全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月 1051
收稿 2009-09-09 修定 　2009-10-26
资助 上海市科委项目(0 83 919 118 00 )。
* 通讯作者(E-mail: kxtang1@163.com; Tel: 021-65643552)。
喜树碱的生物合成途径和代谢调控
皮妍 1, 蒋科技 2, 乔守怡 1, 唐克轩 1,*
1复旦大学生命科学学院, 上海 200433; 2中国水产科学研究院东海水产研究所, 上海 200090
Biosynthesis Pathway and Metabolic Regulation of Camptothecin
PI Yan1, JIANG Ke-Ji2, QIAO Shou-Yi1, TANG Ke-Xuan1,*
1School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China; 2East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese
Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China
提要: 喜树碱是一种具有抗肿瘤活性的萜类吲哚生物碱, 最早是从我国特有植物喜树中分离获得的。本文概述喜树碱的天
然分布合成途径和代谢调控的研究进展, 并对喜树碱未来的生产和发展研究作了展望。
关键词: 喜树碱; 生物合成; 代谢工程
专论与综述 Review
生物碱一般指来源于生物体内的分子结构中
含有氮原子的有机化合物, 但迄今为止还没有严格
的定义, 本文中指的是含有氮原子的植物次生代谢
产物。现在大约有100 000种生物碱的化学结构是
已知的, 其中一部分在植物体内起植保素或植物内
生的抗虫化合物的作用, 有一些则是长期作为刺激
性物质、麻醉镇静剂或毒药使用(van Der Heijden
等 2004; Sriram等 2005)。临床上采用的来自植物
的抗癌生物碱主要有喜树碱(camptothecin, CPT)、
紫杉醇(taxol)、长春碱(vinblastine)、长春新碱
(vincristine)等(Raskin等 2002)。喜树碱属于萜类
吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids, TIAs), 存在
于夹竹桃科(Apocynaceae) [以长春花(Catharanthus
roseus)为代表]、马钱科(Loganiaceae)、茜草科
(Rubiaceae)和蓝果树科(Nyssaceae) [以喜树
(Camptotheca acuminata)为代表]植物中, 是一大类
有药用价值的植物生物碱(Memelink等 2001)。
喜树碱最早于1966年Wall等从我国特有植物
喜树的木质部中分离获得, 后来又陆续在夹竹桃科
的海木狗牙花(Ervatamia heyneana)、茶茱萸科的
臭味假柴龙树(Nothapodytes foetida)以及茜草科的
短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)等植物中发现。喜
树碱抗癌机制独特, 是迄今为止发现的唯一的一种
专门通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性的天然植
物活性成分(Hsiang等 1985)。根据喜树碱和其他
次生代谢产物的分布, 可以推测, 在早期进化过程
中, 其合成途径中可能涉及到编码酶基因。这些基
因在进化过程中可能并没有丢失, 而只是在某个
特定时期是关闭的, 而在以后某个时间点又再次
开启。
从目前的研究情况和研究趋势来看, 喜树碱及
其类似物主要从喜树中分离获得(Sriram等 2005)。
作为喜树中的一种天然次生代谢产物, 喜树碱的产
量受到喜树生长发育和环境因素的影响, 而过去人
们一直致力于提取工艺和产品的开发, 后来随着喜
树碱市场的扩大, 生产喜树碱及其类似物所需的原
料即成为这一产业中的制约瓶颈。并且随着喜树
资源的逐渐枯竭, 亟需对喜树这一资源进行更深入
的研究。因此, 本文就喜树碱合成途径及与喜树碱
代谢有关的研究进展作简要介绍。
1 喜树碱的植物属种和在喜树体内的分布
植物的次生代谢产物彼此在进化上有很大的
相似性, 根据植物都产生或不产生某种次生代谢产
物的特性可以推断, 它们起源于共同的祖先, 彼此
有亲缘关系。从喜树碱分布的分子分类与被子植
物中的系统发生分类的比较中, 可以看到一个奇怪
的例外现象(Wink 2003)。这就是, 从一些无相关
种属关系的被子植物中也可以分离到多功能的
TIAs——喜树碱。它们分别属于卫矛目中的臭味假
柴龙树(Aiyama等 1988)、Pyrenacantha klaineana
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月1052
(Zhou等 2000)和Merrilliodendron megacarpum
(Arisawa等 1981), 山茱萸目中的喜树(Wallis等
1997)、洛氏喜树(Camptotheca lowreyana)和云南
喜树(Camptotheca yunnanensis) (Li等 2002), 龙胆
目中的蛇根草(Ophiorrhiza mungos) (Tafur等
1976)、短小蛇根草、Ophiorrhiza filistipula (Saito
等 2001)、海木狗牙花(Gunasekera 等 1979)和
Mostuea brunonis (Dai等 1999)。
喜树是我国特有的树种(中国科学院中国植物
志编辑委员会 1983), 属于蓝果树科喜树属多年生
亚热带落叶阔叶树, 别名有旱莲木、千丈树等, 喜
树属仅喜树 1个树种。自 20世纪 90年代以来, 美
国、日本、加拿大和英国等国家都积极投入大量
的人力和物力进行喜树引种和栽培的研究以及喜树
碱的开发, 喜树已成为继红豆杉(Taxus chinensis)之
后的第 2个重要的木本抗癌药用植物(Wallis等
1997)。至今, 已从喜树中分离出 20多种化学成分,
其中喜树碱及其类似物有8种, 它们的共同点是结
构中都具有 5 个环(图 1 中的 A、B、C、D、E
环), 包含一个吡咯[3,4-b]喹啉环, 一个共轭吡啶环
和一个 α-羟基六元内脂环。其中, 10-羟基喜树
碱(hydroxy-camptothecin, HCPT)是喜树碱分子的第
10位碳原子上的氢被羟基取代后的喜树碱的天然
衍生物, 来源于喜树的果实和叶, 也可由喜树碱通
过化学合成转化而来, 为黄色柱状结晶, 不溶于水,
微溶于有机溶剂, 具有蓝色荧光, 其钠盐溶于水。
10-羟基喜树碱同样也有显著的抗癌活性, 但比喜
树碱采用的剂量小、毒性轻、抗瘤广谱(Zhang等
1998; Ping等 2006)。
喜树碱终年分布在喜树各个部位, 从其变化的
整个水平来看, 根皮中的喜树碱变化幅度较大。在
不同组织器官中的喜树碱含量有较大差异, 不同的
研究结果也不一致, 这可能是由于采样时间、部位
和分析方法等引起的差异。过去一直认为果实中
的喜树碱含量最高, 根皮、树根及树皮中次之, 树
枝中含量较低。近年来有研究表明, 组织越幼嫩
的, 喜树碱含量越高, 枝(叶)龄越小的, 含量越高,
皮部较木质部含量高(Liu等 1998; 杨磊等 2008)。
王玲丽和刘文哲(2005)分析不同种源喜树幼枝中喜
树碱含量的结果表明, 喜树碱含量在叶、种子和幼
枝(幼叶和幼茎)中较高, 木质部中较少, 髓中最低。
两年树龄的喜树各器官中的喜树碱含量普遍比一年
树龄的高, 幼枝中顶枝的喜树碱含量比侧枝高。在
喜树果实中, 喜树碱含量由外向内(果皮、种皮、
胚)是逐渐增高的(杨磊等 2008)。也有研究表明,
未萌发的喜树种子的胚乳中喜树碱含量最高, 在种
子萌发的过程中, 胚乳中喜树碱含量始终最高, 但
呈波动下降趋势(张玉红等2002)。表1是喜树中喜
树碱及其天然衍生物 10-羟基喜树碱的含量分布。
植物幼嫩的叶片主要用于生产某些植物激素,
表 1 喜树中喜树碱和 10-羟基喜树碱的含量
组织和部位 样品来源 喜树碱含量 /μg·g-1 (DW) 10-羟基喜树碱含量 /μg·g-1 (DW) 参考文献
幼叶 Texas, USA 4 000~5 000 20~30 Lopez-Meyer等 1994
种子 Texas, USA 3 000 2 5 Lopez-Meyer等 1994
树皮 Texas, USA 1 800~2 000 2~90 Lopez-Meyer等 1994
根 Texas, USA 400 13~20 Lopez-Meyer等 1994
幼叶 Texas, USA 2 421~3 022 — Li等 2002
老叶 Texas, USA 482 — Li等 2002
幼嫩的果实 Texas, USA 842 — Li等 2002
成熟的果实 Texas, USA 2 362 — Li等 2002
发根 Texas, USA 1 000 150 Lorence等 2004
愈伤组织 上海 2 040~2 360 80~100 Wiedenfeld等 1997
细胞培养物 上海 2.5~4.0 — van Hengel等 1992
并作为光合作用的主要场所, 它们的营养丰富, 而
且在生理结构特征上也容易吸引食草动物和昆虫的
攻击, 许多植物都通过合成次生代谢产物来保护它
们的幼嫩组织。这可能就是喜树幼嫩的叶片中喜
树碱含量比成熟叶片中高 5~6倍及幼苗中喜树碱
含量处于高峰的生态原因(Lu和McKnight 1999;
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月 1053
Lorence和Nessler 2004)。也可认为这是幼嫩的叶
片和幼苗避免食草动物和致病菌袭击的一种化学防
御机制, 已经有一些现象显示喜树碱可能在植物防
御化学反应中起作用。在美国很少看到昆虫或致
病菌袭击栽培的喜树, 食用喜树叶片的山羊即会中
毒(Liu等 1998; Lorence和Nessler 2004)。喜树对
白蚁有一定的耐受性, 美国已有一项关于用喜树碱
和喜树碱类似物预防白蚁的专利(Li等 2002)。
2 喜树碱的生物合成途径和ORCA3 (octadecanoic-
responsive Catharanthus AP2-domain protein 3)
转录因子对喜树碱合成的代谢调控
萜类化合物是植物天然产物中最大的一类化
合物, 所有的天然萜类都来源于两个基本的五碳通
用前体: 异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate,
I P P )和二甲基烯丙基焦磷酸( d i m e t h y l a l l y l
diphosphate, DMAPP)。根据参与组成萜类五碳单
位前体数量的不同, 可以将萜类分为不同类型: 只
有一个五碳单位的半萜(5C), 2个五碳单位组成的
单萜(10C), 3个五碳单位的倍半萜(15C), 4个五碳
单位的二萜(20C), 6个五碳单位的三萜(30C), 以及
更多五碳单位的多萜等(Dewick 2002)。虽然植物
萜类都来源于 IPP和DMAPP, 但其生物合成则由
两条截然不同的途径完成: 一是经典的甲羟戊酸, 又
名甲瓦龙酸(mevalonate, MVA)途径, 另一是后来发
现的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose
5-phosphate, DXP)途径。这两条途径分别在不同的
亚细胞区域中进行: MVA途径位于细胞质中, DXP
途径位于质体中, 而且这两条途径所涉及到的基因
和酶也完全不同(Bick和 Lange 2003)。
2.1 喜树碱合成的上游途径及关键酶基因 在高等
植物中, MVA途径和DXP途径是同时存在并发挥
作用的(Lorence和Nessler 2004)。
2.1.1 萜类在细胞质中通过MVA途径生物合成 细
胞质中的萜类衍生自通过 CO2固定和形成的乙酰
CoA。两个乙酰CoA (acetyl-CoA)分子在乙酰CoA:
乙酰CoA C-酰基转运酶(acetyl-CoA: acetyl-CoA C-
acetyltransferase, AACT)催化下缩合生成乙酰乙酰
CoA (acetoacetyl-CoA) (Gual等1992), 乙酰乙酰CoA
与乙酰 CoA在 3-羟基 -3-甲基戊二酰 CoA合成酶
(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase, HMGS)
作用下缩合生成3-羟基 -3-甲基戊二酰CoA (3-hy-
droxy-3-methylglutaryl-CoA, HMG-CoA) (Luskey和
Stevens 1985), HMG-CoA在 3-羟基 -3-甲基戊二
酰 CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA
reductase, HMGR)作用下还原为MVA, 这一反应是
MVA途径中的限速反应(Basson等1988), 所以这条
途径命名为MVA途径。MVA经由甲瓦龙酸激酶
(mevalonate kinase, MK) (Lluch等2000)和磷酸甲瓦
龙酸激酶(phosphomevalonate kinase, PMK) (Tsay
和Robinson 1991)依次分别催化的两步磷酸化生成
5-焦磷酸甲瓦龙酸(mevalonate 5-diphosphate); 最
后, 5-焦磷酸甲瓦龙酸在5-焦磷酸甲瓦龙酸脱羧酶
(mevalonate 5-diphosphate decarboxylase, MDC)作
用下生成 IPP (Dhe-Paganon等 1994), IPP和其异
构物DMAPP在 IPP异构酶(IPP isomerase, IPI)作
用下可以相互转化(Wouters等 2003)。
HMGR 是MVA 途径中的限速酶, 依赖于
NADPH催化HMG-CoA生成MVA, 此反应是MVA
途径中最重要的限速反应(Caelles等 1989)。编码
HMGR的基因已经从喜树(Maldonado-Mendoza等
1997)、长春花(Maldenado-Mendoza等 1992)、甜
瓜(Kato-Emori等 2001)、番茄(Park等 1992)和拟
南芥(Learned和 Fink 1989)等多种植物中得到克
隆。HMGR对来源于MVA途径的萜类物质代谢流
的流向起决定性作用, 因而此基因的表达模式多样,
受到多种因子的高度调节, 其中包括植物体自身的
生长发育阶段和各种环境信号, 比如光、机械伤
害、病菌感染、外源生长调节物质、除草剂和
甾醇等(Bach 1995)。
2.1.2 萜类在质体中通过DXP途径生物合成 在过
去的几十年中, MVA途径曾被认为是萜类生物合成
的唯一途径。后来, 在细菌(Rohmer等 1993)和植
物(McCaskill和Croteau 1995)中发现了另一条独立
的萜类生物合成途径, 这一途径位于质体中, 其最
原初的前体物质是丙酮酸(pyruvate)和 3-磷酸甘油
醛(glyceraldehyde 3-phosphate, G3P)。丙酮酸和
G3P在 1-脱氧 -D-木酮糖 -5-磷酸合成酶(1-deoxy-
D-xylulose 5-phosphate synthase, DXPS)作用下生成
DXP (Sprenger等1997), 这一反应是质体中萜类生
物合成的第一个限速反应(Estevez等2001), 正因为
如此, 所以这条途径命名为DXP途径; 接下来, 在
DXP还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate
reductoisomerase, DXR)作用下, DXP经原子重排
和还原生成 2-C-甲基 -D-赤藓醇 -4-磷酸(2-C-me-
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月1054
thyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP) (Takahashi等
1998), 此反应是DXP途径中最重要的限速反应, 也
是萜类物质代谢工程中最重要的靶点; MEP和CDP
在2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MEP
cytidyltransferase, MCT)作用下缩合生成4-(5-焦磷
酸胞苷) -2 -C - 甲基 -D- 赤藓醇[4- ( cyt idine 5 -
diphospho)-2-C-methylerythritol, CDP-ME] (Rohdich
等 2000)。5-焦磷酸胞苷 -2-C-甲基 -D-赤藓醇激
酶[4-(cytidine 5-diphospho)-2-C-methylerythritol
kinase, CMK] (Steinbacher等2003)催化CDP-ME的
磷酸化生成 4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤藓
醇 -2-磷酸(CDP-MEP)。CDP-MEP在 2-C-甲基赤
藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(2-C-methylerythritol 2,4-
cyclodiphosphate synthase, MECPS)作用下转化为2-
C-甲基赤藓醇 -2,4-环焦磷酸(2-C-methylerythritol
2,4-cyclodiphosphate, MEC) (Herz等 2000)。DXP
途径中的最后两步反应是羟甲基丁烯基-4-磷酸合
成酶(hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate synthase,
H D S )催化 M E C 生成羟甲基丁烯基 - 4 - 磷酸
(hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate, HMBPP)
(Baker等1992), 最后HMBPP在异戊烯基焦磷酸/二
甲基烯丙基焦磷酸合成酶(IPP/DMAPP synthase,
IDS) (Cunningham和Gantt 2000)作用下转化为 IPP
和 DMAPP (5:1)。
植物MVA和DXP途径分别位于不同的亚细胞
区域中(subcellular compartment)。MVA途径存在
于细胞质和线粒体中, 主要为甾醇、特定的倍半
萜和泛醌等提供前体物质; DXP途径的酶都带有一
段质体定位的信号肽, 因此被认为是定位于质体中,
主要为半萜、单萜、二萜、多萜和类胡萝卜素
的合成提供前体(Eisenreich等2001; Adam等2002)。
但是, 这两条代谢途径并不是绝对隔离的, 事实上,
这两条途径之间是对话(cross-talk)的。近年来, 用
放射性标记物对长春花悬浮细胞进行定量核磁共振
波谱研究的结果表明, 在MVA和DXP/MEP途径之
间的对话不能用简单的两个独立的模型来解释, 而
是涉及到更复杂的调控机制, 因此需要更深入研究
(Schuhr等2003)。在喜树中关于MVA和DXP/MEP
途径在喜树碱合成中的作用还有待深入研究。
2.2 喜树碱合成的下游途径及关键酶基因 喜树碱
是一类单萜类吲哚生物碱。所有的 TIAs, 包括喜
树碱, 都来源于共同的前体异胡豆苷(strictosidine)。
异胡豆苷是由莽草酸途径生成的色胺(tryptamine)
和由甲羟戊酸途径经多步反应生成的裂环马钱子苷
(secologanin), 在异胡豆苷合成酶作用下缩合而成
(图 1)(Kutchan 1995)。图 1中所标示的已克隆到
的异胡豆苷生物合成途径中的关键酶基因, 其中最
重要的关键酶是D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-
deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS)、色
氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase, TDC)、香
叶醇 -10-脱氢酶(geraniol 10-hydroxylase, G10H)和
异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase, STR), 黑底
加框的表示甲基茉莉酸(methyl jasmonate, MeJA)可
以促使长春花中表达上调(其实是受到长春花转录
因子ORCA3的调控) (Burnett等 1993; van der Fits
和Memelink 2000; Collu等2001), 正是由于这个共
同途径的存在, 所以喜树中的TIAs代谢工程研究成
为可能。
其他的种属特异性的酶和自发的转化反应决
定之后生成的各种最终形式的TIAs, 在喜树中异胡
豆苷之后的中间代谢步骤至今还没有阐明, 推测其
中可能包括一个称为吲哚环的氧化体系, 其可导致
喜树碱结构的重排, 所形成的中间产物是一种喹啉
类生物碱甙(pumiloside) , 也称为短小蛇根草苷
(pumiloside, PML), 它已从短小蛇根草及喜树中提
取并鉴定出来, 接下来的中间体可能是脱氧短小蛇
根草苷(deoxypumiloside), 这在短小蛇根草中也有过
报道。从脱氧短小蛇根草苷到喜树碱之间还有 3
个左右的其他中间体, 但对此至今仍未最终确定
(Carte等1990; Kitajima等1997; Yamazaki等2003)。
TDC催化色氨酸脱羧生成色胺, 色胺是 TIAs
的前体之一。TDC催化的这一步反应是TIAs生物
合成上游途径中的一步关键步骤。同时, 由于色氨
酸也参与初级代谢调控, 因此认为TDC在连接初级
代谢和次级代谢中起作用(Lorence 和 Ness le r
2004)。编码 TDC的基因已经从长春花(De Luca
等 1989)、喜树(Lopez-Meyer和Nessler 1997)和短
小蛇根草(Yamazaki等 2003)等植物中得到克隆。
长春花 tdc基因是单拷贝, 在长春花幼苗发育过程
中表达量较高, 而且在萌发的过程中甲基茉莉酸可
增强 TDC的活性, 从而促使生物碱积累。长春花
tdc基因受转录因子ORCA3的正调控; 在长春花中
超量表达tdc基因, 可导致色胺的大量积累, 但下游
的 TIAs积累并不明显, 而同时转化 tdc和 str基因
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月 1055
图 1 喜树碱的生物合成途径(Lorence和Nessler 2004)
多箭头表示中间有多个步骤, 相应步骤酶的编码基因和其对应的位置。
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月1056
可促使下游 TIAs积累增加(Canell等 1998)。与长
春花相比, 喜树中存在两个 TDC的编码基因。其
中 tdc1受发育调控, 在叶尖、幼茎和树皮中, 喜树
碱含量最高的组织其表达水平也最高。而且 tdc1
表达在幼苗发育期间也升高, 在种子萌发期间其与
生物碱的积累有关。tdc2只有在喜树叶盘和细胞
培养时受真菌诱导物或以甲基茉莉酸处理时才会表
达, 但是这些处理不会影响 tdc1的表达。这说明
喜树中 tdc1可能是发育调控的化学机制中的一部
分, 而 tdc2是受病原菌诱导的防御机制的一部分
(Lopez-Meyer和Nessler 1997)。
G10H是一种细胞色素P450氧化酶, 它可以在
C10位置上羟化单萜类的前体物质——香叶基焦
磷酸, 生成 10-羟基香叶醇。迄今已经成功地从长
春花中获得G10H的cDNA并对其功能进行了验证
(Collu等 2001)。Whitmer等(1998)在长春花中的
研究表明, 裂环马钱子苷的生成是TIAs生产的限制
因素之一, 而G10H是裂环马钱子苷合成的关键调
控位点: g10h基因的超量表达, 可诱导裂环马钱子
苷的积累; 而且, 在MeJA的诱导下, G10H的活性
从每毫克蛋白 240 pmol·s-1上升至 335 pmol·s-1, 长
春花培养细胞中的 TIAs产量也同时增加, 说明
G10H的活性与TIAs的产量有密切的关系(Collu等
2002)。到目前为止, 还未见从喜树中克隆到 g10h
并进行功能研究的报道。
STR是TIAs生物合成途径中最重要的关键酶,
它将色胺和裂环马钱子苷耦合成为TIAs的前体化
合物异胡豆苷, 此步反应是 TIAs (包括各种 TIAs,
如长春花碱、长春新碱、喜树碱和羟基喜树碱等)
生物合成中的瓶颈之一(Memelink等2001; Yamazaki
等 2003)。这步反应是 TIAs生物合成途径的中心
反应, 也是此途径中的分支点, 生成的异胡豆苷是
生成各类TIAs的通用前体, 故STR在TIAs代谢中
具有至关重要的作用。Canell等(1998)报道, 长春
花 str、tdc 基因编码区在 CaMV 35S启动子作用
下, 用农杆菌转化(单转和共转化)长春花细胞; 共
转化 tdc和 str的长春花中表现出STR和TDC的高
酶活, 且转化细胞中的色胺、异胡豆苷和多种
TIAs的产量都有所提高; 接着, 单转 str基因的长
春花细胞中的TIAs含量也有提高, 而单独转 tdc的
细胞中则没有出现类似的现象。由此可见, str组
成性超量表达可以导致 TIAs产量的提高, STR是
TIAs代谢工程必选靶点。如果将长春花 str在其他
生产 TIAs植物中表达, 也能提高 TIAs的含量。
Geerlings等(1999)报道, 在金鸡纳树毛状根中超量
表达长春花 tdc和str基因后, TIAs和奎宁类生物碱
的含量大大提高。现在已经从长春花、马钱子、
蛇根草(生产喜树碱和羟基喜树碱)等植物中均克隆
到 str基因, 但在喜树中的报道还未见。
2.3 ORCA3转录因子对生物碱合成的代谢调控 植
物细胞必须调节其基础代谢途径以维持次级代谢产
物的生物合成。甲基茉莉酸既诱导TIAs代谢途径
中的基因, 又诱导合成TIAs前体的基础代谢基因。
ORCA3是一个受甲基茉莉酸诱导的植物基础和次
生代谢的转录调控因子。
ORCA3蛋白由203个氨基酸组成, 基因内部没
有内含子结构, 是一种AP2/ERF结构域蛋白, 带有
一个典型的AP2 DNA结合结构域。AP2/ERF结构
域转录因子在植物胁迫反应中起主要的调控作用。
受AP2/ERF结构域转录因子调控的植物防御基因
包括: 茉莉酸诱导的次级代谢中的基因、诱导物诱
导的与植物疾病相关的基因、乙烯诱导的与植物
疾病相关的基因以及寒冷和干旱诱导的基因等
(Mem-elink等 2001; van Der Heijden等 2004)。
在长春花中, orca3受甲基茉莉酸的诱导, 其过
量表达还可诱导氨基苯甲酸合成酶基因(as)以及
dxs基因的表达, 它们都是TIAs前体合成的初级代
谢途径中涉及到的酶(图 1); 同时, orca3还诱导 tdc
和 str基因的表达(van der Fits 和 Memelink 2000)。
orca3过量表达的细胞中, 可以提供TIAs吲哚部分
的色氨酸和色胺积累并含量提高。显然, 作为TIAs
生物合成代谢的中心调控者, orca3是通过调控初级
和次级代谢中的基因来调节 TIAs合成的。鉴于
TIAs代谢途径上游的多数步骤都是共通的, 未来喜
树中的TIAs代谢工程研究, 也可以通过过量表达转
录调节因子 orca3诱导 TIAs代谢途径中的基因表
达, 控制和调节喜树碱的生物合成。
在茉莉酸合成途径中, 丙二烯氧化物环化酶
(allene oxide cyclase, AOC)是其中至关重要的酶, 它
催化一种不稳定的丙二烯氧化物环化生成茉莉酸的
最终前体 12-氧植物二烯酸。通常AOC是调控茉
莉酸合成途径中最优先考虑的靶点(Ziegler等2000;
Stenzel等 2003; Jiang等 2009), 所以这方面的研究
也可以考虑通过茉莉酸生物合成途径来施行植物次
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月 1057
生代谢工程, 也就是通过茉莉酸来调控次生代谢途
径中多个基因的表达, 从而提高目的次生代谢产物
的含量。我们实验室曾在烟草中采用过量表达莨
菪AOC基因的方法, 提高了转基因烟草中尼古丁的
含量(Jiang等 2009)。此外, 在喜树中表达茉莉酸
途径中的关键酶基因 CaAOC, 开展喜树 TIAs代谢
工程研究, 进而了解其对喜树碱和羟基喜树碱含量
的影响, 也是值得考虑的。
3 结语
近几年来, 喜树碱及其系列衍生物已迅速成为
世界抗肿瘤药物市场中受人们注视的热点。1996
年, 美国 FDA批准 “拓扑替康 ”上市, 在短短几年
内它已迅速成为抗肿瘤药物市场上的后起之秀。
目前, 喜树碱的化学全合成已经取得成功, 但是由
于路线长、产率低、生产成本高, 一时还无法投
入工业化生产。因此, 采用现代生物技术尤其是基
因工程技术对喜树碱的生物合成进行调控, 从而提
高喜树碱产量, 已经成为当前这方面研究的焦点。
植物细胞培养具有生产喜树碱的巨大潜力, 而
且可以作为阐明喜树碱生物合成途径的一种策略之
一。Sakato等(1974)最早报道, 喜树组织培养的培
养物中喜树碱含量为 0.002 mg·g-1 (DW), 喜树各组
织中喜树碱含量为 0.2~5 mg·g-1 (DW)。研究显示,
它与其他许多生物碱一样, 只有在严密的细胞培养
条件下, 喜树碱才可以合成和累积(Lopez-Meyer等
1994)。最近有研究报道, 采用内生真菌可能将成
为改变植物次生代谢产物——喜树碱的有效途径
之一(Kusari等 2009)。
采用离体培养的喜树细胞生产喜树碱及其类
似物是扩大喜树碱来源的途径之一, 它具有不破坏
自然资源和不受自然条件限制的优点。采用植物
细胞培养技术生产次生代谢产物的方法比栽培整株
植物有以下优点: (1)次生代谢物生产完全在人工控
制条件下进行, 可以通过改变培养条件和选择优良
细胞系的方法得到超越整株植物产量的代谢产物;
(2)培养细胞是在无菌条件下生长的, 故而可以排除
病菌和虫害的侵袭; (3)可以进行特定的生物转化反
应; (4)可以探索新的合成路线和获得新的有用物质
(Wiedenfeld等 1997; Liu和 Li 2001; Pasquali等
2006)。
在扩大喜树资源研究中, 人们采用生物技术集
中在进行以下两方面的研究: (1)细胞培养的生物反
应器生产喜树碱; (2)用发根农杆菌的Ri质粒诱导并
建立发根培养的无性繁殖体系。到目前为止, 还未
见到喜树转基因的报道, 仅Lorence等(2004)报道获
得了喜树的毛状根, 并在喜树毛状根中检测到喜树
碱和羟基喜树碱。但并未得到稳定遗传的与天然
植物组织中的喜树碱含量相当的细胞系。因而, 今
后应在喜树碱生物合成途径的分子遗传学和生物化
学背景研究清楚的基础上, 结合酶学开展代谢工程
的研究, 可能才是解决喜树碱药源匮乏的有效方法。
参考文献
王玲丽, 刘文哲(2005). 不同种源喜树幼枝中喜树碱的含量. 植物
学通报, 22 (5): 584~589
杨磊, 李晓娟, 赵春建, 李佳慧, 祖元刚(2008). 喜树生物碱在喜
树植株中的分布. 植物生理学通讯, 44 (5): 873~876
张玉红, 王洋, 阎秀峰(2002). 喜树种子萌发和幼苗发育过程中
喜树碱含量的变化. 植物生理学通讯, 38 (6): 575~577
Adam P, Hecht S, Eisenreich WG, Kaiser J, Grawert T, Arigoni D,
Bacher A, Rohdich F (2002). Biosynthesis of terpenes: stud-
ies on 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate
reductase. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 12108~12113
Aiyama R, Nagai H, Nokata K, Shinohara C, Sawada S (1988). A
ca mptothecin der iva tive from No tha pod yte s foe tid a .
Phytochemistry, 27: 3663~3664
Arisawa M, Gunasekera SP, Cordell GA, Farnsworth NR (1981).
Plant anticancer agents XXI. Constituents of Merrilliodendron
megacarpum. Planta Med, 43: 404~407
Bach TJ (1995). Some new aspects of isoprenoid biosynthesis in
plants—a review. Lipids, 30: 191~202
Baker J, Franklin DB, Parker J (1992). Sequence and character-
ization of the gcpE gene of Escherichia coli. FEMS Microbiol
Lett, 73: 175~180
Basson ME, Thorsness M, Finer-Moore J, Stroud RM, Rine J
(1988). Structural and functional conservation between yeast
and human 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases,
the rate-limiting enzyme of sterol biosynthesis. Mol Cell
Biol, 8: 3797~3808
Bick JA, Lange BM (2003). Metabolic crosstalk between cytoso-
lic and plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis: unidi-
rectional transport of intermediates across the chloroplast
envelope membrane. Arch Biochem Biophys, 415: 146~154
Burnett RJ, Maldonado-Mendoza IE, McKnight TD, Nessler CL
(1993). Expression of a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coen-
zyme A reductase gene from Camptotheca acuminata is
differentially regulated by wounding and methyl jasmonate.
Plant Physiol, 103: 41~48
Caelles C, Ferrer A, Balcells L, Hegardt FG, Boronat A (1989).
Isolation and structural characterization of a cDNA encod-
ing Arabidopsis thaliana 3-hydroxy-3-methylglutaryl coen-
zyme A reductase. Plant Mol Biol, 13: 627~638
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月1058
Canell C, Lopes-Cardoso MI, Whitmer S, van der Fits L, Pasquali
G, van der Heijden R, Hoge JHC, Verpoorte R (1998). Ef-
fects of over-expression of strictosidine synthase and tryp-
tophan decarboxylase on alkaloid production by cell cultures
of Catharanthus roseus. Planta, 205: 414~419
Carte BK, Debrosse C, Eggleston D, Hemling M, Mentzer M,
Poehland B, Troupe N, Westley JW, Hecht SM (1990). Iso-
lation and characterization of a presumed biosynthetic pre-
cursor of camptothecin from extracts of Camptotheca
acuminata . Tetrahedron, 46: 2747~2760
Collu G, Garcia AA, van der Heijden R, Verpoorte R (2002).
Activity of the cytochrome P450 enzyme geraniol 10-hy-
droxylase and alkaloid production in plant cell cultures. Plant
Sci, 162: 165~172
Collu G, Unver N, Peltenburg-Looman AMG, van der Heijden R,
Verpoorte R, Memelink J (2001). Geraniol 10-hydroxylase,
a cytochrome P450 enzyme involved in terpenoid indole
alkaloid biosynthesis. FEBS Lett, 508: 215~220
Cunningham FX Jr, Gantt E (2000). Identification of multi-gene
families encoding isopentenyl diphosphate isomerase in
plants by heterologous complementation in Escherichia coli.
Plant Cell Physiol, 41 (1): 119~123
Dai JR, Hallock YF, Cardellina JH, Boyd MR (1999). 20-O-β-
glucopyranosyl camptothecin from Mostuea brunonis: a
potential camptothecin pro-drug with improved solubility.
Nat Prod, 62: 1427~1429
De Luca V, Marineau C, Brisson N (1989). Molecular cloning and
analysis of cDNA encoding a plant tryptophan decarboxylase:
comparison with animal dopa decarboxylases. Proc Natl Acad
Sci USA, 86: 2582~2586
Dewick PM (2002). The biosynthesis of C5–C 25 terpenoid
compounds. Nat Prod Rep, 19: 181~222
Dhe-Paganon S, Magrath J, Abeles RH (1994). Mechanism of
mevalonate pyrophosphate decarboxylase: evidence for a
carbocationic transition state. Biochemistry, 33: 133551~
133562
Eisenreich W, Rohdich F, Bacher A (2001). Deoxyxylulose phos-
phate pathway to terpenoid. Trends Plant Sci, 6 (2): 78~84
Estevez JM, Cantero A, Reindl A, Reichler S, Leon P (2001). 1-
deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, a limiting enzyme
for plastidic isoprenoid biosynthesis in plants. J Biol Chem,
276: 22901~22909
Geerlings A, Hallard D, van der Heijden R, Verpoorte R (1999).
Alkaloid production by a Cinchona officinalis ‘Ledgeriana’
hairy root culture containing constitutive expression con-
structs of tryptophan decarboxylase and strictosidine syn-
thase cDNAs from Catharanthus roseus. Plant Cell Rep, 19:
191~196
Gual JC, Gonzalez-Bosch C, Dopazo J, Perez-Ortin JE (1992).
Phylogenetic analysis of the thiolase family implications
for the evolutionary origin of peroxisomes. J Mol Evol, 35:
147~155
Gunasekera SP, Badawi MM, Cordell GA, Farnsworth NR, Chitnis
M (1 9 7 9 ). P la nt a nt i ca ncer a gent s X. I sola t ion of
camptothecin and 9-methoxycamptothecin from Ervatamia
heyneana . J Nat Prod, 42: 475~477
Herz S, Wungsintaweekul J, Schuhr CA, Hecht S, Luttgen H, Sagner
S, Fellermeier M, Eisenreich W, Zenk MH, Bacher A et al
(2000). Biosynthesis of terpenoids: YgbB protein converts
4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphate to
2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate. Proc Natl
Acad Sci USA, 97: 2486~2490
Hsiang YH, Hertzberg R, Hecht S, Liu LF (1985). Camptothecin
induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA
topoisomerase I. J Biol Chem, 260: 14873~14878
Jiang KJ, Pi Y, Hou R, Jiang LL, Sun XF, Tang KX (2009).
Promotion of nicotine biosynthesis in transgenic tobacco
by overexpressing allene oxide cyclase from Hyoscyamus
niger. Planta, 229 (5): 1057~1063
Kato-Emori S, Higashi K, Hosoya K, Kobayashi T, Ezura H (2001).
Cloning and characterization of the gene encoding 3-hy-
droxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in melon
(Cucumis melo L. reticulatus). Mol Genet Genomics, 265:
135~142
Kitajima M, Masumoto S, Takayama H, Aimi N (1997). Isolation
and partial synthesis of 3(R)- and 3(S)-deoxypumiloside;
st ru ctura l r evi sion of the k ey meta bol i t e from the
camptothecin producing plant, Ophiorrhiza pumila . Tetra-
hedron Lett, 38: 4255~4258
Kusari S, Zuhlke S, Spiteller M (2009). An endophytic fungus
from Camptotheca acuminata that produces camptothecin
and analogues. J Nat Prod, 72: 2~7
Kutchan TM (1995). Alkaloid biosynthesis––the basis for meta-
bol ic engineering of medicina l plants . Pla nt Cell, 7 :
1059~1070
Learned RM, Fink GR (1989). 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-co-
enzyme A reductase from Arabidopsis thaliana is structur-
ally distinct from the yeast and animal enzymes. Proc Natl
Acad Sci USA, 86: 2779~2783
Li SY, Y i YJ, Wang YJ, Zhang ZZ, Beasley RS (200 2).
Camptothecin accumulation and variations in Camptotheca.
Planta Med, 68: 1010~1016
Liu ZJ, Carpenter SB, Bourgeois WJ, Yu Y, Constantin RJ, Falcon
MJ, Adams JC (1998). Variations in the secondary metabo-
lite camptothecin in relation to tissue age and season in
Camptotheca acuminata. Tree Physiol, 18: 265~270
Liu ZJ, Li ZH (2001). Micropropagation of Camptotheca
acuminata decaisne from axillary buds, shoot tips. In Vitro
Cell Dev Biol-Plant, 37: 84~88
Lluch MA, Masferrer A, Arro M, Boronat A, Ferrer A (2000).
Molecular cloning and expression analysis of the mevalonate
kinase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol, 42:
365~376
Lopez-Meyer M, Nessler CL (1997). Tryptophan decarboxylase
is encoded by two au tonomou sly regulated genes in
Camptotheca acuminata which are differentially expressed
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月 1059
during development and stress. Plant J, 11: 1167~1175
Lopez-Meyer M, Nessler CL, McKnight TD (1994). Sites of
accumulation of the antitumor a lkaloid camptothecin in
Camptotheca acuminata. Planta Med, 60: 558~560
Lorence A, Medina-Bolivar F, Nessler CL (2004). Camptothecin
and 10-hydroxycamptothecin from Camptotheca acuminata
hairy roots. Plant Cell Rep, 22: 437~441
Lorence A, Nessler CL (2004). Molecules of interest––camptothecin,
over four decades of surprising findings. Phytochemistry,
65: 2735~2749
Lu H, McKnight TD (1999). Tissue-specific expression of the
beta-subu nit of tryptophan synthase in Ca mpto the ca
acuminata, an indole alkaloid-producing plant. Plant Physiol,
120: 43~51
L u s k e y K L, S t e ve ns B (1 9 8 5 ) . H u ma n 3 -hy dr o xy -3 -
methylglutaryl coenzyme A reductase. Conserved domains
responsible for cata lytic activity and sterol-regulated
degradation. J Biol Chem, 260: 10271~10277
Maldenado-Mendoza IE, Burnett RJ, Nessler CL (1992). Nucle-
ot ide sequ ence of a cD N A encodin g 3 -hydro xy-3 -
methylglutaryl coenzyme A reductase from Catharanthus
roseus. Plant Physiol, 100: 1613~1614
Maldonado-Mendoza IE, Vincent RM, Nessler CL (1997). Mo-
lecular characterization of three differentially expressed
members of the Camptotheca acuminata 3-hydroxy-3-
methylglutaryl CoA reductase (HMGR) gene family. Plant
Mol Biol, 34: 781~790
McCaskill D, Croteau R (1995). Monoterpene and sesquiterpene
biosynthesis in glandular trichomes of peppermint (Mentha ×
piperita) rely exclusively on plastid-derived isopentenyl
diphosphate. Planta, 197 (1): 49~56
Memelink J, Verpoorte R, Kijne JW (2001). ORCAnization of
j a smo na t e-r espo nsi ve gen e e xpr ess ion in a lk a lo id
metabolism. Trends Plant Sci, 6: 212~219
Park H, Denbow CJ, Cramer CL (1992). Structure and nucleotide
sequence of tomato HMG2 encoding 3-hydroxy-3-methyl-
glutaryl coenzyme A reductase. Plant Mol Biol, 20: 327~331
Pasquali G, Porto DD, Fett-Neto AG (2006). Metabolic engineer-
ing of cell cultures versus whole plant complexity in produc-
tion of bioactive monoterpene indole alkaloids: recent
progress rela ted to old dilemma. J Biosci Bioeng, 101:
287~296
Ping YH, Lee HC, Lee JY, Wu PH, Ho LK, Chi CW, Lu MF,
Wa ng JJ (20 06) . Anticancer effect s of low-dose 1 0-
hydroxycamptothecin in human colon cancer. Oncol Rep,
15: 1273~1279
Raskin I, Ribnicky DM, Komarnytsky S, Llic N, Poulev A, Borisjuk
N, Brinker A, Moreno DA, Ripoll C, Yakoby N et al (2002).
Plants and human health in the twenty-first century. Trends
Biotechnol, 20: 522~531
Rohdich F, Wungsintaweekul J, Eisenreich W, Richter G, Schuhr
CA, Hecht S, Zenk MH, Bacher A (2000). Biosynthesis of
terpenoids: 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol
synthase of Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA,
97: 6451~6456
Rohmer M, Knani M, Simonin P, Sutter B, Sahm H (1993). Iso-
prenoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for the
early steps leading to isopentenyl diphosphate. Biochem J,
295: 517~524
Rothenberg ML (1997). Topoisomerase I inhibitors: review and
update. Ann Oncol, 8: 837~855
Saito K, Sudo H, Yamazaki M, Koseki-Nakamura M, Kitajima M,
Takayama H, Aimi N (2001) . Feasible produ ction of
camptothecin by hairy root culture of Ophiorrhiza pumila .
Plant Cell Rep, 20: 267~271
Sakato K, Tanaka H, Mukai N, Misawa M (1974). Isolation and
identification of camptothecin from cells of Camptotheca
acuminata suspension cultures. Agr Biol Chem, 38: 217~218
Schuhr CA, Radykewicz T, Sagner S, Latzel C, Zenk MH, Arigoni
D, Bacher A, Rohdich F, Eisenreich W (2003). Quantitative
assessment of crosstalk between the two isoprenoid biosyn-
thesis pathways in plants by NMR spectroscopy. Phytochem
Rev, 2: 3~16
Sprenger GA, Schorken U, Wiegert T, Grolle S, Graaf AAD, Tay-
lor SV, Begley TP, Bringer-Meyer S, Sahm H (1997). Iden-
tification of a thiamin-dependent synthase in Escherichia
coli required for the formation of the 1-deoxy-D-xylulose 5-
phosphate precursor to isoprenoids, thiamin, and pyridoxol.
Proc Natl Acad Sci USA, 94: 12857~12862
Sriram D, Yogeeswari P, Thirumurugan R, Bal TR (2005).
Camptothecin and its analogues: a review on their chemo-
therapeutic potential. Nat Prod Res, 19: 393~412
Steinbacher S, Kaiser J, Eisenreich W, Huber R, Bacher A, Rohdich
F (2003). Structural basis of fosmidomycin action revealed
by the complex with 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate
synthase (IspC). Implications for the catalytic mechanism
and anti-malaria drug development. J Biol Chem, 278:
18401~18407
Stenzel I, Hause B, Miersch O, Kurz T, Maucher H, Weichert H,
Ziegler J, Feussner I, Wasternack C (2003). Jasmonate bio-
synthesis and the allene oxide cyclase family of Arabidopsis
thaliana . Plant Mol Biol, 51: 895~911
Tafur S, Nelson JD, DeLong DC, Svoboda GH (1976). Antiviral
components of Ophiorrhiza mungos isolation of camptothecin
and 10-methoxycamptothecin. Lloydia, 39: 261~262
Takahashi S, Kuzuyama T, Watanabe H, Seto HA (1998). A 1-
deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing
the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate in
an a lternative nonmevalona te pa thway for terpenoid
biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 9879~9884
Tsay YH, Robinson GW (1991). Cloning and characterization of
ERG8, an essential gene of Saccharomyces cerevisiae that
encodes phosphomevalonate kinase. Mol Cell Biol, 11:
620~631
van der Fits L, Memelink J (2000). ORCA3, a jasmonate-respon-
sive transcriptional regulator of plant primary and second-
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月1060
ary metabolism. Science, 289: 295~297
van Der Heijden R, Jacobs DI, Snoeijer W, Hallared D, Verpoorte
R (2004). The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and
biotechnology. Curr Med Chem, 11: 607~628
van Hengel AJ, Harkes MP, Wichers HJ, Hesselink PGM, Buitelaar
RM (1992). Characterization of callus formation and
camptothecin production by cell-lines of Camptotheca
acuminata. Plant Cell Tiss Org Cul, 28: 11~18
Wallis JG, Wang HY, Guerra DJ (1997). Expression of a synthetic
antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at
freezing temperatures. Plant Mol Biol, 35: 323~330
Wiedenfeld H, Furmanowa M, Roeder E, Guzewska J, Gustowski
W (1997). Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in
callus and plantlets of Camptotheca acuminata . Plant Cell
Tiss Org Cul, 49: 213~218
Whitmer S, Canel C, Hallard D, Goncalves C, Verpoorte R (1998).
Influence of precursor availability on alkaloid accumulation
by transgenic cell line of Catharanthus roseus. Plant Physiol,
116: 853~857
Wink M (2003). Evolution of secondary metabolites from an
ecological and molecular phylogenetic perspective. Phyto-
chemistry, 64: 3~19
Wouters J, Oudjama Y, Ghosh S, Stalon V, Droogmans L, Oldfield E
(2003). Structure and mechanism of action of isopente-
nylpyrophosphate-dimethylallylpyrophosphate isomerase. J
Am Chem Soc, 125: 3198~3199
Yamazaki Y, Sudo H, Yamazaki M, Aimi N, Saito K (2003).
Ca mptothecin b iosynthet i c genes in ha i ry root s of
Ophiorrhiza pumila: cloning, characterization and differen-
tial expression in tissues and by stress compounds. Plant Cell
Physiol, 44: 395~403
Zhang RW, Li YF, Cai QY, Liu TP, Sun H, Chambless B (1998).
Preclinical pharmacology of the natural product anticancer
agent 10-hydroxycamptothecin, an inhibitor of topoisomerase
I. Cancer Chemoth Pharm, 41: 257~267
Zhou BN, Hoch JM, Johnson RK, Mattern MR, Eng WK, Ma J,
Hecht SM, Newman DJ, Kingston DGI (2000). Use of COM-
PARE analysis to discover new natural product drugs: isola-
tion of camptothecin and 9-methoxycamptothecin from a
new source. J Nat Prod, 63: 1273~1276
Ziegler J, Stenzel I, Hause B, Maucher H, Hamberg M, Grimm R,
Ganal M, Wasternack C (2000). Molecular cloning of allene
oxide cyclase. The enzyme establishing the stereochemistry
of octadecanoids a nd ja smonates. J Biol Chem, 2 75:
19132~19138