全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 791
收稿 2009-05-03 修定 　2009-06-23
资助 国家 “863”计划(2002AA629080)和国家烟草专卖局重
点项目(1 102 000 010 11A)。
* 通讯作者(E-mail: liuweiqun2004@126.com; Tel: 0371-
6 3 5 5 5 1 5 3 )。
过量表达腺苷甲硫氨酸合成酶基因能提高转基因烟草中多聚胺的生物合成
戚元成 1,2, 马雷 1, 王菲菲 2, 刘卫群 1,2,*
河南农业大学 1烟草学院, 2生命科学学院, 郑州 450002
提要: 以土壤农杆菌介导的转化方法将盐地碱蓬的腺苷甲硫氨酸合成酶 cDNA (SsSAMS2)转化到烟草K326中。PCR分析
的结果表明, SsSAMS2整合进K326的基因组内。共筛选到 8个转基因纯合品系, 分析其中 3个品系(ST8-9、ST14-2、ST3-
5)基因表达和多聚胺含量的结果表明, SsSAMS2可在转基因烟草中表达, 转基因烟草中的多聚胺含量明显高于野生型烟草。
这些结果表明, 腺苷甲硫氨酸合成酶基因已在转基因烟草中过量表达并导致多聚胺含量提高。
关键词: 腺苷甲硫氨酸合成酶; 多聚胺; 转基因烟草
Overexpression of S-adenosylmethionine Synthetase Promote Polyamine Bio-
synthesis in Transgenic Tobacco
QI Yuan-Cheng1,2, MA Lei1, WANG Fei-Fei2, LIU Wei-Qun1,2,*
1College of Tobacco Science, 2College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The full-length S-adenosylmethionine synthetase (SsSAMS2) of Suadea salsa was introduced into
tobacco (Nicotiana tabacum L. K326) by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The gene inte-
gration in tobacco was confirmed by PCR. Eight homozygous transgenic lines (ST lines) were screened. The
result of SsSAMS2 expression and polyamines (PAs) content analysis of three lines (ST8-9, ST14-2, ST3-5)
showed that SsSAMS2 expressed in transgenic tobacco, and transgenic tobacco accumulated more soluble total
PAs content than wild-type plants. These results indicated that the promotion of soluble total PAs content
resulted from the SsSAMS2 overexpression in transgenic plants.
Key words: S-adenosylmethionine synthetase; polyamine; transgenic tobacco
腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine
synthetase, SAMS)可催化底物ATP和蛋氨酸生成
腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM) (Cantoni
1953)。腺苷甲硫氨酸合成酶是一个广泛存在并且
相当保守的酶(Thomas和 Surdin-kerjan 1991)。拟
南芥(Peleman 等 1989)、水稻(Van Breusegem等
1994)、番茄(Espartero等 1994)等植物中的腺苷甲
硫氨酸合成酶基因已经得到克隆。腺苷甲硫氨酸
合成酶在一些植物[如在拟南芥的根和茎等器官的
微观组织(Peleman等 1989)、水稻的叶片(Dekeyser
等 1990)]中的表达模式早就有报道。腺苷甲硫氨
酸是腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine
decarboxylase, SAMDC)的底物, 脱羧基后的腺苷甲
硫氨酸在多聚胺(polyamine, PA)的生物合成过程中
提供氨丙基(Chiang等 1996)。我们克隆到一个腺
苷甲硫氨酸合成酶基因(SsSAMS2) (GenBank 登录
号AF321001) (Ma等 2003)。本文转化和筛选得到
转SsSAMS2的烟草品系, 并研究其过量表达能否增
加多聚胺的生物合成, 而多聚胺是渗透保护物质, 所
以也为我们以后研究腺苷甲硫氨酸合成酶过量表达
能否增强植物抗盐胁迫的能力建立了基础。
材料与方法
将 SsSAMS2克隆到 35S启动子控制下的植物
双元表达载体prok2中, 命名为pSAMS。用pSAMS
转化土壤农杆菌GV3101, 得到阳性土壤农杆菌转
化株 G V 3 1 0 1 - S A M S , 并以此菌来转化烟草
(Nicotiana tabacum L. K326)。
将烟草在MS培养基上无菌培养 3周后, 取无
菌烟草苗的幼嫩、健壮叶片, 用打孔器制备叶圆
盘, 然后将叶圆盘和土壤农杆菌GV3101-SAMS共
培养。转化植株的再生和培养按照 H o r s c h 等
(1985)的步骤进行, 转化植株纯合子的筛选和培养
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按照Koo等(2002)的方法进行。用于表达分析的
T2代放在 14 h (光照)/10 h (黑暗), 光照度为 100
μmol·m-2·s-1、室温为(25±5) ℃的条件下培养。
为了用PCR分析SsSAMS2整合情况, 采用Ma
等(2003)文中的方法提取转基因和野生型烟草中的
基因组DNA。正向引物用 35S启动子上的序列设
计35S-F (5 GTCTTGCGAAGGATAGTGG 3)和反
向引物 SsSAMS2 -R (5 ATACTCAACAGTGAC-
TTGAG 3)。重组质粒 pSAMS作阳性对照, 以水
作为空白对照, DNA聚合酶是 Taqr。
采用Trizol试剂盒提取T2代转基因烟草和野
生型烟草叶中的总RNA, 用RT-PCR 分析SsSAMS2
的表达情况。RT-PCR反应按照说明书(One Step
RT-PCR kit; Takara, Shiga, Japan)进行。18S rRNA
作反应内参, 引物为18S-F (5 ATGATAACTCGACG-
GATCGC 3)和 8S-R (5 CTTGGATGTGGTAGCC-
GTTT 3)。SsSAMS2扩增引物是 SsSAMS2-F (5
TCTGAGTCTGTGAATGAAGG 3)和 SsSAMS2-R
(5 ATGTAGGCACCACTTCTGTC 3)。反应体系
为50 μL, 反应条件为94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s和72 ℃
1 min, 20个循环。取 15 μL反应产物, 并以 1%琼
脂糖凝胶作电泳分析。
为了Northern杂交进一步分析 SsSAMS2的表
达情况, 提取 T2代转基因烟草和野生型烟草的总
RNA, 依据 Sambrook等(2001)文中的步骤转膜, 32P
dCTP随机标记 SsSAMS2和 18S rDNA做探针。探
针标记和杂交步骤参照(戚元成等 2004)。
T2代转基因品系和野生型烟草幼苗长至6 cm
左右时, 转移到盛有蛭石、腐殖质和草皮(1:1:1)的
盆中, 在温室中培养 4周, 期间用 1/2Hoagland营养
液培养, 用上部伸展的烟叶测定多聚胺含量。取
0.3 g叶片于2 mL 5%的HClO4溶液中研磨均匀, 后
以 12 000×g离心 30 min。取 0.2 mL上清液, 然后
加入 0.2 mL的Na2CO3溶液和 0.4 mL的丹磺酰氯
(C12H12ClNO2S) (浓度为mg·mL-1 丙酮), 混合液放在
60 ℃中温育 1.5 h。多聚胺含量测定依照 Goren
等(1982)文中的方法进行。
实验结果
1 转基因烟草品系的获得和分析
用土壤农杆菌介导的转化方法, 筛选到 15个
抗卡那霉素的转基因品系, 并初步用PCR方法得到
了验证。进一步筛选得到 8个转基因品系的纯合
子, 其中 ST8-9、ST14-2和 ST3-5 3个转基因纯
合子品系用于基因表达分析和生理指标测定。为
了保证 SsSAMS2 基因的稳定整合和传递, 又进一
步用 PCR验证的结果显示, 在 ST8-9、ST14-2和
ST3-5 3个转基因品系中有目的条带, 而野生型植
株则没有(图 1)。为了验证SsSAMS2基因在转基因
烟草品系的表达, 同时作 RT-PCR和Northern杂交
的结果(图2和图3)显示, 在转基因烟草中扩增出目
的片段, 而野生型烟草则没有; 在转基因烟草中有
杂交信号, 而野生型烟草则没有。这些都表明,
图 1 SsSAMS2在转基因烟草中整合的 PCR分析
Fig.1 PCR analysis of SsSAMS2 integration
in transgenic tobacco
1: DNA分子标记DL2000; 2: ST8-9; 3: ST14-2; 4: ST3-5;
5: 野生型; 6: pSAMS; 7: H2O。
图 2 SsSAMS2在转基因烟草中表达的RT-PCR分析
Fig.2 RT-PCR analysis of SsSAMS2 expression
in transgenic tobacco
1: DNA分子标记DL2000; 2: H2O; 3: 野生型; 4: ST8-9; 5:
ST14-2; 6 : ST3-5。
图 3 SsSAMS2在转基因烟草中表达的Northern杂交分析
Fig.3 Northern blotting analysis of SsSAMS2 expression
in transgenic tobacco
1: 野生型; 2: 野生型; 3: ST8-9; 4: ST14-2; 5: ST3-5。
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SsSAMS2基因在转基因烟草中已稳定表达。
2 转基因烟草中多聚胺的积累
图4 显示, 转基因品系中的多聚胺含量显著高
于野生型植株, 这些与上述结果(图 2和图 3)一致。
表明 SsSAMS2的过量表达后多聚胺的生物合成在
一定程度上有增加。
图 4 转基因和野生型烟草中自由多聚胺含量的比较
Fig.4 Comparision on free PA contents
in transgenic and wild tobacco
每个系列 1 0 个重复，数据用平均数±标准误表示。柱状
图上不同字母表示 0 .0 5 水平上的差异显著性。
讨　　论
多聚胺的积累在一定程度上是由于参与多聚胺
生物合成途径的酶类表达所致(Mo和 Pua 2002)。
本文的结果显示, 转基因烟草过量表达SsSAMS2可
导致较高水平的多聚胺生物合成。SAMS不是直
接参与多聚胺生物合成的酶, 但它可以合成 SAM,
即多聚胺生物合成过程中所需要的 SAMDC前体
物。所以很有可能是由于 SsSAMS2的过量表达导
致了SAM的大量积累, 从而促进SAMDC的大量合
成, 因此转基因品系积累的多聚胺比野生型烟草高。
多聚胺是一类低分子量的渗透保护物质, 它在
一定程度上可以缓解逆境对植物的伤害(Yamaguchi
等2006)。我们下一步将研究盐胁迫下转基因烟草
品系的耐盐性。
参考文献
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