免费文献传递   相关文献

转基因生物及其产品的标识与检测



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (7): 645~654 645
收稿 2013-05-12  修定 2013-06-04
资助 转基因生物新品种培育重大专项(2013ZX08012-002)。
* 通讯作者(E-mail: yylltt@sjtu.edu.cn; Tel: 021-34207174)。
转基因生物及其产品的标识与检测
王荣谈1, 姜羽2, 韦娇君2, 张大兵2, 杨立桃2,*
1上海瑞丰农业科技有限公司, 上海201106; 2上海交通大学生命科学技术学院, 上海200240
摘要: 近年来, 转基因生物及其产品安全性备受公众关注。为此, 全球很多国家和地区纷纷颁布实施了相关法律法规, 要求
对转基因生物及其产品进行标识, 保护消费者对转基因产品的知情权。本文综述了全球各国的转基因生物及其产品的标
识管理体系, 及相应的主要检测技术和一些具有良好应用前景的新技术。
关键词: 转基因生物; 标识; 检测方法
The Labeling and Detection of Genetically Modified Organisms and Their
Derivates
WANG Rong-Tan1, JIANG Yu2, WEI Jiao-Jun2, ZHANG Da-Bing2, YANG Li-Tao2,*
1Shanghai Ruifeng Agricultural Technology Company, Shanghai 201106, China; 2School of Life Sciences and Technology, Shang-
hai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Abstract: Because of the public concerns on the safety of genetically modified organisms (GMOs), many coun-
tries and regions have issued series of regulations and labeling systems for GMOs to meet the consumers’ right
on selecting GMOs or not. Herein we described the GMOs labeling systems and its related detection techniques
and new methods with good application prospect in global area.
Key words: genetically modified organisms (GMO); labeling; detection method
转基因生物通常指通过基因工程技术将目的
基因导入到受体生物的基因组后能够稳定遗传的
新生物。通过外源基因的表达, 受体生物会表现
出新的性状 , 如抗虫、抗除草剂、抗旱和抗病
等。长期以来, 我国十分重视转基因生物研究、
应用与安全管理。2001年我国颁布的《农业转基
因生物安全管理条例》, 明确定义农业转基因生
物是指利用基因工程技术改变基因组构成, 用于
农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其
产品, 主要包括转基因动植物(含种子、种畜禽、
水产苗种)和微生物、转基因动植物和微生物的产
品、转基因农产品的直接加工品以及含有转基因
动植物、微生物或者其产品成份的种子、种畜
禽、水产苗种、农药、兽药、肥料和添加剂等产
品(www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/zcfg/)。欧盟则在
其官方网站上将转基因生物(genetically modified
organism, GMO)定义为被人为改变了遗传性状, 被
赋予新特性的生物体(http://ec.europa.eu)。
1 转基因生物商业化现状
自首例转基因番茄‘FLAVR SAVR’于1994年
在美国批准商业化以来, 全球转基因作物种植面
积持续增长, 据ISAAA公布的数据, 截止2012年底
全球转基因作物种植总面积已达到1.7亿公顷, 较
1996年增长了94倍多。种植面积排名前十的国家
都超过了百万公顷, 其中美国为69.5百万公顷, 占
40.8%; 其次是巴西, 占21.5%; 阿根廷占14.03%; 加
拿大占6.8%; 印度占6.3%; 我国为400万公顷, 占
2.4%, 位居第六(表1)。
2012年共计59个国家和地区生产和应用转基
因作物, 涉及25种作物、319个转基因事件。预计
在未来的若干年里, 转基因的种植面积和商业化
进程会持续增长, 并会对社会可持续发展产生深
远影响(James 2012)。
2 主要国家转基因生物标识管理
世界各国在不同程度上加强了转基因生物安
全管理 , 并对转基因生物及其产品进行标识管
理。在世界范围内, 超过50个国家对转基因产品
实施标识管理, 分为自愿性标识和强制性标识两
植物生理学报646
种模式(Zhang和Guo 2011)。标识的阈值是指某一
产品中含有转基因成分的比例。如加工产品豆粕
中, 转基因大豆的含量是指转基因大豆成分占豆
粕中大豆成分的比例。阈值一般有两种表述方式:
一种是质量百分比(如转基因大豆质量/大豆总质
量); 另一种则指外源基因拷贝数与内标准基因拷
贝数的比值(如转基因大豆外源基因拷贝数/大豆
内标准基因拷贝数) (金芜军等2004)。由于质量和
基因拷贝数没有严格的线性关系, 所以利用不同
的表述方式得出的转基因成分含量经常不一致。
目前实行强制性标识的国家中, 除欧盟采用拷贝
数之比计算阈值外 , 其他各国均以重量比计算
(Querci等2010) (表2)。
2.1 强制性标识
在实行强制性标识的国家和地区中, 以欧盟
为代表, 日本、韩国、泰国、澳大利亚和新西兰
等国家均对转基因产品实行强制性定量标识, 明
确特定的阈值, 即当转基因成分含量超过特定阈
值后需进行标识; 我国实施零阈值强制性标识管
理, 即凡是含有标识目录中的转基因成分则必须
进行标识(Gruère和Rao 2007)。
对于标识的阈值, 欧盟在2000年颁布的法令
EC No 49/2000中指出, 凡是转基因DNA或蛋白质
含量超过1%的常规食品都必须实施标签制度, 直
至2003年, 新颁布的法规EC No 1829/2003和No
1830/2003中明确规定任何转基因成分含量超过
0.9%的食品和饲料都必须进行强制性标识并建立
可追踪的制度, 并且以DNA拷贝数之比作为标识
的表述方式(http://europa.eu)。
我国实行强制性标签制度, 没有设置具体的
标签阈值 , 只要含有转基因成分并且符合我国
《农业转基因生物标识管理办法》规定的5大类
17种转基因产品则必须进行标识 , 包括大豆种
子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕; 玉米种子、
玉米、玉米油、玉米粉; 油菜种子、油菜籽、油
菜籽油、油菜籽粕; 棉花种子; 番茄种子、鲜番
茄、番茄酱(http://www.moa.gov.cn)。由于不同转
基因产品检测方法的灵敏度差异很大, 零阈值的
表1 2012年全球10大国家转基因作物种植情况(James 2012)
Table 1 Top 10 global area of biotech crops in 2012: by country
排名 国家 种植面积/百万公顷 转基因作物种类
1 美国 69.5 玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜、苜蓿、番木瓜、南瓜
2 巴西 36.6 大豆、玉米、棉花
3 阿根廷 23.9 大豆、玉米、棉花
4 加拿大 11.6 油菜、玉米、大豆、甜菜
5 印度 10.8 棉花
6 中国 4.0 棉花、番木瓜、白杨、西红柿、甜椒
7 巴拉圭 3.4 大豆、玉米、棉花
8 南非 2.9 玉米、大豆、棉花
9 巴基斯坦 2.8 棉花
10 乌拉圭 1.4 大豆、玉米
表2 全球主要国家转基因产品标识管理情况
Table 2 Labeling regulation of GMO products in major countries worldwide
标识类别 标识阈值 阈值(转基因含量)计算方式 国家或地区
强制性标识 No data - 中国、印度
0.9% DNA拷贝数之比 欧盟、爱尔兰、俄罗斯
1% 质量百分比 澳大利亚、新西兰、巴西、克罗地亚、 沙特阿拉伯、以色列
2% 质量百分比 智利、挪威
3% 质量百分比 韩国、马来西亚
5% 质量百分比 日本、中国台湾、泰国、印度尼西亚
自愿性标识 No data - 美国、阿根廷、南非
5% - 中国香港、菲律宾、加拿大
王荣谈等: 转基因生物及其产品的标识与检测 647
标识对于检测方法的标准化要求极其严格。随着
转基因作物种类的快速增加, 《农业转基因生物
标识管理办法》规定的目录今后需要不断修订。
亚洲其他国家如日本和韩国, 也实行强制标
识制度。日本于2000年3月发布农林水产省第517
号公告, 规定凡转基因成分超过5%的产品要执行
强制性标签制度和转基因食品年标签标准(Notifi-
cation 1775, 2000)。韩国从2001年3月1日起实施
转基因食品强制性标签制度, 在韩国农林水产部
颁布的转基因农产品标识办法中, 规定食品或饲
料在生产加工过程中, 对于5种特定的转基因作物,
即大豆、豆芽、玉米、马铃薯和油菜, 有一种或
多种成分超过3%, 则必须进行标识(Notification
2000-31, 2000)。
2.2 自愿性标识
以美国为代表的一些国家(如加拿大、阿根
廷等)对于转基因食品的标识管理实行自愿标识管
理政策。美国主要依据《联邦食品药物及化妆品
法案》管理转基因生物及其产品, 规定了只有当
转基因食品与其传统对应食品相比具有明显差
别、用于特殊用途或具有特殊效果和存在过敏原
时, 才属于标识管理范围(Gruère和Rao 2007)。加
拿大的转基因管理政策与美国相似, 实行自愿标
识管理(李宁等2010)。
2.3 低水平混杂的管理
近年来, 大量转基因作物的商业化应用不可
避免地造成不同转基因作物或转化事件间相互污
染或混杂。转基因产品低水平混杂(low level pres-
ence, LLP)也成为各国日益关注的问题。2008年国
际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commis-
sion, CAC)在《Codex植物准则》附件3中, 对转基
因作物LLP作出了正式的界定: LLP 是指对于一个
给定的转基因作物, 其在一个或多个国家得到批
准而在进口国尚未获得批准, 但在进口国进口的
农产品中出现了该种未批准转基因作物成分的微
量混杂(《国际食品法典标准编绘》, 2009)。自转
基因产品商业化以来, 已经发生多起LLP事件, 如
2008年从美国出口的Roundup Ready大豆和Liberty
Link大豆在美国获得批准, 而在进口国欧盟则未获
得批准(徐丽丽等2012)。因此, LLP给国际间贸易
带来诸多问题, 易引发国际贸易摩擦。欧盟立法
明确规定了LLP的阈值水平为0.1% (EU 619/ 2011)。
3 转基因生物及其产品主要检测技术
从分子生物学水平来看, 转基因检测是针对
其转入的外源基因后的特异性DNA序列和其表达
的蛋白质展开的。因此, 转基因检测方法可以分
为基于蛋白质水平的检测方法和基于核酸水平的
检测方法两大类(图1)。
图1 主要转基因生物检测技术
Fig.1 The core approaches for GMO analysis
ELISA: 酶联免疫吸附反应; LFD: 侧向流动试纸装置。
植物生理学报648
3.1 基于蛋白质水平的检测技术
蛋白质检测技术都是基于免疫学的原理, 即
转基因生物表达的特定蛋白可作为抗原和抗体特
异性结合(Holst-Jense 2009), 是一种直观、快速的
检测方法。目前, 酶联免疫吸附法(enzyme-linked
immunosorbent assay, ELISA)和侧向流动免疫测定
(lateral flow devices, LFD)是两种最主要的基于蛋
白的转基因产品检测方法(Michelini等2008)。
酶联免疫吸附法是一种将免疫反应和酶的高
效催化反应结合的检测方法。外源目的蛋白与抗
体结合后, 再结合酶标抗体, 加入底物后通过酶促
反应形成有色物质, 就可根据颜色变化判断是否
为转基因外源蛋白,并计算其含量。近年来, 研
究者已经建立了不同转基因生物的ELISA检测方
法, Kim等(2010)建立了一种ELISA方法检测韩国
转基因辣椒Subicho不同组织中bar基因编码的乙
酰转移酶和npt II基因编码的新霉素磷酸转移酶;
Tan等(2013)发明了一种三明治式ELISA方法
(sandwich ELISA), 可以检测转基因棉花中的胰蛋
白酶抑制因子CpTI。此外, 全球各大公司也开发
了各种商业化的ELISA转基因生物检测试剂盒检
测不同外源基因表达的蛋白(表3), 其检测极限最
高可达0.1% (Ermolli等2006)。
侧向流动型免疫试纸同样基于抗原抗体特异
性结合的原理, 以硝化纤维为固相载体, 在抗体上
联结显色剂并固定在试纸条内, 将试纸条一端放
入含有外源蛋白的组织提取液中, 通过毛细管作
用使提取液向上流动, 抗体与外源蛋白结合则会
呈现颜色反应, 一般5~10 min可以获得检测结果
(Lipp等2000)。Liu等(2013)发明了一种胶体金免
疫试纸条, 可成功检测转基因牛牛乳中的人乳铁
蛋白。目前很多转基因检测侧向流动型免疫测定
试纸条已经商业化应用(表3)。
3.2 基于核酸水平的检测技术与策略
由于核酸分子, 特别是DNA分子的稳定性强,
基于核酸的检测方法已成为转基因生物检测的主
要手段(张建中等2011), 主要的核酸检测技术包括
定性PCR和实时荧光定量PCR。近年来, 已有大量
文章报道了不同转基因生物品种的定性PCR和定
量PCR检测方法(表4)。但无论使用定性还是定量
PCR技术, 转基因产品检测都基本按照以下流程进
行(图2)。(1)检测是否含转基因成分: 通过筛选
PCR确定样品中是否含转基因作物的通用元件、
标记基因等(Matsuoka等2002; Yang等2008; Rand-
hawa等2009; Wang等2010); (2)具体含有什么转基
因作物品系: 通过构建特异性和品系特异性检测
表3 商业化转基因生物蛋白检测方法/试剂盒
Table 3 Commercialized methods/kits based on the protein analysis for GMOs
外源目的蛋白 转基因植物 检测方法
ELISA LFD
Cry 1A 玉米、棉花 有 无
Cry 1Ab 玉米 有 有
Cry 1Ac 棉花 有 有
Cry 1F 玉米、棉花 有 有
Cry 2A 棉花、玉米 有 有
Cry 2Ab 玉米、棉花 有 无
Cry 2Ae 棉花 无 有
Cry 34 玉米 有 有
Cry 34Ab1 玉米 有 有
Cry 3B 玉米 有 无
Cry 3Bb 玉米 有 无
Cry 9C 玉米 有 有
modified Cry 3A 玉米 有 有
CP4 EPSPS 玉米、棉花、油菜、苜蓿、大豆 有 有
PAT/bar 水稻、棉花 有 有
PAT/pat 玉米、大豆、油菜 有 有
Vip3A 棉花、玉米 有 有
王荣谈等: 转基因生物及其产品的标识与检测 649

4



/ 验










Ta
bl
e
4
D
ev
el
op
ed
/v
al
id
at
ed
P
C
R
d
et
ec
ti
on
m
et
ho
ds
f
or
G
M
O
s




























PC
R

























PC
R









































C
aM
V
35
S




F
M
V
35
S




N
O
S




0.
1%



C
aM
V
35
S




0.
05
%





U
bi
qu
ti
n 启





A
ct
in




N
O
S





0.
1%



F
M
V
35
S




N
O
S




N
O
S





0.
01
%




C
aM
V
35
S






C
aM
V
35
S




bl
a 基


G
U
S 基


H
pt



N
PT
II



0.
1%



bl
a 基


G
U
S 基


H
pt



N
PT
II



0.
01
%










18
Sr
R
N
A

aa
dA

bx
n 、
C
P 、
cr
y1
Ab

C
ry
1F

cr
y2
Ab


0.
1%


Aa
d 、
ac
p1

ba
r 、
C
P 、
cp
4
ep
sp
s 、
C
ry
1A
b/
c 、

0.
01
%



cr
y9
C

ep
sp
s 、
go
x 、
RP

ui
dA

vi
p3
A(
a)

ph
yt
as
e 、
cp
tI


cr
y1
Ac

cr
y2
Ab

cr
y3
A 、
Fa
tA

go
x 、
pa
t 、
RP

ba
r 、
Ba
rn
as
e 、
cr
yI
A(
b)

cr
y1
Ac

cr
y3
A 、
pl
rv
re
p 、
pa
t
0.
1%



cr
y1
Ab

cr
y1
A.
10
5 、
cr
y2
Ab
2
0.
05
%










M
O
N
53
1 棉


M
O
N
14
45



G
K
19



SG
K
32
1 棉



0.
1%



‘ 华

1 号
’ 番


0.
01
%



TT
51
-1



K
M
D



G
A
21



M
O
N
81
0 玉



M
O
N
86
3 玉


N
K
60
3 玉


TC
15
07



‘ 华

1 号
’ 番






N
em
a2
82
F 番


B
t1
1 玉


Ev
en
t1
76



T2
5 玉



0.
1%



C
tp
2
cp
4e
ps
ps

M
O
N
81
0 玉


B
t1
1 玉



0.
05
%



G
TS
-4
0-
3-
2 大


B
t6
3 水


FP
96
7 亚




Ev
en
t1
76



G
A
21



G
TS
-4
0-
3-
2 大












(M
s8

R
f3

G
T7
3 、
M
s1

R
F1

R
f2

To
pa
s
19
/2


0.
1%





(M
s8

R
f3

G
T7
3 、
M
s1

R
F1

R
f2


0.
05
%



T4
5 、
O
xy
23
5)



To
pa
s
19
/2
)




H
7-
1
0.
1%





H
7-
1
0.
05
%







(L
LC
ot
to
n2
5 、
M
O
N
14
45

M
O
N
53
1 、
M
O
N
15
98
5 、

0.
1%





(2
81
-2
4-
23
6

30
06
-2
10
-2
3 、
LL
C
ot
to
n2
5 、

0.
05
%



M
O
N
88
91
3 、
G
H
B
11
9)



M
O
N
14
45

M
O
N
53
1 、
M
O
N
15
98
5 、
M
O
N
88
91
3 、




G
H
B
11
9 、
T3
04
-4
0)





(D
P-
35
60
43
-5

30
54
23

A
55
47
-1
27

M
O
N
89
78
8 、

0.
1%





(D
P-
35
60
43
-5

30
54
23

A
55
47
-1
27


0.
05
%



G
TS
-4
0-
3-
2 、
A
27
04
-1
2 、
M
O
N
87
76
9 、
C
V
12
7)



M
O
N
89
78
8 、
G
TS
-4
0-
3-
2 、
A
27
04
-1
2 、




M
O
N
87
70
1 、
M
O
N
87
70
5 、
M
O
N
87
76
9 、
FG
72

C
V
12
7)



(M
O
N
81
0 、
32
72

M
O
N
89
03
4 、
LY
03
8 、

0.
1%





(9
81
40

M
O
N
81
0 、
32
72

M
O
N
89
03
4 、

0.
05
%



M
IR
16
2 、
B
t1
76

M
O
N
88
01
7 、
B
t1
1 、
G
A
21




LY
03
8 、
M
IR
16
2 、
B
t1
76

M
O
N
88
01
7 、
B
t1
1 、

M
IR
60
4 、
59
12
2 、
T2
5 、
TC
15
07

M
O
N
86
3 、



G
A
21

M
IR
60
4 、
59
12
2 、
T2
5 、
TC
15
07


N
K
60
3 、
B
t1
0)



M
O
N
86
3 、
M
O
N
87
46
0 、
N
K
60
3 、
B
t1
0 、
D
A
S-
40
27
8-
9)



(T
T5
1-
1 、
K
M
D

K
F6

K
F8

LL
R
IC
E6
01
)
0.
1%





(T
T5
1-
1 、
LL
R
IC
E6
2)

0.
05
%











EH
92
-5
27
-1

0.
01
%










T4
5 和
O
xy
23
5
0.
01
%


植物生理学报650
方法来鉴定转基因成分具体源于哪种特定的转基
因品系(Yang等2005; Oguchi等2010); (3)转基因成
分含量: 运用定量PCR的方法来测定样品中转基因
成分的具体含量(Yang等2006)。
3.3 核酸检测新技术
随着转基因数量急剧增加, 开发多靶标、高
通量的PCR检测方法日益重要, 各种新型复合PCR
方法应运而生, 包括复合PCR、兼并复合PCR和微
滴复合PCR等。复合PCR是指在一个反应体系中,
同时加入多对引物, 扩增不同的特异性片段, 最后
通过凝胶电泳分离这些片段。Lu等(2010)成功建
立了能同时检测6种常见转基因元件多重PCR, 分
别针对35S启动子、NOS启动子和终止子、nptII
(neomycin phosphotransferase, 新霉素磷酸转移酶
基因)、CP4epsps (5-enol form pyruvic acid-shi-
kimic acid-3-phosphate synthase, 5-烯醇式丙酮酰-
莽草酸-3-磷酸合酶)基因和pat (phosphinothricin N-
acetyltransferase, 草丁膦转移酶)基因。兼并复合
PCR (degenerate MPCR)是通过设计兼并PCR引物
来检测一种针对同一性状基因或一类性状基因的
同源核苷酸序列的新型复合PCR。Guo等(2012)建
立了一种四重兼并引物PCR方法, 同时扩增转基因
作物主要使用的8个外源目的基因, 理论上可覆盖
90余种转基因作物。微滴PCR (microdroplet PCR)
技术可将单个DNA分子被分配到纳升级(0.5 fL~0.5
nL)的微滴中进行扩增, 1 µL乳化剂中能形成约107
个反应, 可极大提高扩增通量, 减低复合PCR中多
对引物和多模板间的干扰。Guo等(2011)发明了一
种微滴聚合酶链式反应-毛细管凝胶电泳分析系统
(MPIC), 同时检测了9个转基因品种的24个靶标,
检测灵敏度可达39个拷贝。
DNA芯片技术日趋成熟, 使用DNA芯片进行
转基因生物的高通量检测已得到商业化应用。如
Nesvold等(2005)设计了一种基因芯片用于检测单
个未知转基因生物。新发展的Tilling芯片含有高
密度的覆瓦式的寡核苷酸探针, 能够高密度、高
通量地从全基因组水平上对转基因生物进行分析,
已经用于未知或者非法转基因生物的检测(Mock-
ler和Ecker 2005)。
二代测序技术(next-generation sequencing,
NGS)即高通量测序, 一次实验可以读取1 G到14 G
碱基数。现有的技术平台主要有454焦磷酸测
序、Solexa测序、SOLiD测序、Polonator测序和
HeliScope测序技术等(Mardis 2008)。二代测序技
图2 转基因植物及其产品核酸检测策略和流程
Fig.2 The strategies and protocol of GMOs analysis on nucleic acid-based level
王荣谈等: 转基因生物及其产品的标识与检测 651
术是在传统测序技术上飞跃性的进步, 在转基因
检测中将具有广阔的应用前景, 如Teng等(2009)通
过454焦磷酸测序, 并基于计算机减法算法建立了
一种未知转基因拟南芥的检测方法, 为未知转基
因生物的检测提供了一种可能。
等温扩增技术是近年发展起来的快速核酸检
测技术, 扩增过程不需要温度循环, 较PCR技术有
快速、低成本、灵敏等优点。核酸等温扩增技术
有很多种, 其中环介导等温扩增技术(loop-mediat-
ed isothermal amplification, LAMP)已较多的应用
在转基因检测中。LAMP技术通过设计能识别靶
标序列6个区域的2对引物, 在Bst聚合酶作用下, 经
过恒温(60~65 ℃)约40 min即可完成核酸扩增(No-
tomi等2000)。Lee等(2009)通过LAMP方法检测到
了转基因油菜和大豆中的35S启动子和NOS终止
子, 灵敏度可达0.01%转基因含量; Chen等(2011)则
发明了一种可视化的LAMP技术, 可通过肉眼直接
判断样品中是否含有转基因产品; Kiddle等(2012)
则通过将一种荧光报告基团BART与LAMP技术联
用, 可以检测到0.1%转基因含量, 提高了LAMP检
测的灵敏度。
数字PCR (digital PCR)是近几年新发展起的
一种核酸精确定量技术, 该技术是通过将微量样
品大倍数稀释和细分, 直至每个细分试样中所含
有的待测分子数不超过1个后, 再将所有细分试样
同时在相同条件下进行PCR扩增, 之后对细分试样
逐个进行计数, 从而判断样品的起始数量(Pohl和
Shih 2004)。数字PCR是一种绝对测量方法, 无需
建立标准曲线 , 并且检测的灵敏度高达1.85拷
贝·微升-1 (Leonardo等2011)。目前, 数字PCR主要
有三类平台, 分别是基于集成流体通路(IFC)芯片
技术的数字PCR (chamber 数字PCR)、微滴式数字
PCR和基于亲疏水芯片和通道技术的数字PCR (图
3)。数字PCR已经应用于转基因生物检测, 特别是
转基因标准物质的量值测定。如Corbisier等(2010)
使用数字PCR技术对转基因玉米MON810制备的
欧盟标准物质的内、外源基因进行了绝对定量分
析, 其结果和欧盟的定值结果一致; Burns等(2010)
分析了数字PCR在转基因检测中的应用, 认为该技
术非常适用于极低拷贝转基因样品定量和标准物
质的定值。
4 转基因产品检测方法标准化
世界各国都建立了适合本国转基因安全管理
与标识的检测方法和技术体系, 因此转基因检测
方法的标准化十分重要, 这直接关系到转基因产
品的国际贸易, 并能加强各国转基因检测方法的
可比性。国际标准化组织(International Organiza-
tion for Standardization, ISO)制定了一套较为完善
的转基因食品检测标准体系, 该体系以《通用要
求和原则》为指导, 分别对基于蛋白质和核酸的
检测方法制定了系列标准, 其中, 基于核酸的检测
方法标准涵盖核酸检测的各个环节, 如核酸提取
方法、定性和定量核酸检测方法。目前, ISO已经
正式颁布了6项转基因食品检测标准 , 包括1项
《通用要求和原则》标准(ISO24276)、4项检测方
法标准(ISO21569、 ISO21570、ISO21571和
ISO21572)和1项《检测方法增补原则》(ISO21098)。
上述标准作为转基因植物及其加工产品检测的指
导, 已被多个国家接收和采用, 如欧盟、日本和韩
国等。
欧盟也建立了一套转基因产品检测标准化体
系, 包括信息收集、检测技术研究、检测方法验
证与标准制备、实验室水平测试与认证等。欧盟
已循环认证的方法有51种转基因品系事件特异性
定量PCR检测方法, 涉及转基因玉米、大豆、棉
图3 数字PCR原理和平台
Fig.3 The principle and platform for digital PCR
植物生理学报652
花、油菜、水稻、马铃薯和甜菜等作物。此外,
欧盟委员会直属的联合研究中心(JRC)下属的健康
及消费者保护研究所(IHCP)和标准物质及计量研
究所(IRMM)直接负责整个欧盟转基因产品检测方
法的标准化。
我国转基因生物检测技术标准化进程较快。
目前, 我国农业部已制定转基因生物安全农业行
业标准和国家标准97项 , 主要包括环境安全评
价、实用安全评价和产品成分检测三类标准
(www.stee.agri.gov.cn)。我国转基因产品成分检测
标准与ISO组织制定的标准比较相近, 但是标准体
系框架结构不完全一致。ISO标准体系中将所有
的转基因成分定性、定量PCR检测方法按照定性
PCR技术(ISO21569)和定量PCR技术(ISO21570)归
纳为2个标准, 后期所有针对不同转基因成分的新
方法都将以附件形式添加到已有的定性PCR方法
和定量PCR方法标准中(ISO21098)。我国的产品
成分标准主要依据我国现行的转基因产品标识管
理制度建立, 重点以定性PCR检测方法为主, 每种
转基因成分检测方法制定为一个单一标准, 提高
标准的针对性。
5 转基因生物检测数据库
转基因生物数据库是全球转基因生物商业化
应用和安全管理的共享服务平台, 在全球转基因
生物产业化和安全管理中发挥着重要作用。目前,
很多国际组织和学者已建立了系列转基因生物安
全相关专业数据库。主要的转基因生物安全与检
测数据库有: GMDD (GMO Detection Database,
http://gmdd.shgmo.org/)、GM Crop Database (http://
cera-gmc.org)、GMO Methods (http://gmo-crl.jrc.
ec.europa.eu/gmomethods)、GMO Compass (http://
www.gmo-compass.org)和BCH (http://bch.cbd.int)
等。GMDD数据库收录的重点是各种转基因检测
方法, 目前, 已收录了155种商业化转基因生物的
不同特异性的核酸检测方法500多种, 同时涵盖内
标准基因、外源基因及其旁侧序列和对应的有证
标准物质等信息800多条。GM Crop Database主要
收录了通过转基因手段获得的转基因品种信息、
通过突变育种获得的品种信息, 涵盖目前主要商
业化应用的转基因作物相关的遗传、转基因方
法、主要性状、环境安全评价和食用安全评价等
信息。GMO Methods主要收录已经经过实验室间
协同实验验证的转基因生物定性、定量PCR检测
方法。GMO Compass主要包含了欧盟已经商业化
品种的信息, 以及这些商业化品种生产加工的食
品和饲料的信息。BCH是以联合国公约《生物安
全议定书》为原则建立的数据库机构, 主要收集
转基因生物信息, 包括各国的安全管理法规、转
基因生物相关的遗传性状信息等, 特别是对转基
因生物含有元件和外源基因给出了详细的描述。
这些数据库的建设和开放有效提高了全球转基因
生物安全评价和检测方法的研究及标准化。
6 展望
随着越来越多的转基因生物及其产品从田间
走向餐桌 , 转基因生物标识管理和检测日益重
要。除目前主要的免疫学和PCR检测技术外, 将有
更多的新技术、新方法用于转基因检测, 例如色
谱技术(Banerjee 2010)、表面等离子体共振技术
(Zhao等2013)和纳米材料技术等(Kumar等2010)。
同时, 快速、高通量也已成为转基因检测的重要
发展趋势, Zhang等(2013)研发了一种DNA快速提
取装置, 能够在15 min内完成植物基因组DNA的提
取, 并将其与LAMP技术联用, 实现GMO现场、快
速检测。新型生物芯片能够实现高通量的需求,
如IFC的动态芯片(Jang等2011), 可同时进行9 216
个独立定量PCR反应。快速、高通量、灵敏、自
动化检测方法将成为转基因生物及其产品检测的
重点方向, 为保障世界各国的转基因生物标识制
度提供有效的工具。
参考文献
国家食品药品监督管理局(2009). 国际食品法典标准编绘. 北京:
科学出版社, 123~125
金芜军, 贾士荣, 彭于发(2004). 不同国家和地区转基因产品标识管
理政策的比较. 农业生物技术学报, 12 (1): 1~7
李宁, 付仲文, 刘培磊, 李华锋, 连庆(2010). 全球主要国家转基因生
物安全管理政策比对. 农业科技管理, 29 (1): 1~6
徐丽丽, 李宁, 田志宏(2012). 转基因产品低水平混杂问题研究. 中
国农业大学报, 29 (2): 125~132
张建中,刘轶男,张海波,杨立桃(2011). 转基因生物核酸检测新技术
研究进展. 上海农业学报, 27 (1): 117~120
Banerjee K (2010). Novel GC/MS, HPLC/MS and HPLC-Diode array
detector-based methods for determination of pesticide residues in
food, feed, water, and soil samples. J AOAC Int, 93 (2): 353~354
Burns MJ, Burrell AM, Foy CA (2010). The applicability of digital
PCR for the assessment of detection limits in GMO analysis.
王荣谈等: 转基因生物及其产品的标识与检测 653
Euro Food Res Tech, 231: 353~362
Chen L, Guo J, Wang Q, Kai G, Yang L (2011). Development of the
visual loop-mediated isothermal amplification assays for seven
genetically modified maize events and their application in practi-
cal samples analysis. J Agric Food Chem, 59 (11): 5914~5918
Corbisier P, Bhat S, Partis L, Xie VR, Emslie KR (2010) Absolute
quantification of genetically modified MON810 maize (Zea mays
L.) by digital polymerase chain reaction. Anal Bioanal Chem,
396 (6): 2143~2150
Ermolli M, Fantozzi A, Marini M, Scotti D, Balla B, Hoffmann S,
Querci M, Paoletti C, Vanden EG (2006). Food safety: screening
tests used to detect and quantify GMO proteins. Accred Qual As-
sur, 11 (1-2): 55~57
Gruère GP, Rao SR (2007). A review of international labeling policies
of genetically modified food to evaluate India’s proposed rule.
AgBioForum, 10 (1): 51~64
Guo J, Chen L, Liu X, Gao Y, Zhang D, Yang L (2012). Multiplex
degenerate PCR analytical approach targeting to eight genes for
screening GMOs. Food Chem, 132 (3): 1566~1573
Guo J, Yang L, Chen L, Morisset D, Li X, Pan L, Zhang D (2011).
MPIC: a high-throughput analytical method for multiple DNA
targets. Anal Chemy, 83 (5): 1579~1586
Holst-Jensen A (2009). Testing for genetically modified organisms
(GMOs): Past, present and future perspectives. Biotechnol Adv,
27 (6): 1071~1082
James C (2012). Global status of commercialized biotech/GM crops:
2012. ISAAA Brief No. 44. New York: ISAAA
Jang JS, Simon VA, Feddersen RM, Rakhshan F, Schultz DA, Zschun-
ke MA, Lingle W, Kolbert CP, Jen J (2011). Quantitative miRNA
expression analysis using Fluidigm microfluidics dynamic ar-
rays. BMC Genomics, 12: 144~151
Kiddle G, Hardinge P, Buttigieg N, Gandelman O, Pereira C, McEl-
gunn CJ, Rizzoli M, Jackson R, Appleton N, Murray J (2012).
GMO detection using a bioluminescent real time reporter (BART)
of loop mediated isothermal amplification (LAMP) suitable for
field use. BMC Biotechnol, 12: 15~27
Kim HJ, Lee SM, Kim JW, Ryu TH, Suh SC, Cho HS (2010). Expres-
sion of PAT and NPT II proteins during the developmental stages
of a genetically modified pepper developed in Korea. J Agric
Food Chem, 58: 10906~10910
Kumar R, Singhad CK, Kamlea S, Sinhab RP, Bhatnagarc RK,
Kachru DN (2010). Development of nanocolloidal gold based
immune-chromatographic assay for rapid detection of transgenic
vegetative insecticidal protein in genetically modified crops.
Food Chem, 122: 1298~1303
Lee D, Mura ML, Allnutt TR, Powell W (2009). Detection of geneti-
cally modified organisms (GMOs) using isothermal amplifica-
tion of target DNA sequences. BMC Biotechnol, 9: 7~13
Leonardo BP, Victoria AC, Hindson CM, Herrmann J, Hindson BJ,
Bhat S, Emslie KR (2011). Evaluation of a droplet digital poly-
merase chain reaction format for DNA copy number quantifica-
tion. Anal Chem, 84: 1003~1011
Lipp M, Anklam M, Stave JW (2000). Validation of an immunoassay
for the detection and quantification of Roundup Ready soybeans
in food and food fractions by the use of reference material. J
AOAC Int, 83: 919~927
Liu C, Zhai S, Zhang Q, Liu B (2013). Immunochromatrography
detection of human lactoferrin protein in milk from transgenic
cattle. J AOAC Int, 969 (1): 116~120
Lu IJ, Lin CH, Pan TM (2010). Establishment of a system based on
universal multiplex-PCR for screening genetically modified
crops. Anal Bioanal Chem, 396: 2055~2064
Mardis ER (2008). Next-generation DNA sequencing methods. Annu
Rev Genomics Hum Genet, 9: 387~402
Matsuoka T, Kuribara H, Takubo K (2002). Detection of recombinant
DNA segments introduced to genetically modified maize (Zea
mays). BMC Biotechnol, 50 (7): 2100~2109
Michelini E, Simoni P, Cevenini L (2008). New trends in bioanalyti-
cal tools for the detection of genetically modified organisms: an
update. Anal Bioanal Chem, 392 (3): 355~367
Mockler TC, Ecker JR (2005). Applications of DNA tiling arrays for
whole-genome analysis. Genomics, 85: 1~15
Nesvold H, Kristoffersen AB, Holst-Jensen A, Berdal KG (2005). De-
sign of a DNA chip for detection of unknown genetically modi-
fied organisms (GMOs). Bioinformatics, 21 (9), 1917~1926
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K,
Amino N, Hase T (2000). Loop-mediated isothermal amplifica-
tion of DNA. Nucleic Acids Res, 28: 63~69
Oguchi T, Onishi M, Mano J (2010). Development of multiplex PCR
method for simultaneous detection of four events of geneti-
cally modified maize: DAS-59122-7, MIR604, MON863 and
MON88017. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 51 (3): 92~100
Pohl G, Shih LM (2004). Principle and applications of digital PCR.
Expert Rev Mol Diagn, 4 (1): 41~47
Querci M, Van den Bulcke M, Zel J (2010). New approaches in GMO
detection. Anal Bioanal Chem, 396 (6): 1991~2002
Randhawa GJ, Chhabra R, Singh M (2009). Multiplex PCR-based
simultaneous amplification of selectable marker and reporter
genes for the screening of genetically modified crops. J Agric
Food Chem, 57 (12): 5167~5172
Tan G, Nan G, Gao W, Li Q, Cui J, Wang B (2013). Development of
monoclonal antibody-based sensitive sandwich ELISA for the
detection of antinutritional factor cowpea trypsin inhibitor. Food
Anal Methods, 6: 614~620
Tengs T, Zhang H, Holst-Jensen A, Bohlin J, Butenko MA, Kristof-
fersen AB, Sorteberg HO, Berdal KG (2009). Characterization of
unknown genetic modifications using high throughput sequenc-
ing and computational subtraction. BMC Biotechnol, 9: 87~93
Wang C, Jiang L, Rao J, Liu Y, Yang L, Zhang D (2010). Evaluation
of four genes in rice for their suitability as endogenous refer-
ence standards in quantitative PCR. J Agric Food Chem, 58 (22):
11543~11547
Yang L, Pan A, Zhang H, Guo J, Yin C, Zhang D (2006). Event-
specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction
analysis for genetically modified canola T45. J Agric Food
Chem, 54 (26): 9735~9740
Yang L, Shen H, Pan A, Chen J, Huang C, Zhang D (2005). Screening
and construct specific detection methods of transgenic Huafan
植物生理学报654
No.1 tomato by conventional and real-time PCR. J Agric Food
Chem, 85: 2159~2166
Yang L, Zhang H, Guo J (2008). International collaborative study of
the endogenous reference gene LAT52 used for qualitative and
quantitative analysis of genetically modified tomato. J Agric
Food Chem, 56 (10): 3438~3443
Zhang D, Guo J (2011). The development and standardization of test-
ing methods for genetically modified organisms and their derived
products. J Integr Plant Biol, 53 (7): 539~551
Zhang M, Liu Y, Chen L, Quan S, Jiang S, Zhang D, Yang L (2013).
One simple DNA extraction device and its combination with
modified visual loop-mediated isothermal amplification for
rapid on-field detection of genetically modified organisms. Anall
Chem, 85 (1): 75~82
Zhao Z, Chen Y, Xu W, Ma M (2013). Surface plasmon resonance
detection of transgenic Cry1Ac cotton (Gossypium spp.). J Agric
Food Chem, 61 (12): 2964~2969