全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(9): 1701−1709 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08004-005, 2009ZX08009-133B), 国家自然科学基金项目(30871554, 30900906),
中国农业科学院公益性院所科研基金(1610172011006)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 周蓉, E-mail: zhourong@oilcrops.cn, Tel: 027-86735887; 周新安, E-mail: zhouxa@oilcrops.cn, Tel:
027-86711563
第一作者联系方式: E-mail: xiaolingzhu2009@126.com
Received(收稿日期): 2012-10-15; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130709.1559.002.html.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01701
大豆钾转运体基因 GmKT12的克隆和信息学分析
朱晓玲 1,2 陈海峰 1 王 程 1,3 郝青南 1,2 陈李淼 1 郭丹丹 1,2
伍宝朵 1 陈水莲 1 沙爱华 1 周 蓉 1,* 周新安 1,*
1中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学重点开放实验室, 湖北武汉 430062; 2中国农业科学院研究生院, 北京
100081; 3南京农业大学 / 国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 以钾高效和钾敏感型大豆品系为试验材料, 设置低钾胁迫试验, 在 8个时间段取样提取 RNA, 利用 Real-
time PCR检测 GmKT12基因的表达量, 结果显示 GmKT12基因在不同品系地上部和地下部表达水平有显著差异, 其
原因来自 GmKT12基因的氨基酸序列和蛋白质结构的变异。从 2个品系中分别克隆目的基因并对基因序列进行同源
性及生物信息学分析表明, 与 GmKT12 基因相似性在 30%以上的同源基因有 56个, GmKT12 在进化树中的位置与
Glyma18g18822 最近; GmKT12 编码蛋白为可溶性跨膜蛋白, 具有多个磷酸化位点, 该基因与信号转导有关, 对大豆
获取及转运钾离子可能起着关键作用。
关键词: 大豆; 钾转运体基因; 克隆; 生物信息学分析; Real-time PCR; 序列测定; 同源性分析; 系统发育分析
Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of K+ Transporter Gene
(GmKT12) from Soybean (Glycine max [L.] Merri)
ZHU Xiao-Ling1,2, CHEN Hai-Feng1, WANG Cheng1,3, HAO Qing-Nan1,2, CHEN Li-Miao1, GUO
Dan-Dan1,2, WU Bao-Duo1, CHEN Shui-Lian1, SHA Ai-Hua1, ZHOU Rong1,*, and ZHOU Xin-An1,*
1 Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences / Key Laboratory of Oil Crop Biology, Ministry of Agriculture, Wuhan
430062, China; 2Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China; 3 Nanjing Agricultural University / National
Center for Soybean Improvement/ National Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, China
Abstract: GmKT12 predicted as a potassium transporter is of great importance in absorbing nutrients, signal transduction in plant
growth. At present, there are few reports about the gene. In this paper, one low K tolerant soybean line You 06-71 and one low K
intolerant line Hengchun 04-11 were used as plant materials. In order to research the expression level of GmKT12 in low potas-
sium stress conditions, RNA was extracted and tested by Real-time PCR in eight periods. The results showed that there were
highly significant differences between two lines due to their was diversity of amino acid sequence and protein structure. Homol-
ogy and Bioinformatic analysis after cloning the target sequence from the two lines showed that comparing with GmKT12, there
were 56 homologous genes with more than 30 percent similarity, GmKT12 and Glyma18g18822 were nearest in the phylogenetic
tree. The protein encoded by GmKT12 was soluble transmembrane protein which contained 11–12 membrane structural domains,
and possessed multiple phosphorylation sites. These indicated that the protein might take part in plant signal transduction and
regulate potassium ions transportation into or out of cells. In conclusion, GmKT12 might play a pivotal role in potassium absorp-
tion in soybean, on which the research is important.
Keywords: Soybean (Glycine max [L.] Merri); Potassium transporter; Cloning; Bioinformatics analysis; Real-time PCR; Se-
quencing; Homologous analysis; Phylogenetic analysis
1702 作 物 学 报 第 39卷

大豆是我国主要的油料作物 , 其产量和品质受钾素
的影响较大[1]。钾离子参与植物的许多重要生理生化过程,
如维持细胞电荷平衡, 调节各种酶的活性和细胞膨压, 参
与蛋白质合成, 影响植物气孔运动、光合作用、促进细胞
伸长等[2]。钾离子供应不足时植株表现根系萎缩, 茎部脆
弱 , 叶片生活力差 , 老叶边缘焦灼 , 种子果实小而皱缩 ,
植株矮小, 生长缓慢, 易感染病虫害及冻害等[3-4]。尽管钾
素是地壳中含量最多的可供植物吸收利用的矿质元素 ,
但植物只能以离子形式吸收钾素 , 能被植物吸收利用的
钾素比例极小。农作物尤其大豆对钾素需要量较大 , 作
物根际可利用的钾离子浓度却常低于植株需要浓度 , 造
成植株遭遇低钾环境 , 如果钾肥供应不足即严重影响植
株正常生长发育, 制约大豆籽粒产量和品质性状。因此,
筛选钾高效大豆新品种或利用基因工程方法改良大豆品
种 , 提高大豆自身的钾吸收利用能力 , 对于提高大豆产
量、改进品质以及减少施肥量和保护环境等具有重要作
用 [5-6]。
相关研究表明, 植物吸收和转运 K+主要依靠两种不
同机制即钾离子通道和钾离子转运体 [7-10], 针对外界环
境钾离子浓度的差异 , 植物将选择利用这两种钾吸收
及转运系统。Véry 等[11]根据 α 亚基构型差别将钾离子通
道分为 shaker、TPK 和 Kir-like 家族。Gierth 等 [9]、Fu
等 [12]和 Garciadblas 等 [13]根据结构和功能将钾离子转运
体分为 K+吸收渗透性酶 (KUP/HAK/KT)、K+转运体
(Trk/HKT)、K+外流逆向转运 (KEA)和阳离子质子交换
(CHX)4个家族, 主要调控钾离子吸收、再分配和体内平
衡。钾离子转运体对植物钾营养吸收起着重要作用, Xu
等 [14]验证了由 LKS1 编码的蛋白激酶 CIPK23 在低钾条
件下使 AKT1磷酸化从而调控拟南芥对 K+的吸收, 其中
KUP/HAK/KT 转运体家族的作用尤为重要 [15]。拟南芥
KUP/HAK/KT 家族有 13 个成员 [8], 可分为 4 个群体, 大
部分有转运体功能的基因属于群体 I 和 II, 而有关其他
群体的研究较少。AtKUP/HAK/KT12 是群体 III 中的一
员 , 在亚细胞水平上定位于叶绿体 [16], 只在根毛和叶片
中表达 [17], 通过调节光合作用和根体积而控制钾离子的
吸收 [18]。大豆中关于钾转运体的研究报道极少, 目前尚
无在分子水平上开展大豆 KUP/HAK/KT家族基因功能研
究的报道。本课题组通过高通量测序发现大豆中一个与
AtKUP/HAK/KT12 (At1g60160)同源的基因, 在低钾处理
条件下其表达量呈现钾高效大豆品系显著高于钾敏感品
系 [19], 表明大豆中 KUP/HAK/KT基因可能参与调节低钾
胁迫反应。在此基础上, 本研究拟从 2 个对钾敏感性不
同的大豆品系中克隆 GmKT12, 利用生物信息学对其编
码蛋白进行相关分析 , 利用 RT-PCR 方法检测其在不
同大豆品系中的表达特性并构建植物表达载体 , 为进一
步验证其功能和作用机理及培育耐低钾大豆品种奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆钾高效品系油 06-71 和钾敏感型品系衡春 04-11
由本实验室前期筛选而来[19]。实验用大肠杆菌 DH5α、根
癌农杆菌 GV3101、表达载体 pCX-SN 等, 均为本实验室
保存。反转录酶MLV 购自 Promage公司, 限制性内切酶、
高保真聚合酶购自 MBI公司, Taq酶购自 Fermentas公司,
T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司, RNA 提取试剂购自
Invitrogen 公司, DNA 凝胶回收和质粒抽提试剂盒购自
AXYGEN公司, SYBR Green试剂盒购自天根生物公司。
其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。寡核苷酸引物由上
海英骏生物技术有限公司合成, DNA 测序由武汉三博远
志公司完成。
1.2 水培试验及取样
选取籽粒饱满无病虫的种子用纸卷法室内发芽, 待 2
片真叶完全展开时 , 去除幼苗子叶并转移到水培盆中进
行钾处理培养。参照Wang等[19]水培试验方法, 用改良 1/2
Hougland营养液配方, 设置正常(K+浓度为 3 mmol L–1)和
低钾(K+浓度为 0.5 mmol L–1) 2个处理, 3次重复。分别在
8个时期(开始处理后的 0.5 h、2 h、6 h、12 h、3 d、6 d、
9 d 和 12 d)取样 3 株, 并将植株分解为地上部和地下部,
分别装入保鲜袋, 以液氮速冻后保存于–80℃冰箱备用。
1.3 RNA提取与 cDNA合成
样品用液氮研磨后, 采用 TRIzol 一步法提取 RNA,
溶解于 DECP水中的 RNA通过琼脂糖凝胶电泳方法检测
后保存于–80℃冰箱中。
以 OligdT15 作为引物, 按照反转录试剂盒说明书合
成 cDNA 第一链。产物 cDNA作为普通 PCR及荧光定量
PCR的模板, 置–20℃冰箱保存备用。
1.4 引物的设计与合成
利用大豆基因组数据库(http://www.soybase.org/)中的
GmKT12基因(Glyma08g39840) CDS序列, 应用软件 Primer
Premier 5.0设计引物, 对 GmKT12基因设计 PCR引物, 命
名为正向 P-1、反向 P-2。大豆 Actin (Glyma04g39380.1)
作为内参基因, 按照荧光定量 PCR 引物设计原则设计引
物。将目的基因引物命名为正向 RT-1、反向 RT-2; 管家
基因引物命名为正向 Actin-1、反向 Actin-2。引物序列为
正向 P-1: 5′-GATGAGGTTCCTATGTGGTCA-3′; 反向
P-2: 5′-TCCCAACTTGGATGATATTGG-3′。正向 RT-1:
5′-CTGTTGATACTACGGCTGAG-3′; 反向 RT-2: 5′-TAG
ATGGCAATGCTGATG-3′。正向 Actin-1: 5′-TTTGCTG
GTGATGATGCTC-3′; 反向 Actin-2: 5′-ACCTCTTTTTG
ACTGGGCT-3′。
1.5 实时荧光定量 PCR及数据分析方法
应用 SYBR Green法进行 Real-time PCR反应, 每个
第 9期 朱晓玲等: 大豆钾转运体基因 GmKT12的克隆和信息学分析 1703


反应设 3 次重复。PCR 扩增程序为 95℃ 15 min; 95℃
10 s, 60℃ 15 s, 72℃ 20 s, 40个循环。利用 2–ΔΔCt法分析
获得的数据, 反映基因的表达水平。以公式 2–ΔΔCt计算目
的基因在供试品系中表达水平的差异倍数。2–ΔΔCt表示实
验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数 , 使用这
一方法可以直接得到目的基因相对于管家基因的定量。
ΔΔCt=实验组(Ct,油 06-71－Ct,大豆 actin)–对照组(Ct 衡春 04-11－Ct 大豆 actin),
式中 Ct 值是指每个反应管内的荧光信号达到设定阈
值时所经历的循环数。利用 SAS 软件对数据进行方差
分析。
1.6 目的片段的获取
使用 2 个参试品系的 cDNA 进行 PCR 扩增, 反应体
系(20 µL)含无 RNA酶水 12.2 µL, 10×buffer (无 Mg2+) 2
µL, 25 mmol L−1 Mg2+ 1.2 µL, 2.5 mmol L−1 dNTPs 0.4 µL,
10 µmol L−1正向 P-1 1 µL, 10 µmol L−1反向 P-2 1 µL,
cDNA 2 µL, 5 U µL−1 Taq DNA聚合酶 0.2 µL。PCR扩增
条件为 94℃预变性 4 min; 94℃ 30 s, 60℃ 1 min, 72℃
2.5 min, 共 30个循环; 72℃ 10 min, 15℃保温。用 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物, 用 DNA胶回收试剂盒回
收目的片段备用。
1.7 GmKT12基因在 2个品系中的序列差异的比对方法
将获得的目的片段胶回收产物, 与 pMD18-T 载体连
接, 反应体系含 pMD18-T 载体 1 µL、胶回收产物 4 µL
和 SolutionI 5 µL, 16℃金属浴中连接过夜。将连接产物转
入大肠杆菌感受态细胞 DH5α 并将菌液涂布于含有 100
µg mL−1氨苄的 LB固体培养基上倒置培养 12~16 h, 挑取
长势均一的菌斑画线并进行 PCR 检测, 反应体系(20 µL)
含无RNA酶水 14.2 µL, 10×buffer (无Mg2+) 2 µL, 25 mmol
L−1Mg2+ 1.2 µL, 2.5 mmol L−1 dNTPs 0.4 µL, 10 µmol.L−1正
向 P-1 1.0 µL; 10 µmol L−1反向 P-2 1.0 µL; 5 U µL−1 Taq
DNA聚合酶 0.2 µL; 同时用枪头蘸取菌落于体系中吹打。
PCR 扩增条件为 94℃预变性 4 min; 94℃ 30 s, 60℃ 1
min, 72℃ 2.5 min, 共 30个循环; 72℃ 10 min, 15℃保温。
于 37℃扩繁阳性菌落后交武汉三博远志公司测序。利用
DNAstar及 DNAMAN等软件分析测序结果。
1.8 GmKT12基因序列及蛋白质结构分析
应用 ProParam、TMHMM、DNAMAN、DNAstar、
PredictProtein、InterPro、WoLFPSORT、MEGA5.0、TargetP、
SWISS MODEL 等软件测序分析结果正确的 GmKT12 基
因序列及编码的蛋白质。
2 结果与分析
2.1 RNA提取、cDNA合成及 GmKT12基因的克隆
提取 8个时间段样品的 RNA并以琼脂糖凝胶电泳检
测 , 结果质量较好。以提取的 RNA 为模板反转录获得
cDNA。利用特异引物从 2个参试品系中均扩增出GmKT12
目的片段, 如图 1 显示钾高效及钾敏感品系扩增获得为
2406 bp的目的片段。


图 1 GmKT12基因 PCR扩增条带
Fig. 1 Cloning of GmKT12 segment
1: 从钾高效品系扩增目标片段; 2: 从钾敏感品系扩增目标片段;
M: 5000 bp分子量标记。
1: target fragment amplified from low K tolerant line ; 2: target
fragment amplified from low K intolerant line; M: molecular
marker 5000 bp.

2.2 GmKT12基因在 2个品系中序列差异比对
应用 DNAMAN软件对 2个参试品系扩增的 GmKT12
基因测序拼接结果作比对, 发现该基因序列在 2个品系中
有 5个单核苷酸发生变异, 即第 28、第 420、第 637、第
668 和第 1607 位核苷酸位点存在差异 , 序列一致性为
99.9%。其中钾高效品系中该基因序列与预测序列有 3个
碱基差异; 钾敏感品系中该基因序列与预测序列有 2个碱
基差异。在氨基酸水平上比对结果显示(图 2), 5个发生变
化的核苷酸位点产生了 4个氨基酸差异, 仅 420位核苷酸
差异未引起氨基酸变化, 序列一致性为 99.83%。钾高效
品系有 3处变化, 即第 10位 E (谷氨酸)变成Q (谷氨酰胺),
第 213位 Q (谷氨酰胺)变成 R(精氨酸), 第 536位 E (谷氨
酸)变成 G (甘氨酸); 钾敏感品系仅在第 223位 E (谷氨酸)
变成 D (天冬氨酸)。第 213、第 223、第 536位发生变化
的氨基酸均位于该基因的保守结构域内, 而第 213 和第
223位属钾离子转运区。
2.3 基因表达差异分析
利用 2–ΔΔCt法分析目的基因表达差异表明, GmKT12
基因表达在油 06-71和衡春 04-11地下部 8个取样时期其
差异均达极显著水平, 地上部处理除 3 d和 9 d外, 其他处
理时期该基因表达差异亦达到极显著水平(表 1)。值得注
意的是, 钾处理前期 2 个品系表达差异极为突出, 如低钾
处理 0.5 h后, GmKT12基因在油 06-71地上部表达水平是
衡春 04-11地上部的 14.9倍, 同样, 地下部的差异也较高,
达 13.4倍; 处理 2 h后, 油 06-71地上部 GmKT12基因的
表达水平是衡春 04-11地上部的 23.4倍, 地下部的差异为
19.0 倍。然而 , 处理 6 h 后 , 钾高效品系油 06-71 的
GmKT12 表达量迅速下降, 降至钾敏感品系的 0.2~0.6 倍,
随后则变化不大, 但 2个品系间 GmKT12表达量仍差异极
显著。试验表明经过短时期低钾处理后, GmKT12基因在
钾高效品系油 06-71中表达量瞬时增加的幅度极大, 反映
大豆植株受到钾离子胁迫时该基因会立即响应以维持植
株的正常生长发育。
1704 作 物 学 报 第 39卷



图 2 GmKT12基因在 2个品系及预测氨基酸序列的比对结果
Fig. 2 Amino acid sequence comparison between predicted and tested GmKT12
PREDICTED: GmKT12预测氨基酸序列; GmKT12-YOU: 钾高效品系扩增 GmKT12的测序结果; GmKT12-HC: 钾敏感品系扩增
GmKT12的测序结果; 灰色阴影表示保守结构域; “:”表示氨基酸差异; “*”表示该处氨基酸完全相同。
PREDICTED: predicted amino acid sequences of GmKT12; GmKT12-YOU: sequencing of GmKT12 in the low K tolerant soybean line;
GmKT12-HC: sequencing of GmKT12 in the low K intolerant soybean line; conserved domains are shaded by gray blocks; the different
amino acid sequences are indicated by “:”; “*” indicates that amino acid sequences are identical.
第 9期 朱晓玲等: 大豆钾转运体基因 GmKT12的克隆和信息学分析 1705


2.4 GmKT12的生物信息学分析
2.4.1 蛋白质理化性质的分析 应用 ProParam (http://
www.expasy.org/tools/protparam.html)软件分析数据库预
测 GmKT12 序列及两品系扩增 GmKT12 序列的编码蛋白
理化性质(表 2), 结果显示 GmKT12 含有 801 个氨基酸的
开放读码框(ORF), 相对分子质量差异较小, 预测序列及
钾敏感品系的蛋白质理论等电点、强碱性氨基酸
(Arg+Lys)、强酸性氨基酸(Asp+Glu)一致, 而钾高效品系
与其均存在一定差异; 3 种序列蛋白质不稳定系数均小于
40, 表明此蛋白性质稳定 , 总平均疏水指数(GRAVY)显
示该蛋白亲水性差, 为疏水性蛋白。
2.4.2 蛋白质跨膜区域分析 应用蛋白质跨膜区域预
测工具 TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-
2.0)分析目标蛋白的跨膜结构, 结果显示 2 个品系的蛋白
跨膜结构基本相同(图 3)。预测的跨膜螺旋区域有 12 个,
GmKT12 的 52~528 位氨基酸为钾离子转运区, 跨膜螺

表 1 GmKT12基因在 2个品系不同时期的表达差异
Table 1 Expression level of GmKT12 at different periods in two lines
地上部表达水平 Expression level of above ground part 地下部表达水平 Expression level of below rground part
时期
Period Ct,油 06-71
Ct,You06-71
Ct,大豆 actin
Ct,actin
Ct,衡春 04-11
Ct,HC04-11
Ct,大豆 actin
Ct,actin
2–ΔΔCt值
2–ΔΔCt
Ct,油 06-71
Ct,You06-71
Ct,大豆 actin
Ct,actin
Ct,衡春 04-11
Ct,HC04-11
Ct,大豆 actin
actin
2–ΔΔCt值
2–ΔΔCt
0.5 h 26.40 18.58 28.23 16.81 14.876880** 20.91 16.00 25.49 16.83 13.45434**
2.0 h 19.79 16.56 28.60 20.82 23.425370** 20.81 16.26 25.49 16.69 19.02731**
6.0 h 25.34 17.25 23.24 17.28 0.228458** 20.74 14.68 20.43 15.16 0.578344**
12.0 h 26.05 17.35 22.42 16.49 0.147113** 21.20 14.66 22.48 15.81 1.094294**
3 d 22.00 16.78 21.58 20.48 0.057711 20.86 14.97 20.07 15.10 0.528509**
6 d 19.60 16.21 19.51 16.80 0.626332** 18.25 13.81 18.57 14.41 0.823591**
9 d 24.71 18.67 22.68 19.83 0.071051 22.72 17.06 21.64 16.44 0.726986**
12 d 22.14 17.63 20.19 17.28 0.329877** 18.76 14.27 19.43 15.03 0.939523**
**在 0.01水平差异显著。** significantly different at P<0.01.

表 2 3种序列理化性质
Table 2 Physical and chemical properties of three sequences
序列
Sequence
相对分子质量
Relative
molecular mass
等电点
Isoelectric
point
强碱性氨基酸
Strong alkaline
amino acid
强酸性氨基酸
Strongly acidic
amino acid
不稳定系数
Instability
index
总平均疏水指数
Grand average of
hydropathicity
预测序列
Predicted sequence
89068.2 6.39 68 72 33.93 0.403
衡春 04-11扩增序列
Sequence from HC 04-11
89054.2 6.39 68 72 34.02 0.403
油 06-71扩增序列
Sequence from You 06-71
89023.2 6.90 69 70 33.55 0.405



图 3 用 TMHMM分析蛋白跨膜区域
Fig. 3 Protein transmembrane region analyzed by TMHMM
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旋氨基酸期望值远大于 18, 说明此蛋白有可能是跨膜蛋
白或有一个明显的信号肽; 但始于 N-端的 60个氨基酸的
跨膜螺旋期望值小于 10, 说明信号肽不在 N-端即为内部
信号序列; 钾高效品系的蛋白 N-端在细胞质膜一侧的概
率是 0.92911, 钾敏感品系为 0.89961, 拓扑学表明蛋白始
于膜内, 跨膜螺旋终止于膜内的第 528 个氨基酸; 应用
PrediceProtein (http://www.predictprotein.org/)预测的跨膜
螺旋区域有 11个, 预测蛋白同样始于并止于膜内, 拓扑
学预测可信度高达 9分。同时疏水性氨基酸占总氨基酸个
数的 43%, 根据跨膜结构及疏水性分析说明该蛋白为跨
膜蛋白。
2.4.3 蛋白质二级和三级结构预测和分析 应用软件
InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 将 目 标 蛋 白 在
PFAM及 TIGRFAMs数据库中比对, 预测其功能为钾离子
转运体, 与钾离子的吸收相关。应用软件 PredictProtein
预测两品系及预测序列编码蛋白的二级结构, 如表 3 所示,
2个品系及预测GmKT12基因的编码蛋白质结构均产生了
部分差异 , 即钾高效比钾敏感品系和预测序列含有稍多
的 α螺旋, 2个品系的 β折叠比预测序列稍少, 钾敏感品系
含呈环状氨基酸残基最多, 其次是钾高效品系。3 种预测
蛋白暴露比例为 39%左右, 为易溶蛋白(氨基酸残基暴露
在蛋白质表面的超过 16%)。蛋白质溶解性是判断蛋白潜
在应用价值的重要指标, 预测蛋白有 4 个低复杂性区域,
佐证了该蛋白为可溶性表达相关蛋白。该蛋白能在体系内
迅速扩散, 有利于蛋白质其他功能性质的提高。在关于基
序识别和分类中预测此蛋白有 3个 N-糖基化位点、2个环
磷酸腺苷决定的蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶 C磷
酸化位点、9个酪蛋白激酶 II磷酸化位点、7个 N-端豆蔻
酰基化位点。分析认为该蛋白具有多个磷酸化位点, 对于
钾离子的吸收和转运起着重要作用。应用 SWISS MODEL
(http://swissmodel.expasy.org/)在线软件预测了GmKT12基
因预测序列及 2个品系编码蛋白的三级结构, 发现 2个品
系及预测序列间存在部分细小差别(图 4), 表明差异碱基
引起的蛋白结构变化可能是造成该基因表达量不同的原
因。
2.4.4 蛋白质系统进化分析 应用NCBI对 9条来自不
同物种的与 GmKT12 相似性高的氨基酸序列多重序列比
较表明, GmKT12编码蛋白有 1个功能为钾离子转运体特
有的 KUP 保守结构域, 6 个非特异保守结构域(功能包括
钾离子吸收、转运及新陈代谢), 1 个多域结构(能跨越多
个结构域的模型)。GmKT12 氨基酸序列与蚕豆钾离子
转运体相似性高达 85%, 与拟南芥、葡萄、杨树、蓖麻、
芦苇的相似性在 74%~78%之间。利用 GmKT12 的氨基
酸序列在 Phytozome 数据库中检索得到 64 个钾离子转运
体家族同源基因, 其中有 56 个同源基因其相似性在 30%
以上。
利用 MEGA5.0 软件对目的基因及 56 个同源基因和
9 个其他物种氨基酸序列构建系统发育树(图 5), 表明 66
条序列可分为 2大类群, Group I包括 24个同源基因及 9
个不同物种的氨基酸序列, 又分为 2组, 其中 GmKT12氨
基酸属于 Group IA, 包括 12个同源基因及来自不同物种
的 9个序列, GmKT12基因及一同源基因和蚕豆聚为一组,
杨树、蓖麻和葡萄与大豆、蚕豆的亲缘关系较近, 而与芦
苇的亲缘关系最远; 同源基因与 GmKT12 的亲缘关系较
物种间的亲缘关系稍远; Group IB中包括 12个同源基因。
Group II包含 33个家族成员, 也可分为 2组。

表 3 3种蛋白的二级结构预测
Table 3 Predicted secondary structure of three proteins (%)
序列
Sequence
α螺旋
Alpha helix
β折叠
Beta sheet
环
Loop
预测序列 Predict sequence 54.56 10.11 35.33
衡春 04-11扩增序列 Sequence from HC 04-11 54.56 9.61 35.83
油 06-71扩增序列 Sequence from You 06-71 54.81 9.61 35.58



图 4 三级结构预测图
Fig. 4 Predicted 3D structure of protein encoded by GmKT12
A: 预测序列编码蛋白三级结构; B: 钾敏感品系中克隆的序列编码蛋白三级结构; C: 钾高效品系中克隆的序列编码蛋白三级结构。
A: protein tertiary structure of predicted sequence; B: protein tertiary structure of low K intolerant line; C: protein tertiary structure of low K
tolerant line.
第 9期 朱晓玲等: 大豆钾转运体基因 GmKT12的克隆和信息学分析 1707





图 5 GmKT12系统发育树
Fig. 5 Phylogenetic tree of GmKT12 gene


1708 作 物 学 报 第 39卷

2.4.5 蛋白质的亚细胞定位 应用 PredictProtein、
TargetP 亚细胞定位及 WoLFPSORT 等软件预测蛋白质亚
细胞定位, PredictProtein 软件预测结果定位在细胞核上;
WoLFPSORT 软件[20]通过比对数据库中蛋白的相似结构,
分析目标蛋白定位于质膜、内质网、细胞骨架或细胞核上;
而TargetP预测该基因在叶绿体表达可能性为 0.106, 在线
粒体表达可能性为 0.157, 在分泌系统表达可能性为 0.051,
在其他部位表达的可能性为 0.872。3 次预测结果基本相
符, 表明 GmKT12基因可能在多个部位表达。
3 讨论
植物界有大量的编码 KUP/HAK/KT 转运体家族基因,
在植物生长过程中尤其是低钾胁迫适应性反应中起着十
分重要的作用 [21], 包括获取养分 , 调控植物生长等。
KUP/HAK/KT 转运体家族中的大部分成员属于 Cluster I
和 Cluster II, 迄今为止仅在拟南芥和水稻中均发现 6 个
Cluster III成员, 而 Cluster IV只包含 4个水稻基因[22]。
AtKUP/HAK/KT12 被归类为 Cluster III, 是一组低亲和性
的钾离子转运体, 可能与信号转导、植物激素等有重要关
系, 有关钾离子转运和维持体内平衡机制尚不清楚。本研
究以 NCBI 比对结果显示 GmKT12 基因与 AtKUP/HAK/
KT12 基因在 DNA 水平的相似性高达 82%, 同时利用
Phytozome数据库分析GmKT12基因在大豆中钾离子转运
体家族成员共有 64 个, 对相似性在 30%以上的同源基因
进行系统发育树分析发现 57个基因可分为 2组, Group I
中包含 24个基因, GmKT12基因与其他物种的同源序列同
属于 Group IA。
GmKT12 基因编码蛋白是具有稳定蛋白结构的疏水
膜蛋白, 其跨膜螺旋区域有 11~12 个, 疏水性氨基酸 348
个, 总平均疏水指数(GRAVY)为 0.403, 氨基酸序列的疏
水性是决定蛋白质结构类型和稳定性的一个最重要的因
素。应用软件预测此蛋白有一个信号肽, 虽不在 N-末端,
但具信号序列的作用 , 称为内含信号序列又称内含信号
肽, 可引导新生肽链到达内质网膜, 作为蛋白质共翻译转
移的信号被信号识别颗粒 (SRP)识别 , 也是起始转移信
号。GmKT12基因编码的共翻译转运蛋白质中只有 1个内
含信号序列即为单次跨膜蛋白。GmKT12编码的膜蛋白具
有多个蛋白磷酸化位点 , 蛋白质的磷酸化修饰是生物体
内重要的共价修饰方式之一 , 是真核细胞中一种最普遍
的调控手段。蛋白质磷酸化和去磷酸化是一个可逆过程,
是目前所知最主要的信号转导方式 , 是生物体内信号传
导过程中的重要环节 [23], 调节钾离子和氯离子进出细
胞[24]。GmKT12编码蛋白的亚细胞定位在细胞核、质膜、
内质网或细胞骨架上。Gupta等[16]研究 AtKUP/HAK/KT12
基因编码蛋白的亚细胞定位在叶绿体膜上 , 可能与光合
作用关系较大, 认为 OsHAK23与 AtKUP/HAK/KT12基因
相似性很高, 但亚细胞定位在质膜上, 表明相似性高的同
源基因所起作用不同, 以致亚细胞定位不同, 这种同源基
因在不同物种表达部位不同的原因 , 可能是不同物种钾
转运体基因在进化过程中存在一定的保守性。
本研究通过比对钾高效和钾敏感品系 GmKT12 基因
序列, 发现有 5个核苷酸发生变化, 导致 4个氨基酸产生
变异, 其中 3 个氨基酸处于该基因保守结构域内, 2 个氨
基酸位于钾离子转运区 , 进一步分析表明其蛋白质二级
和三级结构也随之产生了一些变化 , 说明由差异碱基引
起蛋白结构的变化, 是导致 GmKT12 基因表达量出现显
著差异的原因 , 也可能是造成不同品系间对钾素吸收利
用及转运能力产生差异的原因之一。
Sung 等[17]利用 RT-PCR 数据分析 AtKT/KUP12 基因
在根和嫩叶中表达差异显著, 认为 AtKT/KUP12基因仅在
根毛和叶中表达 , 对钾离子的吸收有重要作用。本研究
RT-PCR 验证结果表明, GmKT12 在大豆地上部(茎和叶)
和地下部(根)均有表达, 与前人研究结果基本一致, 说明
该基因作为钾离子转运体的表达可能对钾离子吸收有较
大贡献 , 也可能参与光合作用或通过蛋白磷酸化而进行
钾离子运输。
本研究在低钾处理大豆植株 0.5 h、2.0 h后, GmKT12
基因的表达水平表现钾高效品系高于钾敏感品系
12.4~22.4倍, 差异极为显著, 随着处理时间的延长, 钾高
效品系的 GmKT12 基因表达量又迅速下降, 然后保持平
稳 , 但与钾敏感品系的表达量仍有显著差异。分析认为
GmKT12 基因可能在大豆遭受钾离子胁迫后的短时间内
促使大豆植株整体对低钾胁迫迅速做出适应性响应 , 并
在低钾条件下维持一定的表达水平以应对低钾胁迫。可能
的响应机制是其编码蛋白在大豆处于低钾状态时于地下
部和地上部立即表达 , 在根部吸收钾离子的同时可能发
挥信号转导作用 , 在地上部通过蛋白磷酸化作用将钾离
子快速转运至其他部位。当 GmKT12 基因编码蛋白无法
进一步吸收根际钾离子继而转运至其他部位时 , 其表达
量开始迅速下降 , 但保持一定的水平以应对周围钾离子
的变化。
GmKT12 基因编码的钾离子转运体是可溶性的疏水
蛋白, 具有多个蛋白磷酸化位点, 对植物获取钾离子可能
起到关键作用, 有助于钾离子进出细胞。目前在大豆中有
关 GmKT12 基因的研究极少, 本研究对该基因进行了初
步的探究, 但尚需进一步明确其功能及分子机制, 为培育
耐低钾大豆品种提供基础。
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