全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (4): 563~566　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0495 563
收稿 2013-12-23　　修定 2014-02-10
资助 江苏省自然科学基金青年基金(BK2012073)、国家高技术
研究发展“863”计划(2012AA021701)和江苏省生态学重点
学科建设项目(2012)。
* 通讯作者(E-mail: zfibcas@163.com; Tel: 025-86178274)。
毕氏海蓬子光系统II颗粒的分离与鉴定
周峰*, 华春, 郑春梅
南京晓庄学院生物化工与环境工程学院, 南京211171
摘要: 采用去污剂Triton X-100增溶类囊体膜和高速离心的方法, 首次分离和纯化了毕氏海蓬子的光系统II (photosystem II,
PSII)颗粒, 通过光谱学和SDS-PAGE对其进行鉴定并与类囊体膜进行比较。室温吸收光谱结果表明, PSII颗粒在蓝区的叶
绿素(chlorophyll, Chl) b和胡萝卜素类吸收峰为485 nm, 在红区的Chl b吸收峰为655 nm, 这两个峰值均低于类囊体膜中的。
77K荧光发射光谱结果表明, 提取的PSII颗粒基本不含光系统I (photosystem I, PSI)的低温荧光反射峰737 nm。77K荧光激
发光谱结果显示, 海蓬子PSII颗粒在470~485 nm之间的Chl b和胡萝卜素类的荧光发射峰明显低于类囊体膜的。这说明在
PSII中大部分的PSI已被除去。电泳结果显示, 海蓬子PSII颗粒缺少PSI反应中心蛋白质亚基PsaA和PsaB, 这说明提取到的
PSII纯度较高, 这为进一步研究毕氏海蓬子PSII的结构与功能奠定基础。
关键词: 海蓬子; 光系统II; 光谱; 电泳
Isolation and Identification of Photosystem II Protein of Salicornia bigelovii
Torr.
ZHOU Feng*, HUA Chun, ZHENG Chun-Mei
School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China
Abstract: The photosystem II (PSII) of Salicornia bigelovii from coastal wetlands was firstly isolated and
purified by solubilization of thylakoid membrane using detergent Triton X-100 and high-speed centrifugation.
The PSII particles of S. bigelovii were studied and compared with thylakoid membrane by spectroscopy and
SDS-PAGE methods. The results of absorption spectra at room temperature showed that the absorption peak of
chlorophyll (Chl) b and carotenoid in the blue region was 485 nm, and the absorption peak of Chl b in the red
region was 655 nm. Moreover, the two peaks were lower than those in the thylakoid membrane. The results of
77K fluorescence emission spectra showed that PSII particles extracted were free of the low temperature
fluorescence peak 737 nm of photosystem I (PSI). It was shown from 77K fluorescence excitation spectra that
the emission peak between 470–485 nm was lower than that of the thylakoid membrane. These indicated that
most of the PSI has been removed from the extracted PSII. The PSII particles of S. bigelovii were lack of PSI
reaction center protein subunits (PsaA and PsaB). It demonstrated that the extracted PSII particles were high
purity, which could be used for further study on the structure and function of S. bigelovii.
Key words: Salicornia bigelovii; PSII; spectra; electrophoresis
光合作用的光能吸收、传递和转化过程是在
具有一定分子排列和空间构象的色素蛋白复合体
以及有关的电子载体中完成的。这些复合体大多
数都镶嵌在基本的光合膜系统——类囊体膜中。
类囊体膜中的光系统II (photosystem II, PSII)复合
体是进行光合作用原初反应的重要场所, 它的主
要功能是吸收光能, 进行光诱导的电荷分离, 产生
电子传递并催化水的光解(周峰2007)。
目前, 关于海蓬子的研究主要集中在耐盐生
理和营养成份方面(刘伟成等2013; 吴演等2012),
作者前期也对海蓬子类囊体膜蛋白进行了相关研
究(周峰等2012), 其他盐生植物如海马齿(Sesuvium
portulacastrum)、星星草(Puccinellia tenuiflora)和
欧洲海蓬子(Salicornia europaea)等的类囊体膜蛋
白光谱学和Western杂交分析也有报道(Rabhi等
2010; Yu等2011; Fan等2011)。但关于海蓬子或其
它盐生植物的PSII分离纯化报道很少, 而PSII的分
植物生理学报564
离纯化对于深入研究海蓬子光合作用机理以及在
其基础上继续提取捕光天线II (light harvesting
complexes II, LHCII)等具有重要意义。本文通过
室温吸收光谱、77K荧光光谱和SDS-PAGE对首次
分离得到的海蓬子PSII颗粒进行了鉴定与分析, 为
进一步研究海蓬子的耐盐高光效机制奠定基础。
材料与方法
1 材料
植物材料为滨海生境条件下的毕氏海蓬子
(Salicornia bigelovii Torr.)采自江苏省盐城市。参
照周峰等(2012)和Tang等(2007)的方法, 制备具光
化学活性的类囊体膜和PSII颗粒。
2 光谱测定
吸收光谱用岛津UV2450分光光度计进行检
测, 扫描速率为100 nm·min-1, 分辨率为0.5 nm; 样
品中Chl浓度调至10 µg·mL-1。低温荧光光谱的测
定用Hitachi F-4500荧光分光光度计进行检测, 样
品在室温或77K液氮温度下 , Ch l浓度调至10
µg·mL-1。激发光波长为436或480 nm, 激发狭缝和
发射狭缝分别是10和5 nm。Chl浓度和Chl a/b用
Arnon公式(Arnon 1949)计算。
3 SDS-PAGE电泳
按照Shan等(2001)的方法, 分离胶和浓缩胶的
浓度分别为15%和4%。分离胶中加入6 mmol·L-1
尿素以提高分辨率, 先用80 V稳压电泳, 溴酚兰进
入分离胶后再改用120 V稳压。将提取的类囊体膜
和PSII颗粒用含有0.4 mol·L-1蔗糖、20 mmol·L-1
Mes (pH 6.5)和35 mmol·L-1 NaCl的缓冲液稀释, 加
入上样缓冲液混匀 (样品色素终浓度为 3 0 0
µg·mL-1), 然后沸水浴10 min。取20 µL上样。
实验结果
1 毕氏海蓬子PSII的吸收光谱
图1是海蓬子类囊体膜和PSII颗粒两种色素
蛋白复合物的室温吸收光谱。由图1中可以看出,
PSII的吸收光谱在蓝区有2个吸收峰, 分别是436
和485 nm, 436 nm主要是Chl a的吸收峰, 485 nm
主要来自Chl b和胡萝卜素类的吸收; 在红区682
nm处有一个峰, 主要是Chl a的吸收峰, 类囊体膜
在655 nm左右还有一个尖峰, 是Chl b的吸收峰
(Ide等1987)。类囊体膜在Chl b处的吸收高于PSII
颗粒, 这是由于类囊体膜含有相对高的Chl b分子
的缘故。
2 毕氏海蓬子PSII的77K荧光发射光谱
从图2可以看出, 海蓬子的类囊体膜77K荧光
发射光谱有3个荧光发射峰峰: 688、697和737
nm。研究表明, 荧光发射峰697 nm来源于PSII内
周天线CP47中在690 nm处吸收的Chl a; 荧光发射
峰688 nm表示了内周天线CP43、CP47和PSII反应
中心色素之间达到单线激发态平衡的荧光(Andri-
zhiyevskaya等2005); 737 nm是PSI的荧光发射峰。
图1 海蓬子PSII颗粒和类囊体膜蛋白
复合体的室温吸收光谱
Fig.1 Absorption spectra of PSII and thylakoid complexes
of S. bigelovii at room temperature
图2 海蓬子PSII颗粒和类囊体膜蛋白
复合体的77K荧光发射光谱
Fig.2 The 77K fluorescence emission spectra of PSII and
thylakoid complexes of S. bigelovii
周峰等: 毕氏海蓬子光系统II颗粒的分离与鉴定 565
通过比较发现, 提取的PSII颗粒的没有PSI的737
nm峰, 这表明提取的PSII颗粒样品纯, 不含PSI的
蛋白亚基。
3 毕氏海蓬子PSII的77K荧光激发光谱
从图3可以看出, 海蓬子的类囊体膜和PSII颗
粒的荧光激发光谱在440 nm左右有一个峰, 属于
Chl a; 在470~485 nm之间的峰属于Chl b和类胡萝
卜素分子的复合峰。类囊体膜在此处的峰要比
PSII颗粒高, 这是因为类囊体膜含有较多Chl b的原
因。PSII颗粒在470~485 nm之间的峰低, 表明在
PSII中, 大部分的LHCI (Chl b)已被除去。
低温荧光发射光谱的研究结果一致(图2)。
讨　　论
高等盐生植物的PSII结构与功能研究具有重
要意义, 可为了解盐生植物的耐盐高光效机制奠
定基础。Liu等(2010)对海洋绿藻石莼(Ulva lactu-
ca)的研究表明, 石莼类囊体膜多肽组成和菠菜类
囊体膜的基本相同, 但也存在一些差异, 包括D2蛋
白与D1蛋白的分界不明显, 而且D1蛋白含量更
高。Rabhi等(2010)对盐生植物海马齿(Sesuvium
portulacastrum)的研究发现, 盐处理的海马齿的类
囊体膜蛋白亚基D1、CP47和CP43未发生明显变
化, LHCII降低了15%。Trotta等(2012)对盐沼节黎
属一种盐生植物(Arthrocnemum macrostachyum)的
研究发现, 33 kD蛋白、PsbS和PsbR不受盐胁迫影
响, 但盐胁迫使LHCII含量下降约10%, 而所有PSII
反应中心蛋白在无NaCl处理时含量最低。这些研
究主要是在植物的类囊体膜上层次上开展的, 关
于高等盐生植物PSII的提取鉴定报道很少, 而高等
盐生植物PSII的分离纯化可为研究耐盐高光效机
制奠定基础。本文的研究结果表明, 首次分离纯
化得到的毕氏海蓬子的PSII纯度较高, 77K荧光发
射光谱结果表明, 提取的PSII颗粒的基本不含PSI
图3 海蓬子PSII颗粒和类囊体膜蛋白
复合体的77K荧光激发光谱
Fig.3 The 77 K fluorescence excitation spectra of PSII and
thylakoid complexes of S. bigelovii
4 毕氏海蓬子PSII的SDS-PAGE
由图4可以看出, 与类囊体膜相比, 海蓬子PSII
颗粒缺少PSI反应中心蛋白质亚基PsaA和PsaB, 这
进一步说明提取到的PSII纯度较高。PSII中含有
分子量分别为47和43 kDa的内周天线蛋白CP47和
CP43、32 kDa的D2蛋白和外周天线蛋白LHCII,
LHCII包括Lhcb1和Lhcb2蛋白的混和条带以及
Lhcb3蛋白的条带(Jasson 1994)。此外, 还包括分
子量分别为33、23和17 kDa的3个放氧外周蛋白,
这与前人在菠菜和欧洲海蓬子的研究结果一致
(Eshaghi等1999)。相同色素总浓度条件下, PSII颗
粒的蛋白亚基CP47、CP43、D2等的表达量高于
类囊体膜中的(图4), 这是因为类囊体膜在进一步
纯化中所含的PSI反应中心蛋白亚基被去除, 这与
图4 海蓬子PSII颗粒和类囊体膜蛋白复合体的SDS-PAGE
Fig.4 SDS-PAGE of PSII and thylakoid
complexes of S. bigelovii
植物生理学报566
低温荧光发射峰737 nm。77K荧光激发光谱结果
显示, 海蓬子PSII颗粒在470~485 nm之间的Chl b
和胡萝卜素类的荧光发射峰明显低于类囊体膜
的。这说明在PSII中, 大部分的PSI已被除去。电
泳结果也证实, 海蓬子PSII颗粒缺少PSI反应中心
蛋白质亚基PsaA和PsaB, 这与77K荧光发射光谱结
果相一致。成功分离纯化的海蓬子PSII蛋白颗粒
不仅可研究其在盐渍环境下的结构与功能, 而且
可在其基础上继续分离纯化LHCII等光合膜蛋白,
全面了解海蓬子的PSII。
参考文献
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