全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 361−364 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因重大专项(2008ZX08012-001)和山东省农业科学院博士科研启动基金资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 路兴波, E-mail: luxb99@sina.com, Tel: 0531-83179095; 赵蕾, E-mail: zhaolei@sdu.edu.cn, Tel: 0531-88177190
Received(收稿日期): 2009-07-06; Accepted(接受日期): 2009-09-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00361
转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性 PCR检测
袁 磊 1,2 孙红炜 1 杨崇良 1 尚佑芬 1 路兴波 1,* 赵 蕾 2,*
1 山东省农业科学院植物保护研究所, 山东济南 250100; 2 山东师范大学生命科学学院, 山东济南 250014
摘 要: 采用基因组步移法和巢式 PCR 方法研究转基因玉米 MON 88017 外源基因插入位点旁侧序列特征, 获得了
外源基因插入位点的左边界旁侧序列 504 bp, 包括 336 bp的插入载体序列和 168 bp的玉米基因组序列。根据此旁侧
序列, 设计 MON 88017 转化事件特异性引物并进行定性 PCR 扩增, 扩增片段为 446 bp, 建立了转基因玉米 MON
88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%), 为转基因玉米品种 MON 88017进出口检测和标
识检测提供了技术基础。
关键词: 转基因生物; 事件特异性检测; 定性 PCR; MON88017转化事件; 左边界旁侧序列
Analysis of Junction Sequence in the Transgenic Maize MON88017 and the
Methods of Qualitative PCR Detection
YUAN Lei1,2, SUN Hong-Wei1, YANG Chong-Liang1, SHANG You-Fen1, LU Xing-Bo1,*, and ZHAO Lei2,*
1 Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100, China; 2 College of Life Science, Shandong Normal Uni-
versity, Ji’nan 250014, China
Abstract: The experiment was conducted to investigate the integration site of transgene in maize MON88017 and to establish
event specific methods for qualitative detection of MON88017 based on the left border junction fragment, which was isolated
with the amended GenomeWalker and Nested-PCR methods. Sequence alignment between the T-DNA sequence and isolated
junction fragments showed a 504 bp junction fragment of MON88017 including 336 bp of T-DNA sequence and 168 bp of
MON88017 genome DNA. MON88017 event-specific qualitative PCR method was established with the primers
(MON88017-1F/R) targeting the junction regions to produce a 446 bp product. The limit of detection for qualitative PCR assay
was 0.1%. The method developed in this work is highly specific, sensitive and suitable for MON88017 sample detection.
Keywords: GMO; Event-specific detection; Qualitative PCR; MON88017 event; Left border junction fragments
随着转基因玉米的大量种植及应用, 转基因产品开
始大量进入人们的日常生活。由于转基因玉米及其产品对
人类健康和生态环境可能存在潜在的不安全因素,在转基
因玉米及其产品是否有害没有定论之前,转基因玉米及其
产品的检测是非常重要的[1]。为保障在农产品进出口贸易
中的利益, 各国相继建立转基因标识制度 , 对转基因检
测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求 , 各种转基
因检测技术也成为研究热点[2-3]。PCR 检测主要包括筛选
检测、基因特异性检测、载体特异性检测和事件特异性检
测[4-6]。PCR 反应具有高灵敏度、高特异性和高效性的特
点[7], 是目前检测转基因农作物和食品中转基因成分最为
成熟和广泛应用的方法[8-9]。
美国孟山都公司通过农杆菌介导转化方法, 将质粒
载体 PV-ZMIR39上构建的目的基因转到玉米 Hi-II细胞中,
得到了转基因玉米 MON88017。质粒载体 PV-ZMIR39 包
含 cry3Bb1和 cp4 epsps两个基因表达盒。cry3Bb1基因来
源于 Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis strain
EG4691, 编码 Cry3Bb1 蛋白 , 可以使转基因玉米
MON88017 抗玉米切根叶甲[10]; cp4 epsps 基因来源于农
杆菌 CP4菌株, 在 MON88017中表达 CP4 EPSPS蛋白(5-
烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶), 由于 CP4 EPSPS对草
甘膦不敏感 , 可以完成植物所需的芳香族氨基酸的新陈
代谢 , 因此能够起到抗草甘膦类除草剂的功能 [11]。对
MON88017 的分子生物学分析证实, 只有单一拷贝的 cp4
epsps和 cry3Bb1基因表达盒被整合到MON 88017的基因
组中的单一位点上 ; 各种表达元素完好无损 ; 没有任何
细菌质粒骨架序列插入 MON88017基因组[12]。
本实验室采用基因组步移法和巢式 PCR方法测定出
362 作 物 学 报 第 36卷

MON88017 外源 DNA 导入位点旁侧序列, 并根据旁侧序
列设计转化体特异性(event specific) PCR检测引物, 进行
定性 PCR 扩增, 确定了引物的最佳反应条件, 从而建立
起该转基因玉米品系的转化事件特异性检测方法 , 为规
范转基因产品标识制度和进出口产品检验提供有力的技
术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
转基因玉米 MON88017(由美国孟山都公司提供)、
MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、
GA21等9种, 非转基因玉米郑单958, 转基因棉花MON531,
非转基因棉花中 49, 转基因大豆 GTS40-3-2, 非转基因大
豆 1138-2。
1.2 主要试剂
DNA提取试剂盒购自杭州博日公司, Taq DNA聚合
酶及 dNTPs、DNA分子量标记(100 bp DNA marker)购自
北京天根生化公司, BD GenomeWalker 试剂盒购自美国
Clontech 公司。由上海生工生物工程有限公司合成引物,
上海博尚公司测序。
1.3 DNA提取与制备
用博日 Biospin 植物基因组 DNA 提取试剂盒, 从全
部试材的种子中提取基因组 DNA。用紫外分光光度计测
定 DNA纯度和浓度。将 MON88017 DNA溶液稀释到 100
ng µL−1备用。
1.4 DNA酶切
采用 Clontech公司的 BD GenomeWalker试剂盒, 将
MON88017 DNA用 4种限制性内切酶 Dra I、EcoR V、
Pvu II、Stu I分别置于 37℃酶切过夜(16~18 h)。然后分别
取 5 µL 用 0.6%琼脂糖凝胶电泳检测, 出现弥散状条带,
说明酶切完全。
1.5 DNA的纯化
对上述酶切产物分别加入等量的苯酚、氯仿进行离
心抽提, 取上清液加 95%乙醇、NaOAc 进行沉淀、离心,
用 TE溶解 DNA。
1.6 DNA连接试剂盒接头
利用 BD GenomeWalker试剂盒提供的连接酶将接头
连接到酶切纯化后的 DNA片段上, 16℃温浴过夜, 70℃水
浴 5 min终止反应, 用 TE溶解 DNA。
1.7 巢式 PCR
根据插入片段图谱 , 查阅相关资料获得 P-ract1 序
列。根据试剂盒提供的接头巢式引物 AP1 和 AP2, 利用
Primer premier 5.0引物设计软件在序列 P-ract1上设计两
条巢式引物 P-ractgsp1 和 P-ractgsp2。以转基因玉米
MON88017 为模板进行两轮 PCR 扩增, 引物对 AP1 和
P-ractgsp1用于第一轮 PCR反应, 扩增体系 20 µL。 PCR
程序为 94℃ 25 s, 72℃ 3 min, 6个循环; 94℃ 25 s, 64℃
30 s, 36个循环; 64℃延伸 7 min, 1个循环。引物对 AP2
和 P-ractgsp2 用于第二轮 PCR, 在第二轮 PCR中用 1 µL
第一轮扩增产物的 50 倍稀释液作为模板, PCR 扩增体系
和反应程序与第一轮 PCR 相同。用琼脂糖凝胶电泳检测
第二轮 PCR 产物, 将扩增出的清晰条带进行切割、纯化,
克隆到 TA载体上测序。对测序获得的序列进行同源性分
析。
1.8 PCR特异性检测
根据插入位点旁侧序列设计 3 对转基因玉米
MON88017 的品系特异性引物 MON88017-1F/R、MON
88017-2F/R、MON88017-3F/R, 对 3对引物进行筛选和反
应条件优化 , 确定最佳引物对。用优化好的引物对
MON88017、MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、
Bt11、Bt176、GA21等 9种转基因玉米、非转基因玉米郑
单 958、转基因棉花 MON531、非转基因棉花中 49、转基
因大豆 GTS40-3-2、非转基因大豆 1138-2 等 14 种 DNA
进行定性 PCR扩增。PCR程序为 95℃ 5 min预变性; 94
℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 36 个循环; 72℃延伸 7
min。
1.9 MON88017转化特异性定性 PCR检测灵敏度
用郑单 958 DNA对 MON88017 DNA进行梯度稀释,
DNA浓度依次为 50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、
0。用优化好的特异性引物进行 PCR检测。
2 结果与分析
2.1 测序结果分析
序列共 504 bp, 绘于图 1。
序列同源性分析表明, 从 5′端开始前 168 bp 为玉米
基因组序列, 从第169 bp至3′末端为插入到玉米中的载体序
列, 其中从第 169~479 bp为间插序列, 从第 480 bp至 3′
末端为水稻中 P-ract1 部分序列, P-ract1 是 actin1 基因



图 1 DNA序列
Fig. 1 The sequence of DNA
第 2期 袁 磊等: 转基因玉米 MON88017旁侧序列分析及定性 PCR检测 363


启动子, 驱动 cp4 epsps 基因表达。根据以上序列设计 3
对特异性引物(表 1)。
2.2 DNA提取结果
利用 DNA 提取试剂盒提取和纯化 DNA。分别用玉
米内参照基因(zSSIIb)、棉花内参照基因(SadI)、大豆内参
照基因(Lectin)对提取的总DNA进行 PCR扩增, 结果玉米
材料中能扩增出 88 bp的目标片段, 棉花材料中能扩增出
108 bp的目标片段, 大豆材料中能扩增出 118 bp的目标片
段, 空白中不能扩增出任何片段(图 2)。表明提取的 DNA质
量较好, 符合转基因植物 PCR检测的要求。
2.3 转化体特异性 PCR检测
对表 1 中 3 对特异性引物进行筛选和反应条件优化,
确定最适的特异性引物 MON88017-1F/R, 其最适退火温
度为 56℃。用该引物对全部试材进行定性 PCR 扩增, 只
有 MON88017出现 446 bp的目的片段, 其他均未出现任
何扩增片段(图 3), 说明该引物MON88017-1F/R具有较高
的特异性和准确性。
2.4 转化体特异性 PCR扩增灵敏度验证
用特异性引物 MON88017-1F/R 对不同浓度的 DNA
进行检测表明, 在 MON88017 DNA稀释至 0.1%时, 仍能
扩增出 446 bp的特异性目的片段(图 4), 说明该转基因玉
米的最低检测极限(即灵敏度)较高, 为 0.1%。
3 讨论
研究外源基因插入位点旁侧序列特征有多种方法 ,
如反向 PCR方法、TAIL-PCR方法、基因组步移法和随机

表 1 扩增所用引物
Table 1 Primer pairs used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
扩增片段长度
Fragment size (bp)

Forward: TCCTGAACCCCTAAAATCCC MON88017-1
Reverse: TTTCTCATCTAAGCCCCCAT
446
Forward: GCTCTCCTCCAACACATCAT MON88017-2
Reverse: ACTCTTTCTTTTTCTCCATA
146
Forward: ATTTTGTCCTGAACCCCTAA MON88017-3
Reverse: TTTCTCCATATTGACCACCA
248



图 2 内参照基因(zSSIIb, SadI, Lectin)的扩增
Fig. 2 Amplification of endogenous reference gene (zSSIIb, SadI, Lectin)
M: 100 bp DNA分子量标记; 1: MON88017; 2: MON810; 3: MON863; 4: NK603; 5: T25; 6: TC1507; 7: Bt11; 8: Bt176; 9: GA21; 10: 非转基因玉
米郑单 958; 11: 转基因棉花 Mon531; 12: 非转基因棉花中 49; 13: 转基因大豆 GTS40-3-2; 14: 非转基因大豆 1138-2; 15: 空白对照。
M: 100 bp DNA marker; 1: MON88017; 2: MON810; 3: MON863; 4: NK603; 5: T25; 6: TC1507; 7: Bt11; 8: Bt176; 9: GA21; 10: non-GM maize;
11: GM cotton Mon531; 12: non-GM cotton; 13: GM soybean GTS 40-3-2; 14: non-GM soybean1138-2; 15: blank control.



图 3 特异性引物 MON88017-1F/R的 PCR检测
Fig. 3 Detection for event-specific primer pair MON88017-1F/R using PCR
M: 100 bp DNA分子量标记; 1: MON88017; 2: MON810; 3: MON863; 4: NK603; 5: T25; 6: TC1507; 7: Bt11; 8: Bt176; 9: GA21; 10: 非转基因玉
米郑单 958; 11: 转基因棉花 Mon531; 12: 非转基因棉花中 49; 13: 转基因大豆 GTS40-3-2; 14: 非转基因大豆 1138-2; 15: 空白对照。
M: 100 bp DNA marker; 1: MON88017; 2: MON810; 3: MON863; 4: NK603; 5: T25; 6: TC1507; 7: Bt11; 8: Bt176; 9: GA21; 10: non-GM maize;
11: GM cotton Mon531; 12: non-GM cotton; 13: GM soybean GTS 40-3-2; 14: non-GM soybean 1138-2; 15: blank control.
364 作 物 学 报 第 36卷



图 4 特异性引物 MON88017-1F/R的灵敏度检测
Fig. 4 Sensitivity detections for event-specific primer pair
MON88017-1F/R
M: 100 bp DNA marker; MON88017 DNA浓度分别是：1: 50%; 2: 10%;
3: 5%; 4: 1%; 5: 0.5%; 6: 0.1%; 7: 0.05%; 8: 0.
M: 100 bp DNA marker; 1: 50%; 2: 10%; 3: 5%; 4: 1%; 5: 0.5%;
6: 0.1%; 7: 0.05%; 8: 0.

引物 PCR 方法等。本实验采用基因组步移法和巢式 PCR
结合的方法, 有效地消除了非特异性扩增, 极大地提高了
对特异靶标的扩增, 具有简便、快速、特异性强、灵敏性
高等优点[13]。
PCR反应中, 最影响结果判断的是假阳性和假阴性的
出现 , 本实验对所设计的引物反应条件如引物及模板浓
度、退火温度等进行了反复摸索、优化, 确定了最佳引物
对及最适反应条件。内标基因(zSSIIb、SadI、Lectin)的设
定, 排除了由于 DNA 质量以及实验操作等因素对检测结
果可靠性的影响, 避免了假阴性结果的发生。此外还设立
了阳性、阴性及空白对照, 并采取无菌操作等必要的预防
措施, 以防止样品及操作过程中的交叉污染等问题。根据
MON88017 左边界旁侧序列设计特异性引物进行定性
PCR 的检测方法具有可操作性强、稳定性好、特异性高
和灵敏度高等优点, 适用于转基因玉米 MON88017 的定
性检测。
由于定性 PCR检测技术操作过程易受污染, 而极微
量的 PCR 产物污染, 就有可能造成假阳性的结果, 并且
在 PCR反应后期, 由于DNA聚合酶活性减弱, 引物与靶
序列的结合几率变小和合成材料减少等因素影响, 使
PCR 产物的终止拷贝数与样品中的起始靶序列浓度之间
不可能建立线性关系, 因此无法对转基因玉米进行准确
定量。而目前国际上普遍采用实时荧光定量 PCR 检测方
法对转基因产品进行准确定量检测, 它具有特异性强、灵
敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优
点。笔者下一步将设计特异性的引物和探针, 对转基因产
品进行实时荧光定量 PCR检测。
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