全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月354
收稿 2010-01-07 修定 　2010-02-01
资助 国家科技支撑计划(2 008 BAD C0 B03 )、国家自然科学
基金(30871568)和安徽省自然科学基金(090411014)。
* 通讯作者(E-mail: jiangcj@ahau.edu.cn; Tel: 0551-5786982)。
茶树冷诱导基因RAV的克隆与表达特性分析
陈林波 1,2, 李叶云 1, 王琴 1, 高永亮 1, 江昌俊 1,*
1安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室, 合肥230064; 2云南省农业科学院茶叶研究所, 云南勐海 666201
提要: 对利用 cDNA-AFLP技术所获得的茶树低温诱导差异表达片段TDF, 通过RACE方法获得含完整编码区序列的茶树
RAV基因 cDNA克隆, 其开放阅读框编码361个氨基酸, 包含两个保守的结构域AP2和B3, 与多种植物RAV蛋白具有高度
同源性。qRT-PCR分析表明, 茶树 RAV基因受低温、乙烯、NaCl等上调表达, 最大表达量分别是诱导前的 5.8、10.0和
1.9倍。在成熟叶片、芽、嫩茎中 RAV基因表达量相近, 花蕾和嫩根中表达较低, 而在种子中不表达。推测该基因在组织
中的表达受到严格控制以及在响应非生物胁迫中发挥重要作用。
关键词: 茶树; RAV转录基因; 基因克隆; qRT-PCR; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of RAV Gene Related to Cold Stress from
Tea Plant [Camellia sinensis (L.) O. Kuntz]
CHEN Lin-Bo1,2, LI Ye-Yun1, WANG Qin1, GAO Yong-Liang1, JIANG Chang-Jun1,*
1Key Laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Anhui Agricultural University, Hefei 230064,
China; 2Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Science, Menghai, Yunnan 666201, China
Abstract: For a TDF, which has been gained from genes expressed differentially in tea plant under cold stress
using cDNA-AFLP, containing a complete coding sequence cDNA was cloned by RACE, named CsRAV, and
contains an ORF, which encodes a polypeptide of 361 amino acids including two conserved domains: AP2 and
B3. Sequence alignment showed that CsRAV protein shared high identity with other plants. qRT-PCR results
indicated that CsRAV was induced by cold, ethylene and NaCl, and maximum relative expression was 5.8, 10.0
and 1.9 times higher than before treatment, respectively. CsRAV gene expression level was closed in leave, bud
and stem, and lower in flower and root, not detected in seed. It shows the expression of the CsRAV might be
strictly controlled in different organs and plays an important role during abiotic stress in tea plant.
Key words: Camellia sinensis; RAV transcription factor; gene clone; qRT-PCR; expression analysis
低温是典型的环境胁迫因素之一, 不仅对植物
生长发育有重要的影响, 而且限制物种的栽种范
围。但植物对低温胁迫的响应并非是完全被动的
反应, 而是一种积极主动的应激过程(Weiser 1970;
Guy 等 1985)。目前已从拟南芥、大麦、苜蓿以
及水稻等多种植物中分离鉴定出多个低温诱导基
因。在众多冷诱导相关基因中, 转录因子在响应各
种逆境胁迫时起着重要作用(李洁 2004)。AP2/
EREBP家族是植物中普遍存在的一类重要转录因
子, 广泛参与植物逆境诱导信号转导, 受多种信号
分子的诱导, 主要调节植物对激素、病原、低
温、干旱及高盐等分子应答反应( Li u 等 1 99 8 ;
Riechmann 和 Meyerowitz 1998; Park 等 2001;
Sakuma 等 2002)。
茶树原产于我国西南部, 在温暖湿润、雨量
丰沛、日照短的南方气侯条件下, 形成了喜温畏寒
的特性。因此, 温度不仅限制了茶树的区域推广,
而且影响茶叶的产量和品质, 尤其是冻害严重时可
导致整株死亡。研究茶树对低温胁迫响应的相关
基因, 并对重要基因进行克隆和表达分析, 对了解
茶树抗寒分子机制和提高茶树抗寒性有着重要意
义。RAV是植物特有的一类含有两个不同的DNA
结合序列的转录因子, 其含有 AP2 结构域和 B3 结
构域(Kagaya等1999), 被划分为AP2/EREBP家族的
RAV 亚家族类(Nole 和 Krizek 2000)。目前也在拟
南芥、烟草、蓖麻、辣椒等多种植物中得到了
克隆(Sohn 等 2006; Chen 等 2009)。本研究对课题
植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月 355
组前期研究(利用 cDNA-AFLP 筛选茶树冷诱导相
关基因, 另文报道)中所获得茶树抗寒相关片段TDF
(transcript derived fragment), 通过 RACE (rapid am-
plification of cDNA ends)方法, 获得含完整编码区
序列的茶树 RAV 基因 cDNA 克隆。用 qRT-PCR
(quantitative RT-PCR)方法对其在各种非生物胁迫过
程以及在不同组织中表达特性进行了分析, 为研究
RAV 在茶树抗寒分子机理中的作用奠定基础。
材料与方法
以国家无性系茶树[Camellia sinensis (L.) O.
Kuntz]良种‘舒茶早’为实验材料。pMD18-T simple
Vector和SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit
为大连宝生物(TaKaRa)公司产品; RNAprep pure
Plant Kit和凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限
公司; EasyScript First-Strand cDNA Synthesis
SuperMix 和 TranStart Green qPCR SuperMix 购自
北京全式金生物技术有限公司; 引物合成与测序由
上海生工生物工程公司完成。
根据获得的TDF片段序列设计 3/5 RACE引
物(P1、P2)和一对特异引物(P3、P4)进行验证。
按 RACE 试剂盒的方法扩增出 RAV 基因的全长。
P1: 5-CAGCCGACCTTGTAAAACGAGCCAC-3, P2:
5-GCTGTTTGAAAAAGCCGTCACGCCTA-3; P3:
5-ATGGATGGTAGTTGCATAGATG-3, P4: 5-
CAAAGCTCCAATTACCCTTACT-3。
将测得的CsRAV cDNA序列与NCBI数据库中
推测的氨基酸序列进行Blast比对。用开放阅读框
(open reading frame, ORF)程序应用BioXM 2.6软件
进行多重序列比较和同源性分析, 预测蛋白的分子
量、等电点和氨基酸组成。用 Blast P 和 ht tp:
//swissmodel.expasy.org 网站预测蛋白保守区和二
级结构。
qRT-PCR分析非生物因子诱导基因表达时, 采
取安徽农业大学实验园内未受病虫侵害的同等成熟
度的茶树枝条进行如下处理: 4 ℃诱导(放置于光照
培养箱)、乙烯诱导(喷施 0.1% 乙烯溶液)、高盐
诱导(插入 300 mmol·L-1 NaCl溶液培养), 分别于 0、
3、6、9、12、24 h 后取样。在分析基因组织
表达特异性时, 取茶树成熟叶片、芽、嫩茎、花
蕾、果和嫩根, 取样后迅速放入液氮中冷冻, 然后
置-80 ℃冰箱保存备用。
样品总RNA的提取方法: 用2% CTAB裂解后
(江昌俊等2000), 参照TIANGEN RNAprep pure Plant
Kit 试剂盒说明书进行, 略有改动。用DU800紫外
分光光度计(美国Beckman公司)和1%的凝胶电泳,
对总 RNA进行定量和质量分析。cDNA合成按试
剂盒说明书进行。
qRT-PCR反应体系 25 μL, 扩增条件为 95 ℃ 3
min; 94 ℃ 5 s, 58 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环; 72 ℃
2 min。按相对定量法进行基因表达量的计算, 相
对表达量的比值 =2-ΔΔCt, 其中 ΔΔCt=ΔCt(测定样品)-
ΔCt(校准样本), ΔCt(测定样品)=Ct(测定样品目标基因)-Ct(测定样品参照基因),
ΔCt(校准样本)=Ct(校准样本目标基因)-Ct(校准样本参照基因)。以actin
为参照基因, 0 h 样品或叶片为校准样本。qRT-
PCR反应中P5 (5-ACTACATCGGCGGCTTCATA-
3)和P6 (5-TTAGCTTCCCCACGTCACTA-3)为扩
增 RAV 引物, P7 (5-GCCATCTTTGATTGGAA-
TGG-3)和P8 (5-GGTGCCACAACCTTGATCTT-3)
为扩增 actin 引物。
结果与讨论
1 含完整编码区序列的茶树RAV基因cDNA的克隆
以cDNA第一链为模板, 分别进行5端和3端
的扩增。测序结果可以看出, 由3RACE获得的688
bp 片段(图 1 - a )中含有聚腺苷酸加尾信号。由
5RACE获得的片段长度为594 bp (图1-b), 该序列
的第 1个 ATG距离该片段的 5端为 67 bp, 周围的
序列基本符合植物基因起始密码子的特点。将两
端序列和中间片段进行拼接得到一个 1 329 bp 的
cDNA序列。为了验证拼接所获得的基因cDNA序
列的正确性, 根据拼接得到的cDNA序列设计特异
图 1 茶树 RAV 基因 3RACE 及 5RACE 的扩增
Fig.1 Results of 3 RACE and 5 RACE for CsRAV
M: DL2000; a: 3RACE 产物; b: 5RACE 产物; c: 验证产物。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月356
引物, 经基因扩增与测序, 结果与拼接获得的cDNA
中所对应的序列完全一致(图1-c), 此序列含完整编
码区。将获得的 RAV 基因序列提交 GenBank, 获
取基因登录号为: GQ227992。
2 茶树RAV基因 cDNA序列和氨基酸序列分析
茶树 RAV 基因 cDNA 长 1 329 bp, 含有 1 083
bp的开放阅读框, 编码 361 个氨基酸, 编码蛋白质
理论分子量为 40.33 kDa, 等电点(pI) 9.68。在氨
基酸序列N端的第 69个氨基酸至 124个氨基酸之
间构成 AP2 的核心结构域, 内含有 RYG 元件、
RAYD 元件以及 WAAEIRD 盒子。而在氨基酸序
列C端有113个氨基酸组成的另一个保守序列B3结
构域(图 2)。结构预测表明, 在 AP2 结构域中含有
3 个 β- 折叠和 1个 α- 螺旋等二级结构, 在 B3结构
域中含有 7 个 β- 折叠和 3 个 α- 螺旋等二级结构。
氨基酸同源性比对显示, 茶树RAV与多种植物
的RAV蛋白有高度同源性, 与蓖麻RAV1 (GenBank
登录号: EEE38020)、辣椒 RAV (GenBank登录号:
AAW 8 34 7 3)、烟草 R AV ( GenB a nk 登录号:
ACF74549)和拟南芥 RAV1 (GenBank 登录号:
BAA34250)同源性分别为71%、65%、68%和63%
(图 3 )。
3 RAV基因的表达特性分析
为了研究CsRAV与各种非生物胁迫关系,分别
提取低温、乙烯、高盐处理后茶树新梢成熟叶片
的总RNA, 利用 qRT-PCR分析CsRAV基因在上述
处理中的表达特性。结果表明, 在低温处理(4 ℃)
3 h 后 RAV 表达量有所增加, 6~9 h 后表达量提高
到处理前的 4 倍, 12 h表达量达到最大, 提高了 5.8
倍, 随后有所下降, 但在24 h仍维持在较高水平(图
4-a)。乙烯喷施处理后 RAV 的表达量快速增加, 9
h到达最大, 为喷施前的 10.0 倍, 但之后逐渐下降,
图 2 茶树 RAV 核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
Fig.2 Analysis of sequence of nucleotide and its deduced amino acid for C. sinensis RAV gene
方框中为 DNA 结合位点区域 AP2 的结构域和 B3 结构域, 划线部分为 WAAEIRD 盒子, 括号里为 RYG 和 RAYD 元件。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月 357
图 4 qRT-PCR 分析非生物胁迫下茶树 RAV 基因的表达
Fig.4 Analysis of expressions of CsRAV gene with qRT-PCR under abiotic stresses
a: 4 ℃对 CsRAV 基因的表达影响; b: 0.1% 的乙烯对 CsRAV 基因的表达影响; c: 300 mmol·L-1 NaCl 对 CsRAV 基因的表达影响。
图 3 茶树RAV与其他RAV基因的氨基酸比对
Fig.3 Comparison of amino acid sequences of CsRAV with other reported RAV proteins
黑框为同源序列, RcRAV1 为蓖麻 RAV1 , CsRAV 为茶树 RAV, CaRAV 为辣椒 RAV, NtRAV 为烟草 RAV, AtRAV1 为拟南芥 RAV1。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月358
24 h几乎又回到喷施前水平(图 4-b)。高盐处理也
对 RAV 基因表达产生影响, 12 h 之内表达量提高
到处理前的1.9倍, 24 h后表达量反而受到抑制, 只
有处理前的 1/10 (图 4-c)。
4 RAV基因在不同组织器官中的表达分析
为进一步了解RAV基因的表达特性, 从茶树成
熟叶片、芽、嫩茎、花蕾、种子和嫩根中提取
总 RNA, 用 qRT-PCR 分析基因表达差异。如图 5
所示, 茶树 RAV 基因成熟叶片、芽、嫩茎表达量
相近, 而在花和嫩根中表达较低, 只有叶片的8%左
右, 在种子中不表达。这说明该基因具有组织特异
性, 在组织中的表达受到严格的控制。
2006)。尽管 RAV 能被低温、高盐等多种生物或
非生物胁迫诱导, 但该基因的功能以及所调控的下
游基因还不明确, 有待进一步研究。
参考文献
江昌俊, 王朝霞, 李叶云(2000). 茶树中提取总 RNA 的研究. 茶叶
科学, 20 (1): 27~29
李洁(2004). 植物转录因子与基因调控. 生物学通报, 39 (3): 9~11
Chen XF, Wang Z, Wang X, Dong J, Ren JZ, Gao HW (2009).
Isolation and characterization of GoRAV, a novel gene en-
coding a RAV-type protein in Galegae orientalis. Genes
Genet Syst, 84: 101~109
Guy CL, Niemi KJ, Brambl R (1985). Altered gene expression
during cold acclimation of spinach. Proc Natl Acad Sci USA,
82: 3673~3677
Kagaya Y, Ohmiya K, Hattori T (1999). RAV1 , a novel DNA-
binding protein, binds to bipartite recognition sequence
through two distinct DNA-binding domains uniquely found
in higher plants. Nucleic Acids Res, 27: 470~478
Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi SY,
Shinozaki K (1998). Two transcription factor DREB1 and
DREB2, with an EREBP/AP2 binding domain separate two
cellular signal transduction pathways in drought- and low-
temperature-responsive gene expression, respectively, in
Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391~1406
Nole WS, Krizek BA (2000). DNA binding properties of the
Arabidopsis floral development protein AINTEGUMENTA.
Nucleic Acids Res, 28 (21): 4076~4082
Park JM, Park CJ, Lee SB, Ham BK, Shin R, Paek KH (2001).
Overexpression of the tobacco tsil gene encoding an EREBP/
AP2-type transcription factor enhances resistance against
pathogen attack and osmotic stress in tobacco. Plant Cell,
13 (5): 1035~1046
Riechmann JL, Meyerowitz EM (1998). The AP2/EREBP family
coordinate gene activity in response to agents that induce of
plant transcription factors. Biol Chem, 379: 633~643
Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi
SK (2002). DNA-binding specificity of the ERF/AP2 do-
main of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved
in dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochem
Biophys Res Commun, 290 (3): 998~1009
Sohn KH, Lee SC, Jung HW, Hong JK, Hwang BK (2006).
Expression and functional roles of the pepper pathogen-
induced transcription factor RAV1 in bacteria l disease
resistance, and drought and salt stress tolerance. Plant Mol
Biol, 61: 897~915
Weiser CJ (1970). Cold resistance and injury in woody plants.
Science, 169: 1269~1273
图 5 RAV 基因在不同器官的表达分析
Fig.5 Analysis of expressions of CsRAV in different organ
总之, 本文中利用RACE获得含完整编码区的
茶树RAV基因的cDNA序列, 经同源序列分析结果
显示, 该基因含有 AP2 和 B3 结构域, 属于 AP2/
EREBP家族的RAV亚家族类(Nole和Krizek 2000)。
qRT-PCR 分析表明, 该基因受多种胁迫诱导, 并具
有组织特异性。因此可以推测该基因在组织中的
表达受到严格控制以及在响应非生物胁迫中发挥重
要作用。同时也证实了 cDNA-AFLP 分析结果是
可靠的, 这也表明RAV基因可能与茶树抗寒性密切
相关。Chen 等(2009)报道东方山羊豆(Galegae
orientalis) RAV基因在低温诱导后表达量稳定增加,
24 h 达到最大, 被高盐诱导后增加不明显, 在茎中
表达量最高, 而在根中不表达等, 这可能是不同植
物间对外界胁迫响应程度和反应时间不一样。
RAV 基因也能被病原菌等生物胁迫诱导(Sohn 等