全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (12): 1200~12041200
收稿 2012-11-14　　修定 2012-11-29
资助 海南省自然科学基金(808191)和博士启动基金(PZSb0806
和PZSb0604)。
* 通讯作者(E-mail: xllzy@263.net; Tel: 13707599006)。
‘阿蒂擎天’凤梨钾转运体基因的克隆与乙烯诱导表达特性的初步分析
丛汉卿1,2, 信彩云3, 张银东1, 李志英2,3, 徐立2,*
1海南大学农学院, 海口570228; 2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 农业部热带作物种质资源利用重点开放实
验室, 海南儋州571737; 3南京农业大学园艺学院, 南京210095
摘要: 在以‘阿蒂擎天’凤梨乙烯处理和不处理的植株为材料建立的抑制性差减杂交文库中, 筛选到的一个被乙烯诱导并与
已知植物钾转运体(potassium transporter)同源的cDNA片段, 通过RACE技术得到该基因的全长cDNA序列。生物信息学分
析表明, 该基因可能属于K+转运体超家族中的成员。利用半定量RT-PCR检测该基因的表达量在乙烯处理6 h会显著升高,
然后下降, 推测其受乙烯信号诱导, 并在后续一系列生理生化变化中发挥作用。
关键词: 钾转运体; ‘阿蒂擎天’; 乙烯; 克隆; 表达分析
Cloning of Potassium Transporter Gene and Primary Expression Analysis In-
duced by Ethylene in Guzmania wittmackii ‘Attila’
CONG Han-Qing1,2, XIN Cai-Yun3, ZHANG Yin-Dong1, LI Zhi-Ying2,3, XU Li2,*
1Agriculture College, Hainan University, Haikou 570228, China; 2Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Utili-
zation, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Crop Genetic Resources, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Danzhou, Hainan 571737, China; 3Horticulture College, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: A cDNA fragment homologue of the known plant potassium transporter was screened in the suppres-
sion subtractive hybridization (SSH) library with ethylene treated and untreated Guzmania wittmackii ‘Attila’
plants as the material. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) was used to obtain the full length cDNA.
Bioinformatics analysis results suggested that the gene belongs to K+ trans superfamily. Semi-quantitative RT-
PCR results indicated that the expression of this gene increased significantly in 6 h and then decreased after
ethylene treatment, which suggested it could be induced by ethylene signal, and may play an important role in
the subsequent physiological and biochemical processes.
Key words: potassium transporter; Guzmania wittmackii ‘Attila’; ethylene; cloning; expression analysis
钾(K+)是植物中含量最大的重要营养元素, 是
非盐生植物中最丰富的无机阳离子, 占植物总干
重的10%。在植物中, 直接证据表明, 钾涉及根冠
的生长、向性运动、细胞膨胀、酶的动态平衡、
盐胁迫、气孔运动、信号转导以及渗透调节等生
命活动(Mäser等2001; Very和Sentenac 2003; Zim-
mermann和Sentenac 1999)。
到目前为止, 已经克隆的K+吸收转运基因可
以分为K+转运体和K+通道两大类型(Very和Senten-
ac 2003)。通常情况下, K+转运体蛋白承担了植物
对K+的高亲和吸收转运, 而K+通道蛋白则承担植
物对K+的低亲和吸收转运(Gierth等2005), 一般情
况下低钾浓度范围 (250~500 mmol·L-1)起作用的是
高亲和性吸收机制; 高钾浓度范围(500 mmol·L-1以
上)起作用的是低亲和性吸收机制(王卿卿和赵云
云2006)。就这两大类型的K+吸收转运基因而言,
K+通道基因的研究较为深入, 而高亲和K+吸收转
运体基因无论是克隆的基因数量还是研究的深入
程度都不够。另有研究表明, 植物在生长发育过
程中, 其根际土壤经常处于钾供应不足的状态, 因
此植物高亲和K+吸收转运体基因在植物的钾营养
中往往发挥着更重要的作用(Ashley等2006)。
乙烯(ethylene)作为一种重要的植物激素, 可
以引起植物广泛的生理效应及形态建成, 如种子
萌发、偏上生长、器官衰老与脱落、果实成熟、
对环境胁迫反应等。调控果实后熟、促进衰老和
器官脱落的多种酶和伤害诱导的防御反应蛋白的
丛汉卿等: ‘阿蒂擎天’凤梨钾转运体基因的克隆与乙烯诱导表达特性的初步分析 1201
基因都含有受乙烯调控的启动元件(Bleecker和
Kende 2000)。研究表明, 乙烯可以影响到低钾胁
迫的信号传递(Ho和Tasy 2010): 低钾离子水平将激
活植物体内乙烯和钙离子信号, 随之一方面增强
CIPK (CBL-interacting protein kinase, CIPK)的表达
激活K+通道基因, 另一方面上调活性氧(reactive
oxygen species, ROS)的水平刺激根毛的伸长和K+转
运体基因的表达, 最终提高对外界钾元素的摄取。
‘阿蒂擎天’是凤梨科(Bromeliaceae)果子蔓属
(Guzmania)植物, 是常见的观赏凤梨, 因生长缓慢,
营养生长期长, 为适应市场需求, 一般采用人工诱
导开花技术, 由于乙烯诱导凤梨科植物开花的效果
非常明显, 故一般采用乙烯利及其类似物进行诱
导促使其开花(Bernier等1993)。实践证明对凤梨
科植物进行乙烯利灌心处理, 可使其提前开花, 并
且花期一致(梁东成和黄万和2005)。我们在前期
工作中, 曾以‘阿蒂擎天’凤梨乙烯处理后植株和未
处理的植株为实验组和对照, 构建了抑制差减杂交
(SSH)文库(信彩云等2010)。本实验中, 我们从文
库中筛选到了一个编号为A347长度为304 bp的钾
转运体(potassium transporter, PT)基因片段, 旨在对
其进行克隆和表达分析, 并初步探索乙烯信号与
钾转运体基因表达变化的关系, 为进一步研究其如
何在后续开花过程中所发挥的作用奠定了基础。
材料与方法
1 材料
‘阿蒂擎天’凤梨(Guzmania wittmackii ‘Attila’),
来自中国热带农业科学研究院热带作物品种资源
研究所试验基地。选取发育完全、生长良好、株
型一致的植株, 即具有20叶龄以上的植株, 用5 mL
400 ppm的乙烯利灌心处理, 1 d后倒净, 并用清水
冲洗; 以清水灌心为对照。取对照和处理后1 h、6
h、24 h的植株心叶(编号分别为0 h、1 h、6 h、24
h), 液氮冷冻后–80℃保存。
2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成
总RNA的提取使用CTAB法, 使用DNase I
(TAKARA) 去除RNA中残留DNA, cDNA第一链合
成使用SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (In-
vitrogen), 步骤按操作说明书。
3 5′RACE和3′RACE
以总RNA为材料, 利用SMARTTM PCR cDNA
Amplification Kit (Clontech)合成5′RACE和3′RACE
的模板, 按试剂盒操作说明书扩增基因的5′和3′端
序列。PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检
测, 特异扩增条带经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
(Tiangen)回收纯化后克隆到pMD-18T克隆载体
(TaKaRa)上, 进行测序。用Primer premier 5.0软件
设计PT基因5′RACE和3′RACE的各两对巢式引物
如下:
3′RACE外侧引物: 5′-CATTGTGTTAGTTG-
GACTTTTTGCTTT-3′;
3′RACE内侧引物: 5′-GCTTTTTCTCCACAT-
TACATTTTT-3′;
5′RACE外侧引物: 5′-TAAAAATGTAATGTG-
GAGAAAAAGC-3′;
5′RACE内侧引物: 5′-TAAAGCAAAAAGTC-
CAACTAACACAATG-3′。
4 基因序列分析
使用ORF Finder在线工具(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)预测此基因的阅读框架,
使用BLAST工具对预测的氨基酸序列进行比对分
析, 用DNAMAN软件进行氨基酸序列拼接及比对,
用PortParam (http://www.expasy.org/tools/protparam.
html)预测其蛋白分子量和等电点, 用TMHMM
Server在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM/)进行跨膜区预测, 用WoLF PSORT在线
工具(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)进行亚细胞定位
预测。
5 半定量RT-PCR
利用半定量RT-PCR检测部分基因在植株中
的表达情况, 以对照和不同处理阶段为材料, 所有
的RT-PCR反应均来自同一批反转录的cDNA产物
且重复3次, Actin为内参, PCR扩增产物使用1%的
琼脂糖凝胶电泳检测。所用钾转运体基因及Actin
的引物为Primer premier 5.0软件设计, 序列如下:
PT正向引物: 5′-CATCTTTCCCGGTCTTCT-
TG-3′;
PT反向引物: 5′-TTGCATTCATGTTTGCAC-
CT-3′;
actin正向引物: 5′-CATGAAGATCAAGG-
TCGTCG-3′;
actin反向引物: 5′-ACTTCCGGTGAACAAT-
GGAC-3′。
植物生理学报1202
实验结果
1 RNA提取
提取的0 h、1 h、6 h、24 h样品总RNA经核
酸蛋白仪检测, 其A260/A280在1.8~2.0之间; 用1%的
琼脂糖凝胶进行电泳检测总RNA的完整性较好(图
1), 能够满足后续试验的需要。
测大小相符的条带 (图2-B), 回收产物后连接转化
测序。经序列拼接, 得到长度为3 162 bp的序列。
3 钾转运体基因序列分析
克隆到的基因全长3 162 bp, 编码339个氨基
酸, 分别通过BLASTn和BLASTp同源性比对, 分析
表明该基因属于K+转运体超家族, 其蛋白序列与
多种作物的钾转运蛋白中KUP/HAK/KT家族基因
具有较高同源性, 因此推断该cDNA序列为编码‘阿
蒂擎天’ 凤梨钾转运体的全长cDNA序列。其氨基
酸序列与拟南芥钾转运体KUP3p (AAF19432.2),
水稻的钾转运体HAK2 (BAD87252.1)和大麦的钾
转运体HAK2 (AAF36491.1)的同源性比对如图3。
2 钾转运体基因的获取
以SSH文库筛选的序列A347为基础 , 通过
RACE延伸在1 500 bp处获得与5′端片段预测大小
相符的条带(图2-A), 1 300 bp处获得与3′端片段预
图2 钾转运体蛋白基因(A347)克隆
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PT (A347) RACE
图1 对照和不同处理时间总 RNA电泳结果
Fig.1 Electrophoresis of the control and the treated total RNA
图3 钾转运体(A347)与拟南芥钾转运体蛋白KUP及水稻和大麦HAK转运体氨基酸编码同源性比较
Fig.3 The amino acid sequence comparison of PT (A347) with the KUP in Arabidopsis and HAK in rice and barley
AT: 拟南芥(Arabidopsis thaliana); HV: 大麦(Hordeum vulgare); OS: 水稻(Oryza sativa)。
丛汉卿等: ‘阿蒂擎天’凤梨钾转运体基因的克隆与乙烯诱导表达特性的初步分析 1203
用ProtParam预测其蛋白分子量是37 161.3 Da, 理
论等电点PI为5.42。跨膜区分析显示此蛋白可能
13次跨膜(图4)。生物信息学预测表明, 此PT有可
能定位在质膜上。
4 乙烯诱导钾转运体表达水平变化
半定量RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检
测(图5-A)。利用ImageJ软件计算电泳条带平均灰
度, 结合条带面积, 将其转化为总光密度(OD)后,
图5 钾转运体 (PT) 半定量PCR检测结果
Fig.5 The result of PT semi-quantity RT-PCR
根据PT和Actin的总光密度值的比值对结果进行量
化, 结果表明钾转运体基因在0 h和1 h的材料中略
低, 而6 h的表达量相对较高, 24 h又恢复原水平(图
5-B)。
讨　　论
本实验所获得的‘阿蒂擎天’ (G. wittmackii
‘Attila’)凤梨的PT基因, 可以认定为在凤梨科植物
中新克隆到的一个钾转运体KUP/HAK/KT家族成
员(Gierth等2005), 其可能负责高亲和性钾吸收。
此基因在乙烯处理后表达量的升高可能意味着钾
离子吸收能力的增强。
Jung等(2009)提出了拟南芥中钾缺乏对乙烯
信号影响的模式图: 过低的钾离子浓度将会提高
内源乙烯的合成, 进而上调根部ROS产物的水平,
ROS的增加能够抑制主根的延伸, 促进根毛的伸
长, 并促进K+转运体和K+通道基因的表达, 最终提
高对外界钾离子的摄取能力以提高植物耐受性。
这一过程在棉花上也得到了验证: 乙烯参加了棉
花侧根的形成和根系的伸长等生长过程, 在钾缺
乏条件下, 可以提高内源乙烯释放量, 在一定程度
上抑制了根系的伸长(张志勇等2011)。根据此模
式, 我们可知位于ROS产物上游的内源乙烯合成的
增加, 可导致钾转运体表达的增强。同时最近研
究发现, 植物对外源乙烯信号的响应是通过MAPK
级联反应参与内源乙烯的合成来完成的(An等
图4 钾转运体的跨膜区预测
Fig.4 Speculation of transmembrane of PT
植物生理学报1204
2010; Yoo等2008)。故我们推测‘阿蒂擎天’凤梨乙
烯处理后钾转运体基因表达量的上升, 是因为外
源乙烯信号在转化为内源乙烯后, 促进了ROS的积
累, 从而上调了下游的K+转运体基因。除此之外,
乙烯还有可能参与了其他生理生化过程, 例如它
可以和一氧化氮能够协同作用刺激植物细胞质膜
H+-ATPase的活性, 以调控离子平衡以提高盐耐受
性(Wang等2009)。
凤梨科植物对外源乙烯信号具有开花响应。
根据“诱导愈伤反应的假说”: 一般植物在遇到不良
环境或受到伤害时, 便会增加体内乙烯, 这种乙烯
被称为创伤乙烯或应激诱导乙烯。它作为动员贮
备物质的化学信号向周围组织传递, 引起愈伤反
应, 使水分与养分向愈伤部位运输。在凤梨中, 用
乙烯利灌心处理, 乙烯利进入凤梨体内, 会立即生
成大量的乙烯, 产生人为诱导的愈伤反应, 使植株
动员大量储备, 大量吸收水分和养料, 活化的糖
分、水分和其他养分均大量运往心叶部位, 为乙
烯处理后的凤梨开花提供了物质基础。开花是高
等植物由营养生长向生殖生长转变的一个重要的
生理过程, 涉及到植物体大量复杂的新陈代谢反
应, 而钾离子参与了植物细胞及整个机体水平中
的多数重要过程。乙烯信号启动‘阿蒂擎天’凤梨
后续开花反应后, 植物体上调钾离子吸收转运相
关基因以加强对钾元素的吸收, 目的或在于为后
续的开花过程做准备。
外源乙烯信号的传递是十分迅速的, 张鲲等
(2011)证实在乙烯利处理‘蜻蜓’凤梨1 h后, AfM-
KK1基因表达量就开始出现升高, 然后持续处于高
表达水平。本实验中, PT表达量6 h后才开始增加,
明显晚于乙烯信号的传递速度, 我们推测在‘阿蒂
擎天’凤梨中, 乙烯信号对钾转运体的影响, 并非一
个直接调控的过程。这也从侧面印证了‘阿蒂擎
天’凤梨可能与拟南芥类似, 乙烯信号通过调控
ROS水平来间接影响下游的钾转运体基因表达。
我们已知凤梨中钾转运蛋白可以受到乙烯信号影
响, 但乙烯信号传递到钾转运体基因的具体路径
以及此蛋白的具体作用, 还需要进一步的验证和
探索。
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