greenblatt GA, Venkatachalam KV,
Foster MA (1990). The enzymatic synthesis of rubber polymer in
Parthenium argentatum Gray. Plant Physiol, 92 (3): 816~821
Benedict CR, Reibach PH, Madhavan S, Stipanovic RV, Keithly
JH, Yokoyama H (1983). Effect of 2-(3,4-dichlorophenoxy)-
triethylamine on the synthensis of cis-polyisoprene in guayule
plants (Parthenium argentatum Gray). Plant Physiol, 72 (3):
897~899
Bonner J (1943). Effects of temperature on rubber accumulation by
the guayule plant. Bot Gaz, 105 (2): 233~243
Bushman BS, Scholte AA, Cornish K, Scott DJ, Brichta JL, Vederas
JC, Ochoa O, Michelmore RW, Shintani DK, Knapp SJ (2006).
Identification and comparison of natural rubber from two
Lactuca species. Phytochemistry, 67 (23): 2590~2596
Castillón J, Cornish K (1999). Regulation of initiation and polymer
molecular weight of cis-1,4-polyisoprene synthesized in vitro
by particles isolated from Parthenium argentatum (Gray).
Phytochemistry, 51 (1): 43~51
Collins-Silva J, Nural AT, Skaggs A, Scott D, Hathwaik U, Woolsey
R, Schegg K, McMahan C, Whalen M, Cornish K et al (2012).
Altered levels of the Taraxacum kok-saghyz (Russian dandelion)
small rubber particle protein, TkSRPP3, result in qualitative and
quantitative changes in rubber metabolism. Phytochemistry, 79:
46~56
Cornish K (1993). The separate roles of plant cis and trans prenyl
transferases in cis-1,4-polyisoprene biosynthesis. Eur J Biochem,
218 (1): 267~271
Cornish K (2001a). Biochemistry of natural rubber, a vital raw
material, emphasizing biosynthetic rate, molecular weight and
compartmentalization, in evolutionarily divergent plant species.
Nat Prod Rep, 18 (2): 182~189
Cornish K (2001b). Similarities and differences in rubber biochemistry
among plant species. Phytochemistry, 57 (7): 1123~1134
Cornish K, Backhaus RA (2003). Induction of rubber transferase
activity in guayule (Parthenium argentatum Gray) by low
temperatures. Ind Crops Prod, 17 (2): 83~92
Cornish K, Castillon J, Scott DJ (2000). Rubber molecular weight
regulation, in vitro, in plant species that produce high and low
molecular weights in vivo. Biomacromolecules, 1 (4): 632~641
Cornish K, Siler DJ (1995). Effect of different allylic diphosphates
on the initiation of new rubber molecules and on cis-1,4-
polyisoprene biosynthesis in guayule (Parthenium argentatum
Gray). J Plant Physiol, 147 (3): 301~305
da Costa BMT, Keasling JD, Cornish K (2005). Regulation of rubber
biosynthetic rate and molecular weight in Hevea brasiliensis by
metal cofactor. Biomacromolecules, 6 (1): 279~289
da Costa BMT, Keasling JD, McMahan CM, Cornish K (2006).
Magnesium ion regulation of in vitro rubber biosynthesis
by Parthenium argentatum Gray. Phytochemistry, 67 (15):
1621~1628
Dai LJ, Kang GJ, Li Y, Nie ZY, Duan CF, Zeng RZ (2013). In-depth
proteome analysis of the rubber particle of Hevea brasiliensis
(para rubber tree). Plant Mol Biol, 82 (1~2): 155~168
DeGraw AJ, Zhao Z, Strickl CL, Taban AH, Hsieh J, Jefferies M,
Xie W, Shintani DK, McMahan CM, Cornish K et al (2007). A
photoactive isoprenoid diphosphate analogue containing a stable
phosphonate linkage: synthesis and biochemical studies with
prenyltransferases. J Org Chem, 72 (13): 4587~4595
Dennis MS, Light DR (1989). Rubber elongation factor from Hevea
brasiliensis. Identification, characterization, and role in rubber
biosynthesis. J Biol Chem, 264 (31): 18608~18617
Gronover CS, Wahler D, Prüfer D (2011). Natural rubber biosynthesis
and physic-chemical studies on plant derived latex. In: Elnashar
M (ed). Biotechnology of Biopolymers. Croatia: InTech, 75~88
Hillebrand A, Post JJ, Wurbs D, Wahler D, Lenders M, Krzyzanek V,
Prüfer D, Gronover CS (2012). Down-regulation of small rubber
植物生理学报1008
particle protein expression affects integrity of rubber particles
and rubber content in Taraxacum brevicorniculatum. PLoS One,
7: e41874
Kang H, Kang MY, Han KH (2000a). Identification of natural rubber
and characterization of rubber biosynthetic activity in fig tree.
Plant Physiol, 123 (3): 1133~1142
Kang H, Kim YS, Chung GC (2000b). Characterization of natural
rubber biosynthesisin Ficus benghalensis. Plant Physiol
Biochem, 38 (12): 979~987
Kim IJ, Ryu SB, Kwak YS, Kang H (2004). A novel cDNA from
Parthenium argentatum Gray enhances the rubber biosynthetic
activity in vitro. J Exp Bot, 55 (396): 377~385
Ko JH, Chow KS, Han KH (2003). Transcriptome analysis reveals
novel features of the molecular events occurring in the laticifers
of Hevea brasiliensis (para rubber tree). Plant Mol Biol, 53 (4):
479~492
Light DR, Dennis MS (1989). Purification of a prenyltransferase
that elongates cis-polyisoprene rubber from the latex of Hevea
brasiliensis. J Biol Chem, 264 (31): 18589~18597
Light DR, Lazarus RA, Dennis MS (1989). Rubber elongation by
farnesyl pyrophosphate synthases involves a novel switch in
enzyme stereospecificity. J Biol Chem, 264 (31): 18598~18607
Madhavan S, Benedict CR (1984). Isopentenyl pyrophosphate cis-1,4-
polyisoprenyl transferase from guayule (Parthenium argentatum
Gray). Plant Physiol, 75 (4): 908~913
Mau CJD, Garneau S, Scholte AA, Van Fleet JE, Vederas JC, Cornish
K (2003). Protein farnesyltransferase inhibitors interfere with
farnesyl diphosphate binding by rubber transferase. Eur J
Biochem, 270 (19): 3939~3945
Mau CJD, Scott DJ, Cornish K (2000). Multiwell filtration system
results in rapid, high-throughput rubber transferase microassay.
Phytochem Anal, 11 (6): 356~361
McMullen AI, McSweeney GP (1966). The biosynthesis of rubber:
incorporation of isopentenyl pyrophosphate into purified rubber
particles by a soluble latex serum enzyme. Biochem J, 101 (1): 42~47
Mooibroek H, Cornish K (2000). Alternative sources of natural
rubber. Appl Microbiol Biotechnol, 53 (4): 355~365
Oh SK, Kang H, Shin DH, Yang J, Chow KS, Yeang HY, Wagner B,
Breiteneder H, Han KH (1999). Isolation, characterization, and
functional analysis of a novel cDNA clone encoding a small
rubber particle protein from Hevea brasiliensis. J Biol Chem,
274 (24): 17132~17138
Pan Z, Durst F, Werck-Reichhart D, Gardner HW, Camara B, Cornish
K, Backhaus RA (1995). The major protein of guayule rubber
particles is a cytochrome P450. Characterization based on cDNA
cloning and spectroscopic analysis of the solubilized enzyme and
its reaction products. J Biol Chem, 270 (15): 8487~8494
Post J, van Deenen N, Fricke J, Kowalski N, Wurbs D, Schaller
H, Eisenreich W, Huber C, Twyman RM, Prüfer D et al
(2012). Laticifer-specific cis-prenyltransferase silencing
affects the rubber, triterpene, and inulin content of Taraxacum
brevicorniculatum. Plant Physiol, 158 (3): 1406~1417
Rahman AYA, Usharraj AO, Misra BB, Thottathil GP, Jayasekaran
K, Feng Y, Hou S, Ong SY, Ng FL, Lee LS et al (2013). Draft
genome sequence of the rubber tree Hevea brasiliensis. BMC
Genomics, 14: 75
Schmidt T, Hillebrand A, Wurbs D, Wahler D, Lenders M, Gronover
CS, Prüfer D (2010a). Molecular cloning and characterization of
rubber biosynthetic genes from Taraxacum koksaghyz. Plant Mol
Biol Rep, 28 (2): 277~284
Schmidt T, Lenders M, Hillebrand A, van Deenen N, Munt O,
Reichelt R, Eisenreich W, Fischer R, Prüfer D, Gronover CS
(2010b). Characterization of rubber particles and rubber chain
elongation in Taraxacum koksaghyz. BMC Biochem, 11: 11
Scott DJ, da Costa BMT, Espy SC, Keasling JD, Cornish K (2003).
Activation and inhibition of rubber transferases by metal
cofactors and pyrophosphate substrates. Phytochemistry, 64 (1):
123~134
Singh AP, Wi SG, Chung GC, Kim YS, Kang H (2003). The
micromorphology and protein characterization of rubber particles
in Ficus carica, Ficus benghalensis and Hevea brasiliensis. J
Exp Bot, 54 (384): 985~992
Swanson CL, Buchanan RA, Otey FH (1979). Molecular weights
of natural rubbers from selected temperate zone plants. J Appl
Polym Sci, 23 (3): 743~748
Takahashi S, Lee H-J, Yamashita S, Koyama T (2012). Characteri-
zation of cis-prenyltransferases from the rubber producing plant
Hevea brasiliensis heterologously expressed in yeast and plant
cells. Plant Biotechnol, 29 (4): 411~417
Tangpakdee J, Tanaka Y, Ogura K, Koyama T, Wititsuwannakul R,
Wititsuwannakul D (1997a). Rubber formation by fresh bottom
fraction of Hevea latex. Phytochemistry, 45 (2): 269~274
Tangpakdee J, Tanaka Y, Ogura K, Koyama T, Wititsuwannakul R,
Wititsuwannakul D, Asawatreratanakul K (1997b). Isopentenyl
diphosphate isomerase and prenyl transferase activities in bottom
fraction and C-serum from Hevea latex. Phytochemistry, 45 (2):
261~267
van Beilen JB, Poirier Y (2007). Establishment of new crops for
the production of natural rubber. Trends Biotechnol, 25 (11):
522~529
Venkatachalam P, Geetha N, Sangeetha P, Thulaseedharan A (2013).
Natural rubber producing plants: an overview. Afr J Biotechnol,
12 (12): 1297~1310
Wititsuwannakul D, Rattanapittayaporn A, Koyama T, Wititsuwaa-
nnakul R (2004). Involvement of Hevea latex organelle
membrane proteins in the rubber biosynthesis activity and
regulatory function. Macromol Biosci, 4 (3): 314~323
Wititsuwannakul D, Rattanapittayaporn A, Wititsuwannakul R
(2003). Rubber biosynthesis by a Hevea latex bottom-fraction
membrane. J Appl Polym Sci, 87 (1): 90~96