全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (11): 1091~1095 1091
收稿 2011-06-23　　修定 2011-10-09
资助 贵州省科技厅社会发展公关项目(Z083055) 。
* 通讯作者(E-mail: xg335300@yahoo.com.cn; Tel: 0851-
8292170)。
氮离子注入对麻疯树幼苗抗氧化能力的影响
徐刚1,*, 甘彩玲2, 方艳琼2, 张萌2
贵州大学1精细化工研究开发中心/绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室, 2生命科学学院, 贵阳550025
摘要: 本文分析了能量为25 kev的不同剂量N+对麻疯树种子萌发和幼苗的抗氧化能力的影响。结果表明N+注入降低了麻
疯树种子的发芽率和成苗率以及幼苗的SOD和APX活性和MDA含量, 增强了CAT活性。6×1016~9×1016 N+·cm-2的剂量增加
了还原型抗坏血酸含量, 12×1016~15×1016 N+·cm-2的剂量降低了总抗氧化能力, 但增强了POD活性。18×1016 N+·cm-2可能是
能量为25 kev 的N+诱变麻疯树干种子的合适剂量。
关键词: 麻疯树; 低能氮离子注入; 种子萌发; 抗氧化能力
Effects of Nitrogen Ion Implantation on Antioxidant Capacity of Seedlings of
Jatropha curcas L
XU Gang1,*, GAN Cai-Ling2, FANG Yan-Qiong2, ZHANG Meng2
1Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, Chinese Ministry of Education, Center for Research and
Development of Fine Chemicals, 2College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China
Abstract: This paper analyzed the effects of different doses of N+ with energy of 25 kev on the seed germina-
tion and seedling antioxidant capacity of Jatropha curcas. The results showed that N+ implantation decreased
seed germination rates, seedling rates, activities of SOD and APX and MDA content in seedlings, but increased
CAT activity. The dose of 6×1016-9×1016 N+·cm-2 increased HAsA content, and the dose of 12×1016-15×1016
N+·cm-2 reduced the total antioxidant capacity, but enhanced POD activity. The dose of 18×016 N+·cm-2 might be
optimum for seed mutagenesis of Jatropha curcas.
Key words: Jatropha curcas; low energy nitrogen ion implantation; seed germination; antioxidant capacity
麻疯树种子含油量高, 可提炼生物柴油, 且其
综合利用价值高, 对土壤要求不高, 是一种优良的
能源树种。我国和贵州省都把它当作发展生物柴
油的重要原料。由于原材料的严重短缺, 我国生
物柴油年产量只为产能的1/30。目前, 我国麻疯树
单产很低, 亩产300~400 kg, 种植经济效益较低, 老
百姓和地方政府的种植麻疯树的积极性很低, 这
严重阻碍了麻疯树种植业和生物柴油产业的发
展。麻疯树优质高产良种的选育显得极其迫切。
目前, 离子注入技术已广泛应用于水稻、小麦、
玉米、棉花、蔬菜、瓜果、花卉等作物并已初见
成效。研究表明低能离子注入引起的生物学效应
比较复杂, 而活性氧在其中起着不可缺少的作用
(Chen等2010)。在低能离子注入下, 抗氧化能力的
增强有助于提高生物体的成活率, 且和存活率的
马鞍型曲线变化存在一定关系(Zhang和Yu 2008;
Chen等2010)。本文根据前期研究结果(未发表),
选定能量为25 kev的N离子, 研究了6个不同注入剂
量对麻疯树种子萌发和抗氧化系统的影响, 探寻
种子成苗率和抗氧化系统之间的关系, 以期为等
离子注入诱变选育麻疯树优良品种提供指导。
材料与方法
麻疯树(Jatropha curcas L.)种子采自贵州省贞
丰县的同一母树。将干麻疯树种子在种胚部位剥
去种皮, 在南京工业大学离子束生物工程实验室
用氮离子注入处理。处理的离子束能量为25 kev,
剂量分别为3×1016、6×1016、9×1016、12×1016、
15×1016和18×1016 N+·cm-2 。处理好的种子于室温
下浸泡在蒸馏水中24 h。然后捞起晾干水分, 在人
工气候室里播种让其萌发。基质由珍珠沙和蛭石
(1:1)组成, 温度(25±1) ℃、湿度75%, 光照时间12 h·d-1,
光强为100 μmol·m-2·s-1; 每个处理3个重复, 每个重
复40粒种子。播种15 d后记录发芽率, 1个月后记
植物生理学报1092
录成苗率。采集完全伸展开的绿色嫩叶进行抗氧
化物质含量和酶活性等生理生化指标分析。
超氧物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活
性的测定采用氮蓝四唑光化还原法(Giannopolitis
和Ries 1977), 以抑制NBT光化还原50%的所需的
酶量为1个酶活力单位。过氧化氢酶(catalase,
CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,
APX)活性测定采用紫外吸收法(Beer和Sizer 1952;
Nakano和Asasa 1981)。过氧化物酶(peroxidase,
P O D )活性的测定采用愈创木酚法 ( Z h a n g等
1995)。总抗氧化能力和H2O2 含量采用南京建成
试剂盒测定, 还原型抗坏血酸(reduced ascorbate
acid, HAsA)含量的测定采用Zhang和Kirkham
(1996)的方法。酶粗提液的可溶性蛋白质含量测
定按照Bradford (1976)的方法, 酶的活性单位表示
为每毫克蛋白所含酶活性单位数。叶片丙二醛
(malondialdehyde, MDA)含量采用Krame等(1991)
所描述的方法。实验所得数据用SPSS进行One-
Way ANOVA分析。
实验结果
1 不同氮离子剂量处理对种子萌发率和成苗率的
影响
低能氮离子注入大幅度降低了麻疯树种子的
发芽率和成苗率。在低能氮离子注入下, 发芽率
和成苗率开始急剧下降, 并在剂量为3×1016 N+·cm2
时下降至最低水平(20.8%和16.4%); 随着剂量的增
加, 这两者开始上升, 在剂量为6×1016 N+·cm2时达
到峰值(46.7%和35.5%), 但仍显著低于对照; 随之, 两
者缓慢下降, 在剂量为12×1016和15×1016 N+·cm-2时
到达谷底; 之后两者又上升(图1)。
2 不同氮离子剂量对幼苗总抗氧化能力、H2O2和
MDA含量的影响
经低能离子注入处理的麻疯树种子的总抗氧
化能力呈现“升-降-升”的变化趋势(图2-A)。随着
低能离子注入剂量的增加, 总抗氧化能力先是大
幅度上升, 并在剂量为9×1016 N+·cm-2时, 达到峰值
[(242 U·g-1 (FW)], 然后急剧下降; 在剂量为15×1016
N+·cm-2时, 下降到最低水平[(74.59 U·g-1 (FW)], 随
后开始上升; 在剂量为18×1016 N+·cm-2时上升至第
二高水平。H2O2作为一种活性氧, 其含量可作为
植物体内氧化胁迫强度的一个指标。在低能离子
注入下, 其变化趋势大体上和总抗氧化能力的相
图1 N+注入对种子的发芽率和成苗率的影响
Fig.1 Effects of nitrogen ion implantation on the germination
rates and seedling rates of seeds
图中数值是3数平均值±标准差, 下图同此。
图2 N+注入对幼苗的总抗氧化能力、叶片H2O2和MDA含量的影响
Fig.2 Effect of nitrogen ion implantation on the total antioxidant capacity, the H2O2 and MDA contents of leaves in seedlings
徐刚等: 氮离子注入对麻疯树幼苗抗氧化能力的影响 1093
近。在剂量为3×1016 N+·cm-2时, H2O2含量有1个不
显著的下降, 然后随着处理剂量的增加而上升; 当
剂量增加到9×1016 N+·cm-2时 , 到达峰值[178.2
μmol·g-1 (FW)], 随后开始急剧下降; 在剂量为
15×1016 N+·cm-2时, 达到最低水平[33.6 μmol·g-1
(FW)]; 在剂量为18×1016 N+·cm-2时, 回升到对照水
平[103 μmol·g-1 (FW)] (图2-B)。此外, MDA是细胞
膜脂过氧化作用的产物之一, 其含量的高低代表
细胞损伤的程度, 间接反映了植物组织抗氧化能
力的大小。低能离子注入显著降低了叶片MDA含
量, 当剂量为9×1016 N+·cm-2时, MDA达到谷底
[0.024 μmol·g-1 (FW)], 之后上升, 有1个小高峰(图
2-C)。
3 不同氮离子剂量对幼苗总抗氧化性酶活性和叶
片HAsA含量的影响
低能离子注入处理下, 麻疯树幼苗的SOD活
性呈“W”型变化趋势。在剂量6×1016 N+·cm-2时, 达
到第1个谷底[(121.52 U·mg-1 (蛋白)], 在剂量为
9×1016 N+·cm-2时回升至峰值[196.9 U·mg-1 (蛋白)],
之后在15×1016 N+·cm-2时, 达到第2个谷底[(86.4
U·mg-1 (蛋白)], 然后有一个较大幅度回升, 但仍低
于对照(图3-A)。低能离子注入显著抑制了幼苗的
APX活性。在剂量为3×1016 N+·cm-2, 其活性显著下
降; 但在剂量为6×1016 N+·cm-2时, 回升至对照水平
[(12.5 U·mg-1 (蛋白)], 随后开始下降; 在15×1016
N+·cm-2时达到最低值[(3.77 U·mg-1 (蛋白)]; 在剂量
为18×1016 N+·cm2时, 又有个较大幅度的提升(图
3-B)。CAT活性随着氮离子剂量的增加而加强, 并
在剂量为6×1016 N+·cm-2时到达高峰[(0.62 U·mg-1
(蛋白)], 随后下降; 在剂量为15×1016 N+·cm-2时, 到
达低谷, 并和对照处在同一水平[(0.17 U·mg-1 (蛋
白)]; 然后其活性上升至第二高水平(图3-C)。低能
图3 N+注入对幼苗的SOD、APX、CAT和POD活性的影响
Fig.3 Effect of nitrogen ion implantation on activities of SOD, APX, CAT and POD in seedlings
植物生理学报1094
离子注入处理下, 幼苗POD活性变化比较特殊。
剂量为3×1016 N+·cm-2时, POD活性有一个不显著的
上升; 在剂量6×1016~ 9×1016 N+·cm-2时, 下降至最低
值[(0.49 U·mg-1 (蛋白)]; 当剂量增加至12×1016
N+·cm-2时, 又大幅度上升至高峰[(1.06 U·mg-1 (蛋
白)], 并显著高于对照; 随后其活性缓慢下降; 在剂
量为18×1016 N+·cm-2时, 活性下降至对照水平[(0.74
U·mg-1 (蛋白)] (图3-d)。
低能离子注入处理下, HAsA含量变化呈“降-
升-降-升”趋势(图4)。在剂量为3×1016 N+·cm-2 时,
其含量显著下降, 达到0.70 mg·g-1 (FW), 随后大幅
度上升; 在剂量为9×1016 N+·cm-2时, 达到峰值[1.10
mg·g-1(FW)]并高于对照, 然后急剧下降; 在12×1016
N+·cm-2剂量时下降至最低水平[(0.52 mg·g-1 (FW)];
之后再次缓慢回升(图4)。
1995)、自我修复模型(黄卫东和余增亮1997)和碎
片重组修复模型(韩建伟和余增亮1998)等。龚加
顺等(1999)认为随着N+注入剂量的增加, 原来稳定
的长寿命自由基变得不稳定, 或者经逐级反应变
成非自由基粒子, 因而导致自由基的含量降低, 因
而自由基强度随注入N+ 剂量的增加而呈“马鞍型”
曲线变化。H2O2作为自由基的歧化产物, 其马鞍
形曲线变化模式可能与自由基含量变化的有关。
低能量N+注入下大幅度降低了麻疯树种子的
发芽率和成苗率, 而抗氧化系统在缓解离子注入
造成的伤害, 提高种子发芽率和成苗率等方面起
了重要作用。总抗氧化能力的增强有效控制了增
强的氧化胁迫对植物细胞的伤害, 这表现在叶片
MDA含量的降低(图2-C), 这与陆佳等(2008)对仿
栗种子的研究结果类似。此外, 低剂量的低能离
子注入对种子的存活率和生长具有促进或抑制作
用(Yu 2006)。但在本实验(图1)中, 低剂量(3×1016
N+·cm-2)的离子注入降低发芽率和成苗率可能不是
因为伤害 , 其内在机制还需进一步研究。Li等
(2011)认为低剂量离子到达细胞质, 并在细胞质中
发生质量、能量沉积效应, 对细胞骨架产生伤害,
对核酸产生间接伤害, 这可导致细胞死亡; 随着注
入剂量的增加, 更多的离子到达核酸发生质荷沉
积效应, 从而对核酸产生直接伤害, 这也是对细胞
造成伤害的主要原因, 但同时也激活了细胞的自
我修复系统。在本文中, 剂量高于6×1016 N+·cm-2
时, 离子注入可能对核酸造成了直接伤害, 从而导
致发芽率和成苗率下降。在剂量增加至15×1016
N+·cm-2时, 麻疯树种子受到伤害最严重, 发芽率和
成苗率也降低至最低水平, 幼苗的抗氧化体系已
经受到严重的破坏, 抗氧化性酶(SOD、APX和
CAT)活性、HAsA含量和总抗氧化能力处在最低
水平, MDA含量也上升至峰值。当在剂量继续升
高为18×1016 N+·cm-2时, 麻疯树种子的自我修复系
统可能被激活了, 总抗氧化能力和抗氧化性酶活
性增强、HAsA含量增加, 发芽率和成苗率也随之
回升。修复机制的看法目前还存在分歧, 黄卫东
和余增亮(1997)认为靶分子的反冲原子本身修复
了靶分子的损伤; 而韩建伟和余增亮(1998)认为辐
照过程中, 高密度的损伤分子碎片发生重组、化
合; 而邵春林和余增亮(1997)认为质荷效应对DNA
讨　　论
低能离子注入植物种子, 发生能量沉积、质
量沉积和电荷交换等效应, 引起的生物效应十分
复杂。其不仅可影响植物细胞的生理生化功能,
还可改变细胞中的遗传物质。离子注入引起的生
物效应的复杂性也体现在本实验中。随着N+注入
剂量的增加, 麻疯树的发芽率、成苗率、抗过氧
化性酶活性、总抗氧化能力和HAsA含量成马鞍
形曲线变化。以前的研究也报道过类似的结果(Yu
2006; 宋道军等1998)。针对马鞍形曲线出现的机
理有多种假说, 如质量效应模型假说(邵春林等
图4 N+注入对幼苗HAsA含量的影响
Fig. 4 Effect of nitrogen ion implantation on
HAsA content in seedling
徐刚等: 氮离子注入对麻疯树幼苗抗氧化能力的影响 1095
具有间接的辐射保护作用。 此外, 一些研究结果
表明, 低能离子注入时, 最高突变率往往与生物体
受到严重伤害后(或发生生物修复后)出现的存活
率峰值有关(Li等2011; Zhang等2010)。也有人认
为导致存活率在20%~30%范围的离子剂量就是诱
导突变率最高的剂量(Su等2006)。就本实验结果
看来, 剂量为18×1016 N+·cm-2 (成苗率为31.2%)可能就
是麻疯树干种子诱变育种的最佳剂量。
SOD在把O-2转化为H2O2起重要作用, 而CAT
和APX主要功能是清除H2O2, POD在清除H2O2方
面也起一定作用。从结果(图3)来看, 低能离子注
入显著抑制了麻疯树幼苗SOD和APX的活性, 大
幅度增强了CAT的活性。据此推测, 在低能离子注
入下, 麻疯树幼苗很可能主要通过其他途径来清
除O-2, 以补偿SOD活性的丧失, 比如增加HAsA含
量(图4)。HAsA在植物体内, 是一种重要的保护物
质, 除了在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中起重要作用
外, 还能直接清除O-2和OH-
(Gill和Tuteja 2010)。在
清除低能离子注入产生的H2O2方面, CAT可能起着
关键作用。而在麻疯树种子受到严重伤害, 其他
的抗氧化性酶活性、总抗氧化能力和HAsA含量
大幅度降低的情况下, POD活性在剂量为12×1016
上升至最高水平, 可能在起重要作用。此外, CAT
活性和HAsA含量变化趋势与总抗氧化能力的大
致相近, 这表明这两者, 尤其是CAT对总抗氧化能
力的增强起重要作用。
参考文献
龚加顺, 刘勤晋, 肖卫林(1999). 单宁酵母产生菌氮离子注人诱变效
应研究. 食品与发酵工业, 26 (5): 10~13
韩建伟, 余增亮(1998). KeV离子辐照丙氨酸的剂量效应研究. 生物
物理学报, 14 (2): 341~345
黄卫东, 余增亮(1997). 低能离子辐照苏氨酸的初步研究. 生物物理
学报, 13 (2): 250~254
陆佳, 李志辉, 张斌, 李昌珠, 欧日明(2008). 氮离子注入对仿栗种子
当代生理生化性状的影响. 核农学报, 22 (5): 617~620
邵春林, 吴跃进, 程备久, 桂启富, 余增亮(1995). 低能离子辐照生物
体存活率剂量效应的质量效应模型. 核农学报, 9 (1): 37~41
邵春林, 余增亮(1997). 离子束辐照下微生物, 植物组织的存活模型
的研究. 核技术, 20 (7): 423~430
宋道军, 李红, 余增亮(1998). N+离子注入不同辐射敏感性微生物
超氧化物歧化酶SOD, 过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD活
性的影响. 生物物理学报, 14 (2): 325 ~329
Beer RF, Sizer IW (1952). A spectrophotometric method for measur-
ing the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol
Chem, 195: 133~140
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for quantifica-
tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248~254
Chen H, Li FH, Yuan H, Xiao X, Yang G, Wu LJ (2010). Abscopal
signals mediatedbio-effects in low-energyIon irradiated Medi-
cago truncatula seeds. J Radiat Res, 51: 651~656
Giannopolitis CN, Ries SK (1977). Superoxide dismutase in higher
plants. Plant Physiol, 59: 309~314
Gill SS, Tuteja N (2010). Reactive oxygen species and antioxidant
machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiol
Biochem, 48: 909~930
Kramer GF, Norman HA, Krizek DT, Mirecki RM (1991). Influence
of UV-B radiation on polyamines, lipid peroxidation and mem-
brane lipid in cucumber. Phytochemistry, 30: 2101~2108
Li SC, Zhu ZY, Gu SB, Liu HX, Wang DD (2011). Application of
response surface methodology (RSM) for optimization of high-
yielding L-lactic acid strains selected by low-energy ion implan-
tation. African J Food Sci Technol, 2 (6): 120~131
Nakano Y, Asada K (1981). Hydrogen peroxide is scavenged by
ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell
Physiol, 22: 867~880
Su CX, Zhou W, Fan YH, Wang L, Zhao SG, Yu ZL (2006). Muta-
tion breeding of chitosanase-producing strain Bacillus sp. S65
by low energy ion implantation. J Ind Microbiol Biot, 33 (12):
1037~1042
Yu ZL (2006). Biological effect of ion implantation. In: Introduction
to Ion Beam Biotechnology. Springer, New York, 141~156
Zhang J, Cui S, Li J, Kirkham MB (1995). Protoplasmic factors,
antoxidant responses, and chilling resistance in maize. Plant
Physiol Biochem, 33: 567~575
Zhang J, Kirkham MB (1996). Antioxidant responses to drought
in sunflower and sorghum seedlings. New Phytologist, 132:
361~373
Zhang N, Yu L (2008). Effect of N+ ion implantation on antioxidase
activity in Blakeslea trispora. Radiat Phys Chem, 77 (9):
1046~1049
Zhang XL, Lin BR, Gao XY, Shen HF (2010). Enhancement of wan-
longmycin production by nitrogen ion beam Implantation. Elec-
tron J Biotechn, 13 (1): 1~6