全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (1): 95~104 95
收稿 2013-09-22　　修定 2013-11-15
资助 国家重点基础研究发展计划(2009CB118505)和国家自然
科学基金(31071338和31171474)。
* 通讯作者(E-mail: sspp@sdau.edu.cn; Tel: 0538-8246298)。
过表达单脱氢抗坏血酸还原酶基因提高番茄抗UV-B胁迫能力
王玉, 孔凡英, 尹波, 董新纯*, 孟庆伟
山东农业大学生命科学学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271018
摘要: 以野生型(WT)和转正义叶绿体单脱氢抗坏血酸还原酶基因(LeMDAR)番茄为试材, 探讨了UV-B胁迫下过表达
LeMDAR对番茄抗氧化能力的影响。测定了不同时间UV-B处理下番茄抗坏血酸(AsA)含量, 脱氢抗坏血酸(DHA)含量, 单
脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)活性, 光合速率和叶绿素荧光参数等。在UV-B处理下, 转基因番茄植株的AsA含量、 MDAR
酶及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、H2O2和超氧阴离子清除速率、净光合速率(Pn)高于野生型番茄。此外, 紫外胁迫下,
转基因株系丙二醛(MDA)含量和相对电导率(REC)较野生型增加的少。上述结果表明, MDAR对抗坏血酸再生具有重要作
用, 过表达LeMDAR提高了番茄植株抗氧化能力, 对光合机构有保护作用。
关键词: 番茄; LeMDAR; UV-B胁迫; 抗坏血酸再生; 抗氧化能力
Overexpression of Chloroplastic Monodehydroascorbate Reductase Gene
Enhanced Tolerance to UV-B Stress in Tomato
WANG Yu, KONG Fan-Ying, YIN Bo, DONG Xin-Chun*, MENG Qing-Wei
College of Life Science, State Key Laboratory of Crop Biology, Shandon Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018, China
Abstract: The wild type (WT) and transgenic tomato lines with overexpression of chloroplastic
monodehydroascorbate reductase gene (LeMDAR) were used to investigate the antioxidant ability under UV-B
stress. Contents of ascorbic acid (AsA) and dehydrogenation ascorbic acid (DHA), monodehydroascorbic acid
reductase (MDAR) activities, net photosynthetic rate (Pn) and chlorophyll fluorescence parameters were
measured under UV-B treatment. Compared with WT, AsA content, activities of APX and MDAR in transgenic
plants increased and the contents of H2O2 and O2¯· decreased. In transgenic plants, the higher Pn, the lower MDA
content and the relative electric conductivity (REC) were detected, compared with WT under UV-B. These
results indicated that MDAR has an important role in AsA regeneration, and overexpression of LeMDAR
improved the plant antioxidant ability and protected photosynthetic mechanism.
Key words: tomato; LeMDAR; UV-B stress; AsA regeneration; antioxidant ability
近年来, 随着臭氧层的破坏, 到达地面的紫外
辐射日益增多, 尤其是UV-B。它不仅能导致DNA
和RNA的损伤, 产生大量的活性氧(reactive oxygen
species, ROS), 影响植物生长发育, 还是逆境响应
的关键信号(Jansena和Bornmanb 2012)。低水平的
UV-B辐射对植物有诱导作用, 能够促进植物通过
信号转导、酶促及非酶促反应等增强植物的抵抗
能力。而高水平的紫外辐射则对植物产生不可逆
破坏, 甚至导致死亡(Hideg等2012)。近期有研究
发现, UV-B可以通过诱导气孔关闭限制光合作用,
并且与Gα蛋白、NO、H2O2组成的信号通路密切
相关(He等2013)。
植物主要通过两种途径抵抗UV-B辐射: 一是
酶促反应, 主要包括超氧化物歧化酶(superoxide
diamutase, SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶以及
参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环的酶类, 如抗坏血酸
过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)、单脱氢
抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbic acid reductase,
MDAR)、谷胱甘肽还原酶(gultathione reductase,
GR)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate
reductase, DHAR)等。二是非酶促反应, 主要包括
一些低分子量的抗氧化物质, 如抗坏血酸(ascorbate,
AsA)、谷胱甘肽、α-生育酚、类黄酮等。其中,
抗坏血酸(AsA)作为叶绿体中最主要的抗氧化物
质和自由基清除剂可能具有多种作用: (1) AsA可
植物生理学报96
以直接清除羟基自由基、有机自由基等, 催化脂
溶性抗氧化物质α-生育酚氧化型转变为具有抗氧
化作用的还原型(Mittler 2002); (2)叶绿体中的ROS
主要是通过水-水循环来清除的, AsA作为电子供
体参与到水-水循环去清除H2O2, 维持叶绿体基质
中卡尔文循环的某些酶和对H2O2敏感的酶类活性
(Han等2010); (3) AsA的光保护作用在类囊体腔中
也是必不可少的, 最主要的作用是为叶黄素循环
关键酶——紫黄质脱环氧化酶(violaxanthin de-
epoxidase, VDE)提供电子(Muller-Moule等2004)。
此外, 人们认为AsA可能在光系统I (photosystem I,
PSI)和光系统II (photosystem II, PSII)发生光氧化
时作为一种次级电子供体发挥作用, 当放氧复合
体在酸性pH或UV-B作用下失活时, AsA可以取代
水作为应急电子供体 , 为PSII提供电子(Asada
1999)。在对拟南芥抗坏血酸缺陷突变体vtc1的研
究中发现, 紫外胁迫下缺陷型株系对UV-B更敏感,
说明抗坏血酸对UV-B辐射是不可或缺的抗氧化剂
(Gao和Zhang 2008)。
番茄果实和叶片中的AsA含量受环境条件的
影响, 细胞中AsA的水平受合成、再生、降解和细
胞或器官间运输的调控(Noctor和Foyer 1998)。
AsA首先在线粒体合成, 随后被运输到植物细胞的
其它组分中。大部分AsA位于质膜, 超过10%位于
质外体, 另外12%~30%在叶绿体中积累。植物叶
绿体中AsA含量因植物种类和所处环境而不同, 在
C3植物中可达10~50 mmol·L
-1, 在高海拔植物中甚
至可以达到300 mmol·L-1。尽管植物细胞中AsA含
量很高, 但在强光等环境胁迫下叶绿体中的AsA库
在几分钟内便被氧化(Polle 2001)。因此, AsA有效
功能的发挥还需要维持还原型AsA的含量。为了
更好地适应环境, 植物进化出了还原性AsA的回补
途径(Damian等2007)。目前, 对该途经中研究较多
的酶有单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、脱氢抗
坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)。
其中, MDAR是抗坏血酸回补途径的关键酶。它利
用NADH或NADPH作为电子供体, 催化氧化态的
单脱氢抗坏血酸(MDA)重新还原成AsA。
MDAR存在于植物的细胞质、叶绿体、线粒
体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、微体中
(Horemans等2000)。目前, 对MDAR的研究主要集
中在胞质及过氧化物酶体MDAR上 , 对叶绿体
MDAR研究相对较少。拟南芥基因组有5个MDAR
亚型(Leterrier等2005)。研究发现拟南芥MDAR4对
种子萌发期油脂的储存及发芽后的生长是必需的
(Eastmond 2007); 在番茄中, 过表达质体MDAR增
加了MDAR活性和AsA的效力, 提高了转基因番茄
对温度和干旱等非生物胁迫的抗性(Li等2010)。
此外, 在烟草中过表达MDAR也增强了转基因烟草
抗臭氧和低温胁迫的能力(Eltaye等2007)。这表明,
MDAR对植物抵抗逆境胁迫具有重要作用。此外,
有研究发现AsA可以还原液泡或胞壁中的酚自由
基, MDAR还可以以苯氧基自由基为底物, 通过类
似MDA还原的机制还原苯氧基自由基, 再生出相
应的酚类物质(Sakihama等2000)。这表明, MDAR
在植物响应紫外胁迫中可能具有重要作用。但这
方面的研究还未见报道。因此, MDAR抵抗UV-B
的作用有待深入探讨。本研究利用番茄过表达
LeMDAR株系, 研究了其在UV-B胁迫中的作用。
材料与方法
1 植物材料处理
以本实验室获得的LeMDAR过表达番茄株系
(Li 等2010)和野生型番茄(Lycopersicon esculentum
Mill) (‘中蔬六号’)为试材, 将种子在含卡那霉素的
MS培养基中培养至真叶展开, 播于塑料盒内, 以蛭
石为基质, Hongland培养液培养。于室温 (25±2)
℃, 光照800 μmol·m-2·s-1, 湿度80%的条件下生长。
大约10周的幼苗于0.07 W·m-2紫外处理不同时间,
取样, –80 ℃备用。
2 测定项目与方法
2.1 PCR和荧光定量PCR
利用CTAB微量法提取转基因番茄叶片中的
总DNA, 以此为模板, 进行PCR检测。所用引物为:
35S (5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′)和
LeMDARR (5′-CAGCGCCAACACAAGTATG-3′),
按照天根RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。将
2 μg RNA在70 ℃下变性5 min, 加入1 μL反转录酶,
1 μL RNA酶抑制剂, 按照TaKaRa反转录试剂盒的
方法获得cDNA。采用伯乐公司生产的实时荧光
定量分析仪(Bio-Rad CFX96TM), 天根公司的
SYBR Real Master Mix进行荧光定量分析。所用
王玉等: 过表达单脱氢抗坏血酸还原酶基因提高番茄抗UV-B胁迫能力 97
程序为: 95 ℃变性30 s; 95 ℃, 5 s, 58 ℃, 10 s,
72 ℃, 10 s, 40个循环。所用引物为: 内参引物EF-
1αF (5′-GGAACTTGAGAAGGAGCCTAAG-3′)和
EF-1αR (5′-CAACACCAACAGCAACAGTCT-3′);
目标基因引物LeMDARF (5′-GCTGGATATGCTGC-
TAGAACT-3′)和LeMDARR (5′-CCAGCGCCAA-
CACAAGTATG-3′)。EF-1α是内参基因, 其GenBank
注册号是X144491。
2.2 光合气体交换参数和叶绿素荧光参数的测定
采用英国PP Systems公司生产的CIRAS-2便
携式光合作用系统测定净光合速率(Pn), 测定在室
温和大气CO2浓度下进行, 光照强度800 μmol·m
-2·s-1,
叶温25 ℃, 氧气含量21%, CO2浓度360 μL·L
-1。每
处理重复3次, 结果以平均值±标准误表示。
叶绿素荧光参数测定参考Kooten和Snel (1990)
的方法, 采用Hansatech公司生产的脉冲调制式便
携荧光仪FMS2测定。处理过程中PSII最大光化学
效率(Fv/Fm)在暗中适应15 min后测定。Fv/Fm=(Fm–
Fo)/Fm, ΦPSII =(Fm′–Fs)/Fm′。其中, Fo为初始荧光, Fm
为最大荧光, Fm′为光适应下最大荧光, Fs为稳态荧
光, Fo′为光下最小荧光。每处理重复3次, 每重复
测定5株, 结果以平均值±标准误表示。
2.3 膜电解质外渗和膜脂氧化分析
膜透性参照Sun等(2010)的方法测定, 打取直
径0.8 cm的叶圆片, 放入具塞试管中, 用去离子水
漂洗3次, 加15 mL去离子水置真空泵中抽气30
min, 放振荡器上振荡3 h, 取下静置摇匀, 测定初电
导。 测毕煮30 min, 冷却至室温10 min, 测定终电
导。其中相对电导率(%)=(初电导–空白)×100/(终
电导–空白)。
TBARS的测定参照赵世杰等(2002)的方法:
0.5 g材料剪碎, 加入2 mL 10% TCA和少量石英砂,
研磨, 再加8 mL 10% TCA研磨至匀浆, 4 000×g离
心10 min, 上清为提取液。2 mL上清液(对照加2
mL蒸馏水)加入2 mL 0.6% TBA溶液, 混匀, 沸水浴
15 min, 迅速冷却后离心。取上清液测定532、600
和450 nm波长下的消光度。每处理重复3次, 结果
以平均值±标准误表示。
2.4 H2O2含量测定和O2¯· 检测
超氧阴离子自由基含量参照王爱国和罗广华
(1990)的方法。
H2O2含量的测定参照Ferguson (1983)的方法,
取0.2 g样品, 加入丙酮抽提, 提取液在钛盐(TiCl4)
与浓HCl的混合物和浓氨水反应, 将所生成的过氧
化物离心沉淀。沉淀溶于1 mmol·L-1 H2SO4中, 于
415 nm下测定吸光值。结果以µmol·g-1 (FW)表示,
用溶于3%三氯乙酸的H2O2作标准曲线。每处理重
复3次, 结果以平均值±标准误表示。
H2O2的染色: 将叶片浸泡在0.5 mg·mL
-1 3,3’-
二氨基联苯胺(diaminobezidine, DAB)染色液中(pH
3.8), 25 ℃黑暗培养过夜。转入固定液(乙醇:乳酸:
甘油=3:1:1)中煮沸10 min, 冷却, 将叶片转入新鲜
的固定液中。室温下过夜, 拍照。
O2¯· 检测: 叶片浸泡于0.1 mg·mL
-1的NBT溶液
中, 在25 ℃黑暗培养16 h。转入固定液(乙醇:乳酸:
甘油=3:1:1)中煮沸10 min, 冷却, 将叶片转入新鲜
的固定液中。室温下过夜, 拍照。
2.5 APX和SOD活性的测定
APX酶活性测定参照Mishra等(1993)的方法,
以每分钟氧化1 μmol AsA的酶量为一个酶活单位。
SOD活性的测定参照Bartoli等(1999)的方
法。取0.5 g叶片放于预冷的研钵中, 加1 mL磷酸
缓冲液冰浴研磨成浆, 加缓冲液至终体积5 mL。取
2 mL于10 500×g下离心10 min, 上清液即为SOD及
POD粗提液。显色反应后计算其活性。酶活性的测
定每处理重复3次, 结果以平均值±标准误表示。
2.6 AsA及MDAR酶活测定
AsA含量测定参照Kampfenkel等(1995)的方
法。0.5 g叶片加入2 mL 6% TCA研磨成匀浆, 4 ℃,
13 000×g离心5 min, 上清立即用于AsA和氧化型抗
坏血酸(DHA)的测定。AsA反应液包括0.2 mL提
取液(空白以6% TCA代替)、0.6 mL 0.2 mol·L-1
PBS (pH 7.4), 0.2 mL ddH2O, 1 mL 6% TCA, 0.8 mL
42% H3PO4, 0.8 mL 4% 2,2’-二联吡啶和0.4 mL 3%
FeCl3。总AsA (AsA+DHA)的测定以0.2 mL 10
mmol·L-1 DTT和0.4 mL 0.2 mol·L-1 PBS (pH7.4)代
替以上0.6 mL 0.2 mol·L-1 PBS。反应液42 ℃温浴1 h,
测定525 nm吸光值。DHA含量为总AsA含量与未
加DTT时所测得AsA含量的差值。每处理重复3
次, 结果以平均值±标准误表示。
MDAR酶活性的测定参照Hossain (1984)的方
法: 取0.2 g样品液氮研磨成粉末, 加入2 mL提取液,
植物生理学报98
继续研磨成匀浆。转移至2 mL离心管中4 ℃, 12 000×
g离心15 min, 上清立即用于酶活性的测定。反应
液为50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5)、0.2 mmol·L-1
NADH、2.5 mmol·L-1 AsA、0.15单位抗坏血酸氧
化酶和 10 µL 酶提取液。测定340 nm下吸收值的
变化(消光系数: NADH= 6.2 mmol·L-1·cm-1)。提取
液: 50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH 7.8), 其中抗坏血
酸终浓度为1 mmol·L-1。
实验结果
1 转基因株系验证
利用PCR和qRT-PCR对转基因株系进行筛选;
如图1所示, 野生型中未出现条带, T2代转基因株系
可见明显的条带, 并且具有LeMDAR表达量差异。
对各株系进行荧光定量分析, 发现S-3、S-17和
S-23三个株系表达量较高, 选取这三个株系进行生
理功能研究。
2 LeMDAR过表达增加MDAR酶活性和抗坏血酸
含量
紫外胁迫后, MDAR酶活性降低, 但是转基因
株系明显高于野生型(图2), 表明转基因株系具有
较高的维持抗坏血酸库的能力。
图1 转基因番茄的PCR及qRT-PCR验证
Fig.1 Identification of transgenic tomato plants
A: 转基因番茄植株的PCR检测。M: 2 kb DNA ladder, 分子量
由高到低为2 000、1 000、750、500、250和100 bp; WT: 野生型
番茄; S-2、S-3、S-17、S-18和S-23为转正义LeMDAR株系。B: 转
基因番茄植株的qRT-PCR检测。
图2 UV-B处理对野生型和转基因番茄MDAR 酶活的影响
Fig.2 Effect of UV-B treatment on MDAR activity of WT
tomato and transgenic plants
1个单位MDAR酶活力用单位时间氧化NADH的量表示。
紫外处理后, 野生型与转基因植株还原型AsA、
DHA含量均下降(图3-A、D), WT、 S-3、S-17和
S-23中还原型AsA含量分别为0.7844、0.9184、
0.9051和0.9649 μmol·g-1 (FW), 分别为处理前的
75.7%、87.2%、83.0%和79.0%。转基因株系AsA/
MDA高于野生型, 但野生型及转基因株系的AsA/
DHA呈现出不同的趋势(图3-B), 这可能与转基
因株系MDAR表达量增加, 促使还原型AsA增加
有关。
3 LeMDAR过表达降低了紫外辐照对光合机构的
破坏
为了探究紫外胁迫下MDAR对光合机构的保
护作用, 我们分别测定了野生型和转基因番茄植
株的Pn、Fv/Fm和ΦPSII。随着紫外处理时间的增加,
Fv/Fm、ΦPSII均呈现下降的趋势, 在0~12 h内缓慢下
降, 随后明显下降(图4-A、B)。我们测定了0 h和
24 h的Pn和Fo (图5), 24 h紫外胁迫后, 野生型与转
基因株系的P n均下降 , 分别为原来的18.4%、
王玉等: 过表达单脱氢抗坏血酸还原酶基因提高番茄抗UV-B胁迫能力 99
图3 UV-B处理对野生型和转基因番茄叶片AsA (A)、AsA/DHA (B)、总AsA (C)和DHA (D)的影响
Fig.3 Effect of UV-B treatment on AsA (A), AsA/DHA (B), total AsA (C) and DHA (D) in leaves of WT tomato and transgenic plants
图4 UV-B处理对野生型和转基因番茄Fv/Fm (A)和ΦPSII (B)的影响
Fig.4 Effect of UV-B treatment on Fv/Fm (A) and ΦPSII (B) in WT tomato and transgenic plants
植物生理学报100
27.5%、29.5%和30.3%。Fo略升高。这表明, 在紫
外胁迫下, 转基因株系有较强的光合能力, 对PSII
有更好的保护作用。
4 MDAR的过表达提高对膜脂的保护作用
紫外处理前, 野生型与转基因株系的丙二醛
及膜透性无明显差别, 处理24 h后, 野生型明显增
加, 丙二醛及相对电导率各增加了3.5倍和5.6倍,
转基因株系增加较小。S-3、S-17、S-23丙二醛含
量增加了1.1倍、1.8倍和1.25倍, 相对电导率增加
了5.28倍、2.95倍、1.3倍(图6), 处理后, WT、
S-3、S-17、S-23丙二醛含量变为43.9、25.3、29.5
图5 UV-B处理野生型和转基因番茄对Fo (A)和Pn (B)的影响
Fig.5 Effect of UV-B treatment on Fo (A) and Pn (B) in WT
tomato and transgenic plants
和25.3 nmol·g-1(FW); 相对电导率变为46.7%、
42.3%、33.6%和23.2%。
5 MDAR过表达提高了抗氧化能力
处理前野生型和转基因株系的H2O2含量相差
不大。紫外处理后, 各株系H2O2含量均有上升, 转
基因稍低于野生型。超氧阴离子在处理前后变化
较大, 含量明显增加, WT、S-3、S-17、S-23分别
为10.5838、7.2254、7.6901和7.3803 μmol·g -1
(FW)。较处理前, 野生型升高了83.5%, 转基因株
系分别增加了39%、65.4%、54.8%。处理后, 野
图6 UV-B处理对野生型和转基因番茄MDA (A)和相对电
导率(B)的影响
Fig.6 Effect of UV-B treatment on MDA content (A)
and relative electrical conductivity (B) in WT tomato and
transgenic plants
王玉等: 过表达单脱氢抗坏血酸还原酶基因提高番茄抗UV-B胁迫能力 101
生型积累更多的斑点, 转基因株系颜色较浅, 并且,
紫外胁迫后叶片均出现色素增加现象。
6 SOD、APX活性变化
处理前, 转基因株系的SOD、APX活性均明
显高于野生型。紫外胁迫后, SOD、APX的活性
均有下降, 但转基因株系活性明显高于野生型(图
8)。处理后, SOD活性变化明显, 分别为处理前的
16%、34%、23%和23%。胁迫后野生型和转基因
株系APX活性降低为22.25、29.65、33.35和37.05
μmol·g-1(FW)·min-1。
讨　　论
随着臭氧层的破坏, UV-B紫外胁迫日渐成为
影响植物生长发育的重要环境因子, 它不仅能导
致DNA和RNA的氧化损伤, 还能诱导产生大量的
活性氧(ROS)。AsA是重要的抗氧化物质, 其再生
维持了还原型AsA库, 对植物抵抗逆境伤害有不可
替代的作用。本实验表明番茄LeMDAR的过表达
提高了转基因番茄对UV-B胁迫的抗性。
植物叶绿体中抗坏血酸含量根据种类和所处
环境不同而异。尽管植物细胞中抗坏血酸含量很
高, 在强光等环境胁迫下, 叶绿体中的抗坏血酸库
在几分钟内便被氧化(Polle 2001)。植物体内还原
型抗坏血酸库的维持除了通过抗坏血酸的合成之
外, 由氧化型抗坏血酸再生出还原型抗坏血酸也
是必不可少的。MDAR是抗坏血酸再生过程中的
关键酶。有研究预测叶绿体中的单脱氢抗坏血酸
可在远离类囊体膜可以通过抗坏血酸-谷胱甘肽
(ascorbate-glutathion, AsA-Glu)循环中的MDAR还
原。在本实验中, 过表达番茄LeMDAR能明显提高
转基因番茄的MDAR酶活(图2)。同时转基因番茄
还具有较高的还原型AsA含量及较低含量的氧化
型AsA, 说明LeMDAR的过表达促进了转基因番茄
中还原型抗坏血酸的再生(图3)。抗坏血酸在生物
图7 UV-B处理对野生型和转基因番茄叶片H2O2 (A和C)及O2¯· (B和D)的影响
Fig.7 Effect of UV-B treatment on H2O2 (A, C) and O2¯· (B, D) in leaves of WT tomato and transgenic plants
C: DAB是专一H2O2染料, 表示H2O2含量; D: NBT是专一O2¯· 染料, 表示O2¯· 含量。
植物生理学报102
体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用, 其含量
与植物的抗逆性相关(Mittova等2002)。因此, 提高
植物抗坏血酸的含量, 不仅可以增加植物产品的营
养品质, 而且可以提高植物对环境胁迫的抗性。
UV-B紫外等环境胁迫可能抑制PSII的修复,
造成光氧化损伤(Takahashi和Murata 2008)。也有
研究表明, 在紫外胁迫下破坏光合系统中的Mn簇,
进而破坏供体侧(Vass等2002), 影响光合能力。叶
绿体AsA在光合作用的光破坏防御过程中起着重
要的作用(Smirnoff 2000)。在类囊体腔中, AsA为
叶黄素循环关键酶——紫黄质脱环氧化酶(VDE)
提供电子。此外, 当放氧复合体在酸性pH或UV-B
作用下失活时, AsA还可以取代水作为应急电子供
体, 为PSII提供电子。各株系Fv/Fm及ΦPSII在较短时
间UV-B处理下变化不大, 在较长处理时间下明显
降低(图4) , 但是转基因株系中Fv/Fm及ΦPSII的下降
明显低于WT, 说明转基因株系能维持较高的PSII
活性。UV-B处理24 h后, Fo升高(图5-A), 光合速
率也明显下降(图5-B), 相比之下, 转基因株系具有
较高的光合速率。说明LeMDAR的过表达可以降
低UV-B胁迫对光合机构的破坏。
UV-B辐射产生大量ROS (Kottuparambila等
2012), 若不及时清除, ROS便会攻击蛋白质、核
酸、脂类等生物大分子, 引起氧化损伤, 进而导致
细胞及组织死亡。植物叶绿体是活性氧产生的主
要部位(Lim等2007)。叶绿体中活性氧的有效清除
是保证植物光合作用的正常进行、促进植物生长
发育先决条件。植物体主要依赖核内COP1、UVR
蛋白的积累作为信号诱导基因表达, 在低水平的
UV-B辐射下, 还可以快速产生COP1-UVR复合体
(Rizzini等2011), 促使植物通过酶促及非酶促的反
应清除ROS (Oravecz 等2006; Kaiserli和Jenkins
2007)。抗坏血酸作为叶绿体中最主要的水溶性抗
氧化物质, 可以直接清除多种自由基(Mano等1997)。
此外, AsA还有助于维持APX活性(Mano等2001),
它可以作为APX的电子供体清除H2O2。本实验中,
转基因株系能维持更高的APX、SOD活性 (图
8-A、B)。因此, 转基因株系中的H2O2和超氧阴离
子的含量也较低。另外, 转基因株系具有较低的
丙二醛含量及相对电导率。过表达LeMDAR能维
持较高水平的AsA含量, 从而维持高水平的APX活
性, 降低体内ROS水平及其对细胞膜的损伤。
综上所述, 过表达番茄LeMDAR能明显提高转
基因植株的AsA含量、APX酶活性, 降低UV-B胁
迫对光合机构的破坏及ROS水平, 从而提高其对
UV-B胁迫的抗性。推测可能是紫外作为逆境信号
通过信号转导诱导基因的表达 , 增加MDAR酶
及其他酶活性, 促进AsA的再生及抗氧化物质的
生成。
参考文献
赵世杰, 史国安, 董新纯(2002). 植物生理学实验指导. 北京: 中国
图8 UV-B处理对野生型和转基因番茄叶片SOD (A)及APX
(B)活性的影响
Fig.8 Effect of UV-B treatment on activities of SOD (A) and
APX (B) in leaves of WT tomato and transgenic plants
王玉等: 过表达单脱氢抗坏血酸还原酶基因提高番茄抗UV-B胁迫能力 103
农业科学技术出版社, 130~131
王爱国, 罗广华(1990). 植物的超氧物自由基与羟胺反应的定量关
系. 植物生理学报, 6: 55~57
Asada K (1999). The water-water cycle in chloroplasts: scavenging
of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu Rev
Plant Physiol Plant Mol Biol, 50: 601~639
Bartoli CG, Pastori GM, Foyer CH (2000). Ascorbate biosynthesis in
mitoehondria is linked to the electron transport chain between
complexes III and IV. Plant Physiol, 123: 335~343
Damian DP, Lunde C, Lahnstein J, Fincher GB (2007). Heterologous
expression of cDNAs encoding monodehydroascorbate
reductases from the moss, Physcomitrella patens and
characterization of the expressed enzymes. Planta, 225: 945~954
Eastmond PJ (2007). Monodehyroascorbate reductase4 is required
for seed storage oil hydrolysis and postgerminative growth in
Arabidopsis. Plant Cell, 19 (4): 1376~1387
Eltaye AE, Kawano N, Badawi GH, Kaminaka H, Sanekata T,
Shibahara T, Inanaga S, Tanaka K (2007). Overexpression of
monodehydroascorbate reductase in transgenic tobacco confers
enhanced tolerance to ozone, salt and polyethylene glycol
stresses. Planta, 225: 1255~1264
Ferguson IB, Watkins CB, Harman JE (1983). Inhibition by calcium
of senescence of detached cucumber cotyledons. Plant Physiol,
71 (9): 182~186
Gao Q, Zhang LX (2008). Ultraviolet-B-induced oxidative stress and
antioxidant defense system responses in ascorbate-deficient vtc1
mutants of Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol, 168: 138~148
Han H, Gao S, Li B, Dong XC, Feng HL, Meng QW (2010).
Overexpression of violaxanthin de-epoxidase gene alleviates
photoinhibition of PSII and PSI in tomato during high light and
chilling stress. J Plant Physiol, 167: 176~183
He JM, Ma XG, Zhang Y, Sun TF, Xu FF, Chen YP, Liu X, Yue M
(2013). Role and interrelationship of Gab protein, hydrogen
peroxide, and nitric oxide in ultraviolet B-induced stomata
closure in Arabidopsis leaves. Plant Physiol, 161: 1570~1583
Hideg E, Jansen MAK, Strid A (2012). UV-B exposure, ROS, and
stress: inseparable companions or loosely linked associates?
Trends in Plant Sci, 18 (2): 107~115
Horemans N, Foyer CH, Potters G, Asard H (2000). Ascorbate
function and associated transport systems in plants. Plant Physiol
Biochem, 38: 531~540
Hossain MA, Nakano Y, Asada K (1984). Monodehydroascorbate
reductase in spinach chloroplasts and its participation in
regeneration of ascorbate for scavenging hydrogen peroxide.
Plant Cell Physiol, 25 (3): 385~395
Jansena MAK, Bornmanb JF (2012). UV-B radiation: from generic
stressor to specific regulator. Physiol Plant, 145: 501~504
Kaiserli E, Jenkins GI (2007). UV-B Promotes rapid nuclear
translocation of the Arabidopsis UV-B–specific signaling
component UVR8 and activates its function in the nucleus. Plant
Cell, 19: 2662~2673
Kampfenkel K, Vanmontagu M, Inzé D (1995). Extraction and
determination of ascorbate and dehydroascorbate from plant
tissue. Ann Biochem, 225 (1): 165~167
Kooten OV, Snel JFH (1990). The use of chlorophyll fluorescence
nomenclature in plant stress physiology. Photosynth Res, 25:
147~150
Kottuparambila S, Shinb W, Brownc MT, Hana T (2012). UV-B
affects photosynthesis, ROS production and motility of the
freshwater flagellate, Euglena agilis Carter. Aquatic Toxicol,
122: 206~213
Leterrier M, Corpas FJ, Barroso JB, Sandalio LM, del Río LA (2005).
Peroxisomal monodehydroascorbate reductase. genomic clone
characterization and functional analysis under environmental
stress conditions. Plant Physiol, 138: 2111~2123
Li F, Wu QY, Sun YL, Wang LY, Yang XH, Meng QW (2010).
Overexpression of chloroplastic monodehydroascorbate
reductase enhanced tolerance to temperature and methylviologen-
mediated oxidative stresses. Physiol Plant, 139: 421~434
Lim S, Kim YH, Kim SH, Kwon SY, Lee HS, Kim JS, Cho KW,
Pack KY, Kwak SS (2007). Enhanced tolerance of transgenic
sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in
chloroplasts to methyl viologen-mediated oxidative stress and
chilling. Mol Breed, 19: 227~239
Mano J, Ohno C, Domae Y, Asada K (2001). Chloroplastic ascorbate
peroxidase is the primary target of methylviologen-induced
photooxidative stress in spinach leaves: its relevance to
monodehydroascorbate radical detected with in vivo ESR.
Biochim Biophys Acta, 1504: 276~288
Mano J, Ushimaru T, Asada K (1997). Ascorbate in thylakoid lumen
as an endogenous electron donor to photosystem II: protection
of thylakoids from photoinhibition and regeneration of ascorbate
in stroma by dehydroascorbate reductase. Photosynth Res, 53:
197~204
Mishra NP, Mishra PK, Singhal GS (1993). Changes in the activities
of antioxidant enzyme during exposure of intact wheat leaves to
strong visible light at different temperatures in the presence of
protein synthesis inhibitors. Plant Physiol, 102 (3): 903~910
Mittler R (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance.
Trends Plant Sci, 7: 405~410
Mittova V, Guy M, Tal M, Volokita M (2002). Response of the
cultivated tomato and its wild salt-toler ant relative Lycopersicon
pennellii to salt-dependent oxidative stress: increased activities
of antioxidant enzymes in root plastids. Free Rad Res, 36:
195~202
Muller-Moule P, Golan T, Niyogi KK (2004). Ascorbate-deficient
mutants of Arabidopsis grow in high light despite chronic
photooxidative stress. Plant Physiol, 134: 1163~1172
Noctor G, Foyer CH (1998). Ascorbate and glutathione: keeping
active oxygen under control. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol
Biol, 49: 249~279
Oravecz A, Baumann A, Máté Z, Brzezinska A, Molinier J, Edward
JO, Ádám, ESchäfer E, Nagy F, Ulma R (2006). Constitutively
photomorphogenic is required for the UV-B response in
Arabidopsis. Plant Cell, 18: 1975~1990
Polle A (2001). Dissecting the superoxide dismutase-ascorbate-
glutathione-pathway in chloroplasts by metabolic modeling.
Computer simulations as a step towards flux analysis. Plant
植物生理学报104
Physiol, 126: 445~462
Rizzini L, Favory JJ, Cloix C, Faggionato D, O’Hara A, Kaiserli E,
Baumeister R, Schäfer E, Nagy F, Jenkins GI, Ulm R (2011).
Perception of UV-B by the Arabidopsis UVR8 protein. Science,
332 (6025): 103~106
Sakihama Y, Mano J, Sano S, Asada K, Yamasaki H (2000). Reduction
of phenoxyl radicals mediated by monodehydroascorbate
reductase. Biochem Bioph Res Co, 279: 949~954
Smirnoff N (2000). Ascorbate biosynthesis and function in
photoprotection. Phil Trans R Soc Lond B, 355: 1455~1464
Sun YL, Li F, Sui N, Sun XL, Zhao SJ, Meng QW (2010). The
increase in unsaturation of fatty acids of phosphatidylglycerol
in thylakoid membrane enhanced salt tolerance in tomato.
Photosynthetica, 48 (3): 321~480
Takahashi S, Murata N (2008). How do environmental stresses
accelerate photoinhibition? Trends Plant Sci, 13 (4): 1360~1385
Vass I, Turcsanyi E, Touloupakis E, Ghanotikis D, Petrouleas V
(2002). The mechanism of UV-A radiation-induced inhibition
of photosystem II electron transport studied by EPR and
chlorophyll fluorescence. Biochemistry, 41: 10200~10208