全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月 233
番茄转化酶抑制子基因克隆及其表达分析
姜晶 *, 李冬妮, 孙威
沈阳农业大学园艺学院, 辽宁省设施园艺重点实验室, 沈阳 110161
提要: 从普通栽培型番茄品种 ‘桃太郎 ’、野生醋栗番茄和潘那利番茄的幼苗中采用RT-PCR方法, 扩增出转化酶抑制子基
因 cDNA序列的部分片段。经测序表明: 不同基因型番茄的转化酶抑制子基因同源性高达 97.97%以上。采用半定量RT-
PCR方法对 ‘桃太郎 ’苗期根、茎、叶和花后功能叶、花期子房以及果实不同发育阶段不同部位的表达进行检测, 结果表
明: INH 在根中表达较弱, 茎中有强烈表达, 从幼叶到衰老叶表达逐渐减弱; 同一时期INH在果肉中表达相对较强, 维管束次
之, 胶质胎座相对较弱; 花期子房中 INH的表达逐渐增强, 花后3 d左右达到最大, 花后5~8 d表达量迅速下降。
关键词: 番茄; 转化酶抑制子; RT-PCR; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of Invertase Inhibitor Gene (INH) from To-
mato (Lycopersicon esculentum Mill.)
JIANG Jing*, LI Dong-Ni, SUN Wei
College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Liaoning Key Laboratory of Protected Horticulture, Shenyang 110161,
China
Abstract: The cDNA fragments of invertase inhibitor were obtained by RT-PCR from different genotype to-
mato ‘Momotaro’, Lycopersicon pimpinellifolium and Lycopersicon pennellii. These sequences showed highly
homology (above 97.97%) to the published sequences of INH respectively. The expression patterns of the
cDNAs were examined in ‘Momotaro’ various tissues during different stages by semi-quantitative RT-PCR. The
results showed that INH gene expressed lowly in roots, significantly highly in stem and decreased from young
leaves to senescent leaves. The expression of INH gene in sarcocarp was the highest relatively, which in fruit
vascular was secondary and in pectinic placenta was weak. The expression of INH gene increased in ovaries of
inflorescence stage, and was highest on the 3rd day after anthesis, then rapidly decreased from 5 to 8 days after
anthesis.
Key words: tomato (Lycopersicon esculentum); invertase inhibitor; RT-PCR; gene expression
收稿 2008-11-06 修定 2009-01-14
资助 辽宁省教育厅科学研究技术计划(0 5 L4 1 2 )。
* E-ma il : j j_ syau @hotmai l. com; Tel: 0 24 -88487143
酸性转化酶对调节植物韧皮部糖的卸载、控
制贮藏器官中糖的组成、参与植物对逆境胁迫的
响应、影响植物早期生长发育以及植物体中信号
转导都有作用(Smeekens 2000)。因此通过改变转
化酶活性来调控碳水化合物的代谢与分配, 进而特
异地改变植物的生长和发育模式有一定的意义。
但转化酶都是多糖修饰的非常稳定的酶, 所以它们
的活性沉默要依赖于翻译后调控(Haruki 2002), 而
内源蛋白抑制子的调节是植物酸性转化酶翻译后调
节的一个方面, 因而受到人们的关注。蛋白抑制子
(protein inhibitor)存在于植物发育的特定阶段, 它在
植物中并非广泛存在, 其作用似乎只限于酸性转化
酶(Sander等 1996; 孙威和姜晶 2008)。
迄今, 大规模测序项目使植物序列信息得到迅
速积累, 并已证实植物转化酶抑制子( invertase
inhibitor, INH)蛋白的普遍存在(Bracho和Whitaker
1990; Pressey 1994; Greiner等 1998; Bate等 2004),
但对其基因的克隆及生理作用的阐述还只是刚开
始。不同作物 INH异位过量表达已揭示这些蛋白
的生物技术潜能, 例如马铃薯块茎低温糖化的抑制
(Greiner等1999; 成善汉等2007)以及甜菜采后蔗糖
的稳定性(Vukov和Hangyal 1985); 在烟草中已初
步获得了正义和反义抑制子转基因植株(Greiner等
1999; Zrenner等 1996), 但还有很多生理功能问题
尚未解决。目前, 有关番茄 INH的研究主要集中
在纯化和分析其蛋白二级结构上, 而其基因的克隆
和表达的分析尚未见报道。本文采用 INH基因的
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克隆和分析技术, 探明其在番茄植株发育过程中的
表达模式, 为进一步用转基因技术探讨该基因在番
茄蔗糖代谢中分子生物学机制建立基础资料。
材料与方法
试材为番茄(Lycopersicon esculontum Mill.)栽
培品种 ‘ 桃太郎 ’(‘Momotaro’)、野生醋栗番茄
(Lycopersicon pimpinellifolium)和潘那利番茄
(Lycopersicon pennellii)。分别取 0.1 g嫩叶, 按组
织 /Trizol试剂(Invitrogen公司)为 50~100 mg·mL-1
提取总 RNA, 用于转化酶抑制子基因片段克隆。
当番茄品种 ‘桃太郎 ’幼苗长到四叶一心时, 一部
分直接取根、茎和叶; 另一部分定植。然后选长
势一致的番茄, 在第一花序第一花开后 10、45 d
取花下第一片叶; 花后 10、15、20、35、45、
55 d, 取果实的果肉、果实维管束和胶质胎座; 取
花前 12 d、花前 8 d和花后 0、3、8 d的子房。
立即置于液氮中, 用于总 RNA提取。3株混合算
为 1次重复, 每处理每次重复取样 3次。
根据GenBank中所登录番茄INH基因的cDNA
序列(登录号AJ010943), 利用DNAMAN 5.0软件
进行引物设计, 正向引物 INHE-F: 5 TGTTTCTT-
GCTATGTTGC 3, 反向引物 INHE-R: 5 TCTTA-
CAATGGCTCTACC 3, 委托上海生工生物工程有限
公司合成。
以提取的 RNA 为模板按 Fermenta 试剂盒
(TaKaRa公司)进行反转录合成cDNA, 之后向反应
体系中加入 2 µL模板 cDNA、2 µL 10×Taq缓冲
液(含Mg2+)、各 2 µL INH正向和反向引物、0.5
µL 10 mmol·L-1 dNTP、0.5 µL Taq DNA聚合酶,
加水至 20 µL。反应参数为为 94 ℃ 预变性 5 min;
94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 40个循环; 72 ℃
延伸 10 min。
PCR产物克隆和分析序列时, PCR产物用
0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 目的DNA片段利用
DNA片段纯化回收试剂盒(TianGen公司)回收后与
载体 pBS-T (TianGen公司)连接, 转化大肠杆菌
DH5α感受态细胞(TaKaRa公司)。用质粒提取试
剂盒(TianGen公司)提取质粒, 以质粒DNA为模板
进行PCR鉴定, 委托上海生工生物工程有限公司测
定DNA序列。采用DNAMAN 5.0软件进行序列
分析。
半定量 RT-PCR分析时, 将 ‘桃太郎 ’不同处
理的总 RNA样品经DNase I (Sigma公司)于 37 ℃
处理 30 min, 以去除DNA。mRNA半定量RT-PCR
操作参考 Fridman和 Zamir (2003)的方法进行。然
后用分光光度计测定OD值, 稀释到相同浓度, 做
为 RT-PCR模板。在反应体系中加入 0.5 µL模板
cDNA、1 µL 10×Taq缓冲液(含Mg2+)、各 0.5 µL
INH 正向和反向引物、各 0.5 µL内标基因Actin的
扩增引物(内标基因引物: 5 AGCAACTGGGATG-
ATATGG 3和 5 ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT
3)、0.15 µL 10 mmol·L-1 dNTP、0.1 µL Taq DNA
聚合酶, 加水至 10 µL。内标引物和特异引物分别
扩增, 反应条件为94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30
s、72 ℃ 1 min, 前者为 25个循环, 后者为 35个循
环; 72 ℃延伸 10 min。PCR产物用 1.2%的琼脂糖
凝胶电泳检测。所有的 RT-PCR实验重复 3次。
实验结果
1 不同品种番茄 INH基因的克隆与序列比对分析
以不同番茄总 RNA为模板, 进行 RT-PCR 扩
增, 扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 均扩增
得到预期大小的长为 479 bp的 INH的 cDNA片段
(图 1), 经回收纯化后与载体 pBS-T连接, 转化大肠
杆菌 DH5α。蓝白斑筛选, 挑取白斑克隆提取质
粒。以特异引物进行 PCR扩增, 得到与预期大小
相吻合的DNA片段(图2), 这表明PCR产物已克隆
到载体上。将鉴定为阳性的克隆进一步进行测
序。
将不同品种番茄的同一序列在DNAMAN 5.0
中进行多序列比对。结果(图 3)表明: 不同品种番
茄 INH基因的同源性高达 97.97%以上; 与烟草细
胞壁、烟草液泡、马铃薯、拟南芥 INH 基因的
图 1 番茄 INH基因的RT-PCR产物电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis pattern of RT-PCR
products of INH gene in tomato
M: DNA分子标记DL 2000; a: ‘桃太郎 ’; b: 醋栗番茄; c: 潘
那利番茄。
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同源性分别为 81.31% (GenBank登录号Y12805)、
50.33% (GenBank登录号 Y12806)、34.29%
(GenBank登录号AF459079)、43.75% (GenBank登
录号Y12807)。
2 INH基因组织特异性表达分析
2.1 INH基因在番茄根、茎和叶中的表达 结果如
图 4所示, INH在苗期(四叶一心时期)根中的表达
量极其微弱, 而在茎部表达强烈, 在叶片部的表达
程度介于前两者之间。随着植株生长, 幼叶转变成
功能叶片(源叶), 与苗期相比, INH在花期叶片花
后 10 d的表达明显减弱。进入成熟期, 功能叶片
(源叶)逐渐衰老, 在花后45 d的衰老的功能叶片中,
INH的表达量继续减弱。
2.2 INH基因在番茄花期子房中的表达 从图 5可
以看出, INH表达程度在花期子房中有显著差异。
现蕾初期(花前12 d), 子房中INH基因表达微弱, 随
着花朵逐渐盛开(花前 8 d至花后 0 d)表达量迅速
增强。待到花后 3 d, INH表达量达到最大; 花后 8
d花瓣凋谢, 表达量也降低到最低水平。
2.3 INH基因在番茄果实中表达 结果(图 6)显示,
INH基因在花后10~15 d的果肉和维管束组织中高
水平表达, 随着发育进行, 各个部位的表达程度逐
渐下降, 但总体上仍保持在较高水平。花后 45 d
各部位表达量有所回升, 之后在花后55 d骤降到较
低水平。在果实发育过程中, 同一时期各个部位的
INH表达差异不太显著, 从图中数值可以看出, 果
肉中表达相对较强, 维管束次之, 胶质胎座相对较
弱。
讨　　论
将不同番茄 INH基因的 cDNA序列进行比对,
显示出较高同源性, 说明其在番茄中是高度保守
的。而不同物种 INH的 cDNA序列对比结果均显
示较低同源性, 例如: 与烟草(Y12806)、马铃薯
(AF459079)和拟南芥的(Y12807)同源性分别为
50.33%、34.29%和 43.75%。说明在进化过程中
抑制子基因的变异较大, 因而很难通过序列比较来
鉴定不同物种抑制子的功能(Rausch和 Greiner
2004)。
己糖/蔗糖比值的意义与INH的作用在番茄生
长发育过程中都得到充分体现, 己糖 /蔗糖比值变
化好似转导信号起引起 INH发挥作用(Rolland等
2002)。INH在快速膨大期(花后 0~35 d)呈现较高
表达。此时为产量形成期, 果实快速生长, 蔗糖进
入果肉细胞时是不分解的, 直接经过共质体进行运
输, 迅速合成为淀粉或被分解用于功能和组织构建
(齐红岩等2005), 因此这段时期内番茄果实没有积
累大量的果糖。随后进入绿熟期, INH表达稍微减
弱, 果实膨大速率减慢。此时也正是番茄果实品质
形成期, 蔗糖降解增大, 形成大量的以积累果糖为
主的可溶性糖。虽然转色阶段(花后 45 d) INH 表
达增强, 但胶质胎座的酸性转化酶活性也明显增大
(刘以前等 2006), 总体上还原糖含量还会大量增
加。在完熟期虽然 INH表达急剧下降, 但蔗糖继
续在转化酶的催化下转化成果糖和葡萄糖(刘以前
等2006), 己糖/还原糖的比值依据品种不同而有差
异。
番茄的果肉、维管束和胶质胎座中 INH表达
量的依次减弱, 说明蔗糖是依本身浓度梯度而运输
的(齐红岩等 2005)。在番茄果实维管束系统中, 光
合产物主要以蔗糖的形式运输, 从维管束系统卸载
到果实胶状物质后, 分解成为果糖和葡萄糖。INH
在维管束中的大量表达, 是蔗糖在维管束不受降解
的主要原因。另外在库器官(果实)的非维管组织
中较弱表达, 有利于蔗糖的分解, 形成葡萄糖和果
糖, 并形成源和库之间的蔗糖浓度梯度, 促进蔗糖
的卸载。而茎中 INH的强烈表达, 也同样可以确
保蔗糖在运转过程中很少被分解。
随着叶片的衰老, INH表达逐渐减弱。表明
在番茄叶片发育早期, 蔗糖以输入为主, INH较高
程度的表达可抑制转化酶活性, 从而保证蔗糖在一
定程度上可不被降解, 从而有利于有机物的吸收, 并
迅速形成叶片自身的结构, 而成为功能叶。同样是
功能叶片, 在衰老叶片中的 INH表达相对更弱。这
图 2 番茄 INH基因的质粒 PCR产物电泳图谱
Fig.2 Electrophoresis pattern of plasmid PCR
products of INH gene in tomato
M: DNA分子标记DL 2000; a: ‘桃太郎 ’; b: 醋栗番茄; c: 潘
那利番茄。
植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月236
可能是因为幼嫩的功能叶片利用本身合成的蔗糖运
输, 所以 INH有较高水平的表达, 而在叶片后期老
化过程中, 则快速降解叶片本身合成的物质。从现
蕾到花后 3 d (花前 12 d~花后 3 d), 子房中 INH的
图 3 番茄与其它植物 INH cDNA部分序列的同源性比较
Fig.3 Homology comparison of INH cDNA sequences in tomato and other plants
GenBank登录号分别为 AJ010943 (番茄)、Y12805 (烟草细胞壁)、Y12806 (烟草液泡)、AF459079 (马铃薯)和 Y12807 (拟
南芥 ) 。
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图 6 半定量RT-PCR分析 INH基因在番茄果实发育过程中不同部位的转录
Fig.6 Semi-quantitative RT-PCR analysis of INH gene transcripts in different parts of tomato fruits during development stage
a: 果肉; b: 果实维管束; c: 胶质胎座。
表达逐渐增强, 芽体得到更多的蔗糖供给, 花芽分
化受到促进, 于是成花率提高。而开花授粉后, 高
水平的蔗糖含量是保证子房细胞分裂数增加的物质
基础。之后, 花瓣凋谢, 子房膨大, 子房中 INH表
达迅速下降, 与其相关的生理机制之所以还不清楚,
推测可能与果实发育有密切联系。至于转化酶抑
制子基因在番茄植株生长尤其是在果实发育过程中
的调控作用及其功能, 尚需用转基因技术加以研究。
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图 4 半定量RT-PCR分析 INH基因在
番茄根、茎和叶中的转录
Fig.4 Semi-quantitative RT-PCR analysis of INH
genes transcript in roots, stems, leaves of tomato
图 5 半定量RT-PCR分析 INH基因在番茄子房中的转录
Fig.5 Semi-quantitative RT-PCR analysis of INH genes
transcript in ovaries of tomato
植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月238
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