全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (2): 241~245　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0519 241
收稿 2014-11-17　　修定 2015-01-30
资助 浙江省科技计划项目(2013C32102)、浙江省观赏花卉
工程技术研究中心(2012E0036)和丽水市科技计划项目
(20120310)。
* 通讯作者(E-mail: zjfc_ghxia@126.com; Tel: 0571-
63732761)。
秀丽野海棠叶片不定芽高频再生体系的建立
洪震1,2, 朱乐杰3, 傅晓强3, 范文峰4, 夏国华3,*
1丽水市林业科学研究院, 浙江丽水323000; 2丽水职业技术学院, 浙江丽水323000; 3浙江农林大学林业与生物技术学院, 浙
江临安311300; 4浙江森禾种业股份有限公司, 杭州310007
摘要: 以秀丽野海棠叶片为外植体诱导愈伤组织并分化出不定芽, 得到再生植株, 建立了组织培养和快速繁殖体系。结果
表明: 培养基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1适用于叶片外植体愈伤组织诱导和分化, 诱导率为100%, 分化率为
85.83%; MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1适用于继代增殖培养, 平均增殖系数为7.38, 且不定芽较粗壮; MS+NAA 0.5
mg·L-1+活性炭1 g·L-1适用于生根培养, 生根率达到100%; 将生长良好的无菌植株进行移栽驯化, 存活率达到90%。
关键词: 秀丽野海棠; 叶片; 离体培养; 植株再生
Establishment of High Frequency Shoot Regeneration System from Leaf of
Bredia amoena
HONG Zhen1,2, ZHU Le-Jie3, FU Xiao-Qiang3, FAN Wen-Feng4, XIA Guo-Hua3,*
1Lishui Academy of Forestry, Lishui, Zhejiang 323000, China; 2Lishui Vocational & Technical College, Lishui, Zhejiang 323000,
China; 3School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A & F University, Lin’an, Zhejiang 311300, China; 4Zhejiang Senhe Seed
Industry Co. Ltd., Hangzhou 310007, China
Abstract: In this paper, we studied in vitro culture of Bredia amoena by using leaf explants, including callus
induction, adventitious shoot differentiation and plantlet regeneration. The results showed that the best medium
for callus induction and adventitious shoot differentiation was MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1, with an
induction rate of 100% and a differentiation rate of 85.83%. The best multiplication medium was MS+6-BA 1.0
mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1, the multiplication coefficient reached 7.38, and the shoots induced were strong. The
optimum rooting medium was MS+NAA 0.5 mg·L-1+activated carbon (AC) 1 g·L-1, and the rooting rate reached
100%. The strong rooting plantlets were transplanted into greenhouse and the survival rate was 90%.
Key words: Bredia amoena; leaf blade; in vitro culture; plantlet regeneration
野牡丹科(Melastomataceae)野海棠属(Bredia)
植物我国约有11种, 其中10种为我国特有种, 分布
于长江流域以南各省, 浙江有3种, 1个变种(裘宝林
1993)。该属植物叶色浓绿, 株型紧凑, 花色多为紫
红色, 鲜艳夺目, 具有较高的观赏价值(马丹丹和金
清2011)。目前, 对该属植物的组织培养研究不多
(林骏烈等2009; 蔡坤秀等2010; 陈振东等2011), 而
野牡丹科金锦香属(Osbeckia) (胡松梅等2009)、野
牡丹属(Melastoma) (马国华等2000; 彭东辉等2010;
杨利平等2012)、异药花属(Fordiophyton) (刘连芬
等2007)、虎颜花属(Tigridiopalma) (李龙娜等
2006)和肉穗草属(Sarcopyramis) (周以飞等2005)植
物的组织培养研究已有较多报道。秀丽野海棠是
野海棠属的一种常绿小灌木, 其株型优美, 花粉红
色或紫红色, 蒴果近球形, 群体花期较长, 生长于
沟谷林下(陈介1984), 是一种优良的乡土园林植物;
同时还是一种民间常用草药, 全株可供药用, 有祛
风利湿、活血调经的功效(常章富等2008)。秀丽
野海棠种子数量虽多, 但种子细小, 萌发率较低(刘
洪见等2011), 扦插繁殖尚未见报道。本实验以秀
丽野海棠无菌苗的叶片为外植体, 建立了高频不
定芽诱导、增殖和植株再生体系, 为其大规模繁
殖和开发利用提供实验和技术基础。
材料与方法
1 植株材料
秀丽野海棠(Bredia amoena Diels)茎段萌发获
得的无菌植株。
植物生理学报242
2 愈伤组织诱导及不定芽分化
将秀丽野海棠无菌植株成熟叶片剪成大小约
0.5 cm×0.5 cm, 接种至附加不同植物生长调节剂组
合的培养基上进行愈伤组织诱导和不定芽分化,
采用6-BA四水平(0.1、0.3、0.5、1.0 mg·L-1)和
2,4-D三水平(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)的完全试验设
计, 每处理30个外植体(每瓶6个, 5瓶为一个处理),
3个重复。20 d后统计愈伤组织诱导率=(产生愈伤
组织叶片数/接种叶片数)×100%, 30 d后统计不定
芽分化率=(分化出不定芽的愈伤组织数/接种叶片
数)×100%。
3 继代增殖培养
取带1个节、2对叶片、长约2 cm的植株进行
增殖培养, 采用6-BA三水平(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)
和IBA三水平(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)的完全试验设
计, 每处理30个植株(每瓶6个, 5瓶为一个处理), 3
个重复。30 d后统计增殖系数=培养后植株总数/
接种植株总数, 并观察生长情况。
4 生根培养
选取高约4 cm、带3对叶片的幼苗转入附加
不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg·L-1) NAA和
活性炭(1.0 mg·L-1)组合的MS培养基进行生根培
养。30 d后, 统计生根率=(生根植株数/接种植株
数)×100%, 每株生根数, 并记录植株的生长情况。
每处理随机选取10棵植株, 小心洗净培养基, 尽量
避免根系受损, 采用WinRHIZO根系分析系统分析
根系特征, 包括根总长、平均直径、总面积、总
体积、根尖数量以及根直径等级分布等。以上试
验均以MS为基本培养基, 附加蔗糖30 g·L-1和琼脂
粉7.2 g·L-1, pH值为5.8, 在120~121 ℃高温高压灭
菌锅内灭菌20 min。培养温度(25±2) ℃, 光照时间
12~14 h·d-1, 光照强度30~40 µmol·m-2·s-1。
5 移栽
选取高约6 cm的秀丽野海棠无菌苗, 打开瓶
盖, 将其放到自然光照、温度25 ℃的通风条件下
炼苗7~10 d, 然后将无菌苗取出, 洗干净根部的培
养基, 移栽至灭过菌的营养基质土(泥炭:蛭石=1:1)
中, 进行常规管理。
6 数据处理
数据采用SAS 8.0进行统计分析, 用平均值±
标准误表示。
实验结果
1 秀丽野海棠愈伤组织诱导和不定芽分化
外植体在不同培养基中培养8~10 d后, 外植体
切口处膨大呈瘤状, 出现白色愈伤组织, 愈伤组织
呈松散颗粒状; 20 d后开始大量增殖, 且逐渐变成
深绿色, 同时, 愈伤组织开始分化; 30 d后愈伤组织
表面可见绿色不定芽(图1-A)。
表1显示, 秀丽野海棠愈伤组织较易诱导, 12
种处理的愈伤组织诱导率均超过85%, 不同处理间
存在显著性差异, 其中处理7、8、10~12的诱导率
均达到100%。当2,4-D浓度一定时, 随着6-BA浓度
升高愈伤组织诱导率升高, 分化率升高。当6-BA
浓度在0.1 mg·L-1时, 随着2,4-D浓度升高, 愈伤组
织诱导率升高, 而分化率均为0; 当6-BA浓度在
0.3、0.5、1.0 mg·L-1时, 随着2,4-D浓度升高, 愈伤
组织诱导率升高, 不定芽分化率均显著升高。其
中处理8的不定芽分化率达到85.83%, 与其余处理
均存在显著差异。综合愈伤诱导率和分化率可以
得到最适合秀丽野海棠愈伤诱导和不定芽分化的
培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1, 诱
导率为100%, 分化率为85.83%, 可以作为一步法获
得不定芽的培养基。
2 秀丽野海棠继代增殖培养
将秀丽野海棠外植体诱导出的不定芽继代培
养30 d后统计和观察不定芽的增殖情况(表2, 图
1-B和C)。当IBA浓度一定时, 随着6-BA浓度的升
高, 增殖系数随之升高, 6-BA浓度为1.5 mg·L-1时达
到最高。当6-BA浓度在0.5和1.0 mg·L-1时, 随着
IBA浓度的升高, 增殖系数呈现上升趋势; 而当
6-BA浓度为1.5 mg·L-1时, 随着IBA浓度的升高增
殖系数随之下降。处理7的增殖系数达到最高, 平
均为9.12, 但不定芽较纤细, 玻璃化程度严重; 处理
6~8的增殖系数虽大, 但丛生芽弱小, 叶片和茎杆
细小, 玻璃化苗多, 形成有效苗的比例仅30%左右;
处理5的增殖系数较处理6~8的略低, 平均为7.38,
但茎粗壮, 叶片较大, 有效成苗率可达90%以上。
在9种不同植物生长调节剂组合的增殖培养基上
诱导的丛生芽均会出现不同程度的玻璃化现象。综
合各处理平均增殖系数及不定芽形态, 可知MS+6-
BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1最适合秀丽野海棠继
代培养。
洪震等: 秀丽野海棠叶片不定芽高频再生体系的建立 243
3 秀丽野海棠生根培养
将继代培养所得的不定芽进行生根培养, 30 d
后统计和观察生根情况(表3, 图1-D和E)。由表3可
知, 6种处理下秀丽野海棠不定芽生根率均为100%,
生根容易。随着NAA浓度的升高, 根总长度、根总
表面积总体呈现下降趋势, 而根总体积和根尖数表
现出先升高后降低的趋势。活性炭对不定芽生根有
显著作用, 当NAA浓度为0.5 mg·L-1、活性炭含量为
1 g·L-1 (处理6)时, 根总长度和根表总面积比不加活
性炭的处理4高, 但根总体积和根尖数较低。综合
各项指标后可知, 最适合秀丽野海棠不定芽生根培
养的培养基为MS+NAA 0.5 mg·L-1+活性炭1 g·L-1。
4 移栽
无菌苗经炼苗后移栽, 30 d后发出新芽, 检查
根部长出新根即移栽成活, 移栽成活率达90%, 成
活植株生长30 d后抽生大量芽(图1-F), 长势健康。
讨　　论
愈伤组织不定芽诱导是多数植物组织培养的
常用方法, 通过愈伤组织诱导能够快速获得大量
植株。以秀丽野海棠叶片为外植体进行愈伤组织
诱导, 效果明显, 愈伤组织易分化成不定芽。6-BA
和2,4-D组合使用能够显著提高秀丽野海棠愈伤组
织的形成, 这与明日叶(Angelica keiskei) (刘梦昕等
表1 不同植物生长调节剂组合对秀丽野海棠愈伤组织诱导和不定芽分化的影响
Table 1 Effects of different plant growth regulator combinations on callus induction
and adventitious shoot differentiation of B. amoena
植物生长调节剂
培养20 d愈伤组织 培养20 d愈伤组织 组织培养30 d
处理编号 浓度/mg·L-1 外植体数/个
诱导情况

诱导率/% 不定芽分化率/%
2,4-D 6-BA
1 0.1 0.1 110 + 85.21±3.70d 0±0.00e
2 0.1 0.3 112 + 94.49±3.29bc 0±0.00e
3 0.1 0.5 119 ++ 97.41±2.64ab 3.33±1.44de
4 0.1 1.0 120 +++ 98.33±1.44ab 16.67±1.44c
5 0.3 0.1 116 ++ 91.25±2.17cd 0±0.00e
6 0.3 0.3 118 +++ 99.17±1.44a 4.17±1.44de
7 0.3 0.5 116 ++++ 100.00±0.00a 12.87±0.42c
8 0.3 1.0 120 +++++ 100.00±0.00a 85.83±3.82a
9 0.5 0.1 118 +++ 98.33±1.44ab 0±0.00e
10 0.5 0.3 117 ++++ 100.00±0.00a 9.58±0.72cd
11 0.5 0.5 119 ++++ 100.00±0.00a 15.83±1.44c
12 0.5 1.0 120 +++++ 100.00±0.00a 35.00±2.50b
+的数量表示愈伤组织诱导的情况。不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05); 表2和3同此。
表2 不同植物生长调节剂组合对秀丽野海棠不定芽增殖的影响
Table 2 Effects of different plant growth regulator combinations on multiplication of B. amoena
处理编号
植物生长调节剂浓度/mg·L-1
增殖系数

培养30 d不定芽的形态特征
6-BA IBA
1 0.5 0.1 5.73±0.23d 细弱, 嫩绿, 有效苗较少
2 0.5 0.3 3.61±0.29e 粗壮, 绿色, 有效苗较多
3 0.5 0.5 7.19±0.89bc 粗壮, 绿色, 有效苗略多
4 1.0 0.1 6.59±0.26cd 细弱, 嫩绿, 有效苗较少
5 1.0 0.3 7.38±0.85bc 粗壮, 绿色, 有效苗略多
6 1.0 0.5 8.27±0.82ab 细弱, 嫩绿, 有效苗较少
7 1.5 0.1 9.12±0.64a 细弱, 嫩绿, 有效苗较少
8 1.5 0.3 8.70±0.36ab 细弱, 嫩绿, 有效苗较少
9 1.5 0.5 6.82±0.57cd 粗壮, 绿色, 有效苗较多
植物生理学报244
2014)的研究结果一致。6-BA对愈伤组织分化作
用明显, 随着浓度升高, 愈伤组织分化率随之升高,
这与叶底红(Phyllagathis fordii) (蔡坤秀等2012)、
垂序香茅(Cymbopogon pendulus) (Bhattacharya等
2010)的研究结果一致。2,4-D对愈伤组织的分化
影响存在一定差异, 需要与一定的6-BA结合才能
产生促进作用, 王娟等(2012)对小叶龙竹(Dendro-
calamus barbatus)的研究也得到了相似的结果。
在不定芽增殖试验中, 6-BA和IBA组合使用
是常见的方法(Rehana等2009; Al Malki和Elmeer
2010; Zhang等2013)。在秀丽野海棠继代增殖培养
中, 添加6-BA和IBA能促进不定芽增殖, 前者的作
用大于后者。6-BA是影响秀丽野海棠不定芽增殖
的主导因子, 促进不定芽增殖, 随着浓度升高, 不
定芽增殖系数升高; 这与蜘蛛香(Valeriana jata-
mansi) (Chen等2014)、薜荔(Ficus pumila) (姜傲芳
等2007)中的研究结果相似。IBA对不定芽的壮苗
生长有促进作用, 随着IBA浓度的升高, 不定芽变
得粗壮, 叶片变绿。
NAA能够促进根系生长, 活性炭能够提供根
系生长所需的黑暗环境(周燕青等2013)。秀丽野
海棠不定芽容易生根, 各种处理下生根率均达到
100%。随着NAA浓度的上升, 根总长度、根总表
面积和根尖数呈现下降趋势, 根总体积表现为先
升高后降低的趋势, 可见, 高浓度的NAA对根系生
长有抑制作用, 但能够促进根系增粗生长。另外,
活性炭对根系形成有显著作用, 能提高不定芽的
根总长度和根总表面积。
表3 不同浓度NAA和活性炭对秀丽野海棠生根的影响
Table 3 Effects of different concentrations of NAA and activated carbon on rooting of B. amoena
处理编号 NAA浓度/mg·L-1 活性炭含量/g·L-1 生根率/% 根总长度/cm·株-1 根总表面积/cm2·株-1 根总体积/cm3·株-1 根尖数/个·株-1
1 0.1 0 100a 56.58±5.74b 4.06±0.42bc 0.05±0.01b 7.40±0.46c
2 0.2 0 100a 48.21±5.09bc 3.49±0.35cd 0.04±0.01bc 20.33±1.64a
3 0.3 0 100a 36.14±3.67e 4.14±0.42bc 0.08±0.01a 8.67±0.67c
4 0.5 0 100a 44.38±4.51cd 4.46±0.49b 0.08±0.01a 11.53±1.00b
5 1.0 0 100a 25.90±2.69f 2.79±0.28e 0.04±0.01bc 7.93±0.24c
6 0.5 1 100a 75.36±7.60a 5.97±0.65a 0.05±0.01b 7.60±0.40c
图1 秀丽野海棠叶片不定芽分化与植株再生
Fig.1 Adventitious shoot differentiation from leaves and plant regeneration of B. amoena
A: 叶片不定芽诱导; B和C: 茎段腋芽增殖初期; D和E: 壮苗生根培养; F: 移栽成活并大量抽芽的试管苗。
洪震等: 秀丽野海棠叶片不定芽高频再生体系的建立 245
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