全 文 ：·综述与专论· 2012年第10期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
自 1983 年首次获得转基因植物以来，转基因
技术（genetically modified organisms，GMOs）发展十
分迅速，并已应用于农业、医药、工业等多个领域，
尤其 1996 年开始的转基因作物商业化种植，为满足
不断增长的全球粮食需求提供了新途径，为世界的
农业生产开创了新局面［1-3］。本文是针对转基因植
物核酸检测的策略进行分析讨论，并对目前转基因
植物检测的主要技术——体外核酸扩增技术（基于
收稿日期 : 2012-04-01
基金项目 : 国家转基因生物新品种培育专项（2009ZX08012-007B，2012ZX2002-004）
作者简介 : 李亚南 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: wrj447320766@126.com
通讯作者 : 郑文明 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: zhengwenming@yahoo.cn
转基因植物核酸检测策略与体外扩增技术研究进展
李亚南 高俨　张艳 史磊 许君 郑文明
（河南农业大学生命科学学院 河南省粮食作物生理生态与遗传改良实验室，郑州 450002）
摘 要： 转基因生物（Genetically modified organisms，GMOs）特别是转基因作物的商品化应用在世界范围内迅猛发展，在推
动农业、医药和工业等领域的飞速发展的同时也逐步吸引越来越多公众注意力，生物安全问题成为突出的争论话题。转基因作物
及其产品的快速准确检测成为社会发展的急切需求，转基因技术的多样化也要求检测策略和检测技术的不断改进。系统综述针对
各种作物转基因技术和转基因产品的检测策略和技术，全面比较各种技术的特点和适用范围，并对目前面临的问题和发展趋势进
行分析。
关键词： 转基因生物 检测技术 核酸体外扩增技术 生物安全
Advance in Detection Strategy and Nuclear Acids Amplified Technology
in vitro of Biotech Crops（GMOs）
Li Yanan Gao Yan Zhang Yan Shi Lei Xu Jun Zheng Wenming
（Key Laboratory of Physiology, Ecology and Genetic Improvement of Food Crop in Henan Province,
College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002）
Abstract: Commercialization of Genetically modified organisms（GMOs）, especially Biotech crops are developing rapidly in the
worldwide, which have contributed to the rapid progress of the agriculture，medicine，industry production, and become more and more a public
concern. Biological safety is getting to be a serious issue for both public and scientific community. The development of society urgently demands
the quickly and precisely detection technology for biotech crops and their additional products. The diversity of transgenic technology also requires
the strategies and techniques for the frequently improved detection. This paper systematically reviewed the strategies and detection techniques for
all kinds of transgenic techniques and Genetically modified products, compared the characters and suiting range for the application of all kinds of
techniques. The emerging challenges and developing trends for the biotech crops detection were also dissected.
Key words: Genetically modified organisms（GMOs） Detection technology Nuclear acids amplified technique in vitro Biological
safety
PCR 的扩增技术、几种核酸扩增新技术）作系统的
综述，总结了其特点、面临问题和发展趋势。
1 转基因作物及其检测技术的发展
近年来，全球转基因作物的商业化应用迅猛发
展，产生了巨大的经济效益、社会效益和生态效益。
转基因作物对提高产量、改善品质、减少化学农药
对环境的影响和保持水土等多方面作出了巨大的贡
献。据统计，转基因作物在（1996 年 -2010 年）15
2012年第10期 53李亚南等 ：转基因植物核酸检测策略与体外扩增技术研究进展
年期间在全球产生了大约 780 亿美元的农业经济收
益，其中 40% 是由于减少生产成本（耕犁更少、杀
虫剂喷洒更少以及劳动力更少）所得的收益，60%
来自 2.76 亿 t 可观的产量收益。
根据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）
报告，2011 年，全球转基因作物种植面积增长了 8%
（1 200 万 hm2），达到 1.6 亿 hm2。其中，复合性状
转基因作物种植面积占到了全球 1.6 亿转基因作物
种植面积的 1/4。2011 年有 1 670 万农民种植了转基
因作物，比 2010 年增加了 130 万人次。2011 年是转
基因作物商业化的第16年，在连续15年（1996年-2011
年）的增长后，2011 年转基因作物种植面积持续增
加。1996 年转基因作物的种植面积为 170 万 hm2，
2011 年已达到 1.6 亿 hm2，增长 94 倍，这一增长使
得转基因技术成为现代农业史上应用最为迅速的作
物技术 ［4］。
伴随转基因植物的规模化生产应用，已有多种
检测技术应用于转基因植物的检测。在检测工作中，
依据检测目的及检测样品的差异，既可针对特定核
酸序列和外源基因表达蛋白进行分子检测，又可针
对转基因性状如除草剂抗性和抗生素抗性等进行生
化检测 ；在特定情况下，还可针对转基因操作引起
的代谢变化特征进行代谢检测。在所有的检测方法
中，核酸检测因其检测灵敏度高、特异性好、适用
范围广、操作步骤易于标准化等特点，在国内外转
基因植物检测中广泛应用。目前，核酸体外扩增技术，
由于其快速、简便、灵敏度高、特异性好、成本低、
重复性和重演性强等优点已经在转基因植物检测中
不断得到更多的应用［5］。
应用体外核酸扩增技术，可以准确检测转基因
成分的存在，不但可以检测是否转基因，还可以检
测转的是何基因，甚至可以识别是哪个转基因品系，
以及转基因成分的含量。
2 转基因植物核酸检测策略
植物转基因技术的核心是对植物遗传物质进行
人为改造。因此检测改造过的遗传物质是转基因检
测的最直接方法［6］。
在进行核酸检测时，检测特定的 DNA 序列（靶
标序列或靶标基因）是检测方法的核心内容。被检
测的特定 DNA 序列由具有特定表达功能的基因、其
相应的调控元件、转化载体序列及插入位点侧翼序
列组成，主要包括通用元件、外源目的基因、构建
特异性序列、转化体（品系）特异性序列 4 大类。
根据不同的特定 DNA 序列，核酸检测策略可以
分为 4 种，即通用元件筛选检测（Screen）、基因特
异性检测（Gene-Specific）、构建特异性检测（Construt-
Specific）和品系特异性检测（Event-specific）［7］。图
1 说明了 4 种转基因植物及其产品核酸检测策略的
图 1 转基因植物检测策略示意图及特异性比较
重点和每种策略的特异性。
2.1 通用元件筛选（Screening）检测
通用元件筛选检测主要以转基因植物的调控元
件和标记基因作为特异性扩增片段，如 FMV35S 启
动子、NOS 终止子、7S3终止子等调控元件，以及
NptII、Hpt、Pat、GUS、aad 等常用标记基因，如图
1-a 所示。由于相同的通用元件和标记基因经常被用
于多种转基因植物的研究与生产中，从而大大降低
了筛选 PCR 检测的特异性，只能用于转基因植物检
测的初步筛选使用。
2.2 基因特异性（Gene-specific）检测
基因特异性检测以插入外源目的基因的特异性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期54
DNA 片段作为目的检测片段，如 Cry1Ac、Cry1Ab、
CP4-EPSPS 和 Pat 等基因，如图 1-b 所示。不同的转
基因产品，往往含有不同的外源目的基因，因此外
源目的基因序列可作为核酸检测鉴定样品含何种转
基因成分的标志物，此方法具有较高的特异性。
2.3 构建特异性（Construct-specific）检测
构建特异性检测是通过检测外源插入载体中两
个元件的连接区 DNA 序列实现的，如图 1-c 所示。
这种方法具有相对较高的特异性，在转基因植物检
测中使用较多。
2.4 品系特异性（Event-specific）检测
品系特异性检测是通过检测外源插入载体与植
物基因组的连接区序列实现的，如图 1-d 所示。由
于每一个转基因植物品系都具有特异的外源插入载
体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是
单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有较高的特
异性和准确性。
在转基因植物检测时，可以根据以上 4 种策略
选择合适的检测方法。一般来说，首先检测常用植
物的内标准基因检测样品的来源，然后进行筛选检
测，对样品进行初步的分析，根据检测结果判断样
品是否可能含有转基因成分，再进行具体的转基因
成分分析。如通过通用元件 CaMV35S、NOS 和 NptII
的检测，可以判断样品中是否含有转基因成分，在
筛选检测获得阳性结果的前提下，可以选择基因、
构建或转化体特异性的检测方法，对样品进行进一
步检测，从而判断样品中的转基因成分是源于具体
的某种转基因性状的植物或某个转基因植物品系。
3 基于 PCR的体外扩增技术
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）
技术思路的起源是 1971 年提出的体外核酸扩增设
想，1985 年美国 PE-Cetus 公司终于将这个想法实现
了。PCR 检测的基本原理类似于 DNA 的天然复制过
程，在一个反应体系中加入所要研究的靶标基因序
列和其他反应试剂，按照适当的程序模拟 DNA 的复
制条件，控制反应体系温度变化，通过聚合酶的作
用，在体外快速、灵敏、特异地扩增目的基因片段，
使微量、特定的目标 DNA 片段在几小时内迅速扩增
至百万倍 ；由于 PCR 检测所需的 DNA 用量少、纯
度要求也不高、不需用同位素、试验安全、操作简
单、检测灵敏、效率高、成本低，使之成为当今转
基因植物检测不可或缺的方法。在转基因植物 PCR
检测过程中，由于检测原理和检测结果形式的不同，
PCR 检测可分为定性 PCR 检测（普通 PCR 检测、
复合 PCR 检测、巢式 PCR 检测等）和定量 PCR 检
测（实时荧光定量 PCR 检测、竞争性定量 PCR 检
测等）。
3.1 定性PCR检测技术（Quanlitative PCR）
3.1.1 普通 PCR 检测技术（Conventional PCR） 定
性 PCR 是一种快速、灵敏、特异的核酸检测方法，
可以在短短的几小时内使 μg 水平的某特异 DNA 片
段扩增到 ng 乃至 μg 水平供分析研究和检验鉴定
等，在转基因植物检测中已得到广泛应用。扩增产
物经琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后容易观察，不通
过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些序列。其
中，针对不同的靶 DNA 设计不同的特异性引物，
经 PCR 扩增和凝胶电泳检测靶 DNA 的普通 PCR
（conventional PCR）检测技术，能实现对不同转基因
核酸成分和不同转基因品种的特异性扩增和鉴定。
一般运用普通 PCR 方法可以检测到每克样品含
有 20 pg-10 ng 的转基因成分，对转基因产品大分子
量DNA检测的灵敏度最高可以达到样品含量0.000 1%
（这个值可以在高度优化的条件下实现，在 5×106
双倍体的基因组中检测有 5 个转基因拷贝）［7，8］。
袁磊等［9］根据玉米内参照基因 zSSIIb 和转基因
玉米中常 CaMV35S、NOS、Bt、Hpt 等基因的特异
性结构，设计 5 对定性 PCR 引物，经定性 PCR 检测，
可以准确地将转基因玉米的目的基因检出，说明这
5 对引物具有较高的特异性和准确性。由此建立了
一套转基因玉米定性 PCR 检测方法，用于转基因玉
米及其产品的筛查、抽检。
史宗勇等［10］依据农业部 869 号公告 -8-2007
转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米
Btl76 及其衍生品种定性 PCR 方法。以玉米内标基
因 zSSIIb 和外源基因 Btl76 转化体特异性序列为检
测的目的片段。对农业部转基因生物产品成分监督
检验测试中心（太原）提供转基因成分含量分别为
10%、1% 和 0.1% 的转基因玉米粉进行检测。证明
2012年第10期 55李亚南等 ：转基因植物核酸检测策略与体外扩增技术研究进展
此方法的检测灵敏度高，转基因玉米的检出下限可
达 0.1%。
杨立桃等［11］根据我国批准商业化的转基因耐
草甘膦棉花 MON88913 为研究对象，根据其 3端旁
侧序列设计引物，建立并验证了其转化体特异性定
性 PCR 检测方法。扩增结果只有 231 bp 的片段，结
果表明定性 PCR 检测方法具有高特异性，灵敏度达
到 0.05%，检测极限是 20 个拷贝棉花单倍体基因组
DNA。
目前我国已经初步形成了以普通 PCR 检测方法
为主的转基因植物检测方法 ；截至 2010 年，我国已
经研制出 70 多种转基因成分检测方法，并制订了
行业标准和国家标准 ；检测的灵敏度可以达到千分
之一以下。我国已发布抗病水稻 M12，耐除草剂玉
米 T25、NK603、GA21，耐除草剂大豆 MON89788、
A2704-12、A5547-127，抗虫玉米 MON863、MON810、
MIR604，抗虫和耐除草剂玉米 TC1507、MON88017、
59122，耐除草剂棉花 MON1445、LLcotton25、MON
88913，抗虫水稻 TT51-1 等品种的定性 PCR 检测国
家标准，为我国转基因监管提供了技术手段［3］。
3.1.2 巢式 PCR 技术（nested PCR） 巢式 PCR，又
称为套式引物（nested primer）PCR。有两对引物 ：
外引物（outer-primer）和内引物（inner-primer）。即
外引物的扩增产物中含有内引物的互补序列，外引
物扩增后的产物成为内引物的模板。这样经过两次
PCR 扩增可以大大地提高 PCR 检测的灵敏度，从而
实现对微量模板 DNA 样品的分析和检测。同时，巢
式 PCR 减少了引物非特异性退火，从而增加了特异
性扩增，提高了扩增效率，也提高了检测的灵敏度。
巢式 PCR 对含量较低的转基因植物样品的快速检测
较有效。
目前，巢式和半巢式 PCR 检测技术在转基因植
物产品检测中也得到了应用。例如，黄昆仑等［12］
运用巢式和半巢式 PCR 检测食品原料和深加工食
品中含有的转基因 DNA 时发现，巢式 PCR 可以提
供更好的灵敏度和重现性，特别是对因加工受损的
DNA 片段检出，表现良好。
闻伟刚等［13］采用半巢式 PCR 技术建立了食品
中痕量及微量转基因大米成分的检测方法。根据大
米内源 SPS 基因以及转基因大米 Bt63 含有的外源
Cry1A（b）/Cry1A（c）融合基因和 Btc 基因，分别
设计了 6 对普通与半巢式 PCR 引物。扩增结果显示，
针对理论 DNA 浓度的检测灵敏度，普通 PCR 扩增
灵敏度为 1 ng/μL 左右，半巢式 PCR 扩增灵敏度达
到 10-3-10-4 ng/μL，半巢式 PCR 比普通 PCR 方法提
高了 103-104 倍 ；在质量百分比的检测灵敏度方面，
普通 PCR 方法扩增灵敏度在 0.1%-1% 之间，半巢
式 PCR 方法的检测灵敏度能够达到 0.001%-0.01%，
半巢式 PCR 比普通 PCR 方法要提高 10 倍以上。在
实际样品的检测中，速冻汤圆、婴儿米粉及芝士小
圆饼等食品经普通 PCR 扩增，其内源 SPS 基因条带
模糊或未扩增到，进一步采用半巢式 PCR 扩增后，
能够得到清晰明亮的特异性条带。所有样品均未扩
增到外源 Cry1A（b）/Cry1A（c）和 Btc 基因。
3.1.3 复合 PCR 方法（Multiplex PCR） 复合 PCR
检测，就是将两对或者两对以上的引物在同一个反
应管中进行扩增，达到同时针对多个 DNA 模板或同
一模板的不同区域进行检测的目的。复合 PCR 检测
的优点是检测效率高、费用低，工作量小且具有很
高的检测灵敏度，只需 1 次 PCR 反应，就能检测多
个靶基因。复合 PCR 检测方法建立的难点在于 PCR
引物的设计和 PCR 反应条件的优化以及保证每对引
物反应效率一致性 ；同时扩增的目的片段大小也不
能太接近，否则凝胶电泳时难以分开，无法辨别。
复合 PCR 检测方法已经在转基因植物检测中广
泛应用。例如，Onishi［14］等和 James 等［15］建立了
转基因玉米（Event176，Bt11，Mon810 和 T14/25）、
大豆（Roundup Ready）、转基因玉米品系（MON810、
NK603、T25、Bt11、MON863、Starlink、TC1507、
GA21 和 Event176）、油菜（GT73、HCN92/28、MS8/
RF3 和 Oxy235）的复合 PCR 检测方法，其检测灵敏
度为 0.1%。Germini 等［16］报道了在一个 PCR 反应
中最多可以同时检测 5 种转基因植物转化体（转基
因玉米转化体 MON810、Bt11、Bt176、GA21 和转
基因 Roundup Ready 大豆）的 7 个目的基因，且具
有较高的检测灵敏度（0.06%-0.25%）。敖金霞等［17］
将多重 PCR 和巢式 PCR 结合应用，建立了可同时
检 测 Cry1A（b） 基 因、BAR 基 因、CP4-EPSPS 基
因、PAT 基因及共同的内标准基因 RBCL 的五重巢
式 PCR 检测技术。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期56
3.2 定量PCR检测（Quantitative PCR）
3.2.1 实时荧光定量 PCR 检测（Real-time quantitative
PCR） 荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied
Biosystems 公司推出，该技术实现了 PCR 从定性到
定量的飞跃，其基本原理是在 PCR 反应体系中加入
荧光基团，在封闭环境下对整个扩增过程进行检测。
荧光信号随 PCR 产物的积累而相应增加，通过对荧
光信号的追踪从而实现对PCR起始模板定量的目的。
定量的结果可以通过标准曲线的方法得到，也可通
过直接比较两个 Ct 值的方法（△ Ct）得到［18］。
在荧光定量 PCR 技术发展过程中，由于采用的
荧光基团发光原理的不同，该技术又分为很多种。例
如，SYBR Green I 荧光染料、FRET、TaqMan、Mo-
lecular Beacon 等。荧光定量 PCR 技术是集 PCR 扩
增技术、探针杂交技术和荧光共振能量转移光谱技
术于一体的新兴技术，与常规 PCR 扩增技术相比，
其特点是特异性好，实时定量 PCR 技术通过引物或
和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的
准确性，假阳性低 ；灵敏度高，采用灵敏的荧光检
测系统对荧光信号进行实时监控 ；线性关系好，由
于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关
系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行
定量分析，误差小，操作简单，自动化程度高，实
时定量 PCR 技术对 PCR 产物的扩增和检测在闭管
的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染
环境机会少；没有后处理，不用杂交、电泳、拍照［19-21］。
Babekova 等［22］在实时荧光定量 PCR 中，把包
含一个拷贝的克螟稻 1 号转化事件特异性序列和一
个拷贝的水稻内标准基因 gos9 双目标杂交扩增子作
为合成的标准物质代替基因组 DNA 进行定量，该方
法的定量下限为 0.05%。
Gasparic 等［23］比较了 9 种在转基因生物定性、
定量检测中有前景的实时荧光 PCR 化学物质——序
列非特异的 DNA 标记染料 SYBR Green、基于引物
的标记技术 AmpliFluor、Plexor、Lux primers、基于
杂交的双标记 molecular beacon 探针、水解的双标记
TaqMan、CPT、LNA 和 MGB 探针，通过比较它们
的 PCR 扩增效率和检出下限和定量下限，从实用性
和与应用参数相关的成本全面考虑它们的适用性 ；9
种化学物质不相上下，但在定量检测方面，某些特
征支持 LNA 和 MGB 技术作为 TaqMan 探针的替代，
SYBR Green、molecular beacon 表现的同样好，但在
应用之前需要更多的优化。
杨立桃等［24］根据已经批准商业化的转基因棉
花 Mon15985 的 5端旁侧序列和 Mon88913 的 3端
旁侧序列，设计引物和探针，通过优化定量 PCR 检
测方法的引物探针浓度，PCR 检测体系，建立了转
基因棉花 Mon15985 和 Mon88913 的品系特异性定量
PCR 检测方法，结果证明了这两种转基因棉花品系
特异性定性 PCR 检测方法具有高特异性，灵敏度达
到 0.05%，定量 PCR 检测方法的检测下限和定量下
限分别约 10 和 17 个拷贝。
3.2.2 竞争性定量 PCR 检测（competitive quantitative
PCR） 竞争定量 PCR 是 Gilland 等［25］于 1990 年首
先发明的，可用于 DNA 和 RNA 的定量。竞争性 PCR
是向样本中加入一个作为内标的竞争性模板，它与
目的基因具有相同的引物结合位点，在扩增中二者
的扩增效率基本相同，且扩增片段在扩增后易于分
离，然后根据内标的动力学曲线求得目的基因的原
始拷贝数。它首先需要构建含有修饰过的内部标准
DNA 片段（竞争子 DNA），与待测 DNA 进行共扩增，
因竞争 DNA 片段和待测 DNA 的大小不同，经琼脂
糖凝胶电泳可将两者分开，并可进行定量分析。
该方法的实验原理比较巧妙，实验程序设计较
为严谨，采用构建的竞争 DNA 与样品 DNA 中相互
竞争相同底物和引物，并根据电泳结果作出工作曲
线图，从而得到可靠的定量分析结果。在瑞士进行
的试验表明，QC-PCR 的灵敏性达到 0.1%［26］。欧洲
12 个实验室使用 QC-PCR 对 0.5% 和 2% 的 RRS 进
行检测，246 例中没有假阴性或假阳性结果出现，说
明 QC-PCR 实验室间误差小于定性 PCR［27］。在 QC-
PCR 中，使用了通过 DNA 重组技术构建的内标竞
争 DNA（Internal standard competitive DNA），这对于
一般实验室难度较大。QC-PCR 对实验仪器要求不
高，不足之处是需利用基因重组技术构建标准竞争
DNA，且每次检测需要作多个标准样品的对照，不
太适合高通量的样品检测。QC-PCR 适合用于衡量
样品转基因成分含量是否达到或者低于 1% 限量值。
Hardegger 等［28］建立了 CaMV35s 启动子和 NOS
2012年第10期 57李亚南等 ：转基因植物核酸检测策略与体外扩增技术研究进展
终止子的竞争性定量PCR分析体系。Zimermann等［29］
利用该方法建立了转基因 Bt11 玉米的定量 PCR 分
析体系。
4 核酸扩增检测新技术
4.1 环介导的等温扩增（LAMP）
2000 年 Notomi 等建立了一种新的体外扩增特异
DNA 片段的分子生物学技术，即环介导等温扩增技
术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。
该技术针对靶标基因的 6 个特异区域，设计 4 条特
异性引物，即正向内侧引物（FIP）、正向外侧引物
（F3）、反向内侧引物（BIP）、反向外侧引物（B3），
利用一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶（BstDNA
聚合酶）在 60-65℃等温条件下高效特异地扩增目
的基因，反应可在 1 h 之内完成，产生具有目的基
因的交替反向重复序列的大小不一的茎环 DNA 链。
产物通过凝胶电泳、荧光染料或扩增副产物焦磷酸
镁沉淀［30，31］判断检测结果。
与传统 PCR 方法相比，LAMP 方法具有灵敏度
高、特异性好、简单快速、不需要特殊仪器等优点，
在核酸的科学研究、转基因食品检测等领域得到了
日益广泛的应用 ；LAMP 方法的灵敏度可达到传统
PCR 方法的 10 倍以上［32］。
LAMP 已被用于检测转基因作物中 CaMV35S 启
动子、NOS 终止子、抗性基因 NPTII［33］。刘彩霞等［34］
对 Roundup Ready 转基因大豆及加工品外源基因
EPSPS 进行 LAMP 检测，检测限为 0.01%，高于国
际现行限量值 0.5% 的要求。Liu 等［35］以 Roundup
Ready 转基因大豆 CaMV35S 启动子与 EPSPS 基因
间构建的特异性序列为靶基因，克隆构建载体进行
LAMP 扩增，经 SYBR Green 染色，肉眼观察可检测
结果，凝胶电泳检测相比巢式PCR灵敏度要高10倍。
LAMP 方法需要识别靶序列 6 个位点的 4 个引
物，在引物设计上有较高的要求，这也是 LAMP 方
法大范围应用的瓶颈所在。 LAMP 技术从其反应条
件、引物设计、目的序列长度、茎环结构大小以及
反应体系等方面的进一步摸索和优化，使 LAMP 技
术不仅能适用于转基成分的筛选检测，更能适用于
特异性更高的基因特异性、构建特异性甚至是转化
事件特异性的检测，LAMP 技术在转基因产品检测
领域将有更为广阔的发展前景。
4.2 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）
依赖核酸序列的扩增技术（nucleic acid seque-
nce-based amplification，NASBA）是在 PCR 基础上
发展起来的一种等温扩增技术 ［36］。该方法使用到
3 种酶，即 AMV 逆转录酶、T7 噬菌体 RNA 聚合
酶、RNA 酶 H。该方法的关键在于引物的设计，其
中，上游引物 5端含有 T7 启动子序列，下游引物
与目标序列相同，其扩增原理，如图 2 所示。反应
过程分两步，非循环阶段，产生双链 DNA，它含有
T7RNA 聚合酶的识别序列 ；在 T7RNA 聚合酶作用
下以 dsDNA 为模板指数扩增进入循环阶段，最终产
生大量单链 RNA 分子。与普通 PCR 相比，NASBA
反应在41℃进行，可在2 h内将模板RNA扩增109倍，
比常规 PCR 法高 103 倍，而且不需特殊仪器。
一般 NASBA 扩增的终产物是反 cRNA，最初这
种方法主要是用来进行 RNA 扩增［37］。据报道此方
法同样适合 DNA 扩增［38，39］。
NASBA 技术灵敏度高、动态范围宽、可进行实
时定量分析和复合检测，与芯片杂交技术结合可以
进行转基因检测。Morisset 等发明了一种结合芯片
分析的 NASBA 技术（NASBA implemented microarray
analysis，NAIMA），通过 NASBA 技术扩增后产生大
量 RNA 分子，将产物与荧光分子连接制备成探针，
再与芯片杂交实现定量检测。设计了两种三重扩增
方式结合芯片定量检测玉米转基因成分，其结果与
RT-PCR 检测一致，检测范围为 0.1%-25%。该技术
特异性好、灵敏度高、快速、操作简单，而且能同
时检测多个基因，有望成为未来大批量转基因产品
检测的可选方法［40，41］。
图 2 NASBA的扩增原理
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期58
4.3 连接酶检测反应（LCR）
连接酶链式反应（ligase chain reaction，LCR），
是 Backman1997 年为检出靶基因序列中的点突变而
设计发明，并申报了专利。LCR 是通过 1 对相邻引
物与 DNA 双链中的一条链杂交，然后利用一种耐高
温 DNA 连接酶进行连接的反应。该方法需合成 1 对
覆盖靶序列的引物。当引物与靶序列退火结合之后，
高温连接酶检测到模板 DNA 与两条探针 DNA 的接
头处如果完全匹配，则连接反应进行，然后再经过
变性、退火、连接的循环反应，实现线性扩增［42］。
该反应利用两对引物，分别与靶序列结合。然后经
过变性、退火、连接的循环反应，每次反应的产物
又可在下一轮反应中当模板，靶序列以指数形式扩
增［43］。另外，在 LCR 反应前先对靶序列进行 PCR
扩增，再进行LCR分析，也可实现靶序列的大量扩增，
即PCR/LCR的方法［44］。LCR的扩增效率与PCR相当。
由于有很高的信噪比，其灵敏性也很高。用 Taq连
接酶做 LCR 只在两个保温点的循环（94℃、1 min
和 65℃、4 min），产物检测也较方便、灵敏。因此，
可以说 LCR 是目前检测已知序列中有无点突变的最
佳方法。PCR/LCR 与芯片捕获技术相结合可以对转
基因玉米（Bt-176）进行检测，Bordoni 等［42， 45］报
道了该方法的使用，并证明了该方法的特异性和高
效性。
4.4 多重置换扩增（MDA）
耐核酸外切酶活性的随机引物和噬菌体
phi29DNA 聚合酶（具有链置换特性）可用于环状
DNA 的恒温滚环扩增，这些组分也可被用来扩增线
性 DNA，称为多重置换扩增（multiple displacement
amplification，MDA）［46］。它是近年迅速发展起来
的一种全基因组扩增（Whole genome amplification，
WGA）技术。在恒温条件下即可反应，而无需 PCR
热循环过程。
随机引物在多个位点与变性后的单链基因组模
板退火，在噬菌体phi29DNA聚合酶作用下进行延伸；
合成出的 DNA 新链可置换下游的模板互补链，被置
换的单链又作为新的模板与随机引物退火进行 DNA
合成。反应产物为呈分支状的网络样 DNA，包含模
板 DNA 的数千乃至数百万拷贝（图 3）［47-49］。
MDA 扩增全基因组具有高度的灵敏性、重现
性、保真性和高产性，可从微量样本中获得充足的
DNA，并能够较准确地反映模板中不同序列的拷贝
数差异［50］。2008 年 Roth 等［51］将 MDA 技术应用于
制备转基因检测标准物质，以转基因玉米 MON810
为对象，MDA 扩增基因组 DNA，利用实时荧光 PCR
检测扩增效率和偏移性。数据表明，100 ng DNA 增
加 10 倍、0.1 ng DNA 增加 2 300 倍，偏移在预期范
围内。因此，用此方法获得的基因组 DNA 适合作为
标准物质进行转基因产品定性分析检测。
与 PCR 相比，MDA 技术对样品 DNA 的质量要
求不高 ；能对未经纯化和含有 PCR 抑制物的微量样
品进行全基因组均匀扩增［48，49］，并且可以获得较
高纯度的 DNA 产物。Gonzalez 等［52］成功的对普通
PCR 未能扩增的复杂自然微生物样品进行了检测。
他们采用 MDA-PCR 方法，通过 MDA 预扩增微生物
样品使模板量增加，再利用特异 PCR 检测，结果检
测灵敏度比普通 PCR 提高一个数量级。
图 3 多重置换扩增
4.5 滚环扩增检测技术（RCA）
环型 DNA（又称为挂锁探针）即由衔接体连
接的两段寡聚核苷酸链，环上有两部分与靶基因互
补配对［53］。一旦探针结合到目的片段上，在 DNA
连接酶的作用下可将切口封闭。环型 DNA 所结合
的滚环扩增，即滚环 DNA 扩增（rolling circle DNA
amplification，RCA）技术。
在单一引物RCA中，一个环型DNA（扩增模板）、
一条 DNA 引物，在一种 DNA 多聚酶（最常用的是
phi29DNA 聚合酶、有时是 RNA 聚合酶或 bstDNA
聚合酶）的作用下，以这个环型 DNA 为模板，催
化 dNTP 合成单链 DNA 联聚分子，该分子由上千个
反复衔接的环型 DNA 链的拷贝构成。多引物 RCA
（multiply primed RCA）是由一个环型 DNA 模板和多
2012年第10期 59李亚南等 ：转基因植物核酸检测策略与体外扩增技术研究进展
条DNA引物组成的RCA扩增。与其他扩增反应相反，
RCA 产生的单链的扩增产物，其一端仍然连接在固
相支持物（如玻片、微孔板等）表面的 DNA 引物或
抗体上，因此，RCA 是一种适合在芯片上（on chip）
进行信号扩增的新技术，它既能提供研究分析的灵
敏性和特异性，又能保持立体分析的多元性。另外，
RCA 是一种等温信号扩增方法，其线性扩增倍数为
105，指数化扩增能力大于 109。由此可见，RCA 亦
是一种痕量的分子检测方法，可用于极其微量转基
因植物的检测与研究，成为转基因产品的定性定量
检测的有效手段。
RCA 技术使用的引物含有两段与靶序列互补的
片段，中间通过一段序列连接起来形成的环状寡聚
核苷酸［54］。RCA 技术对靶序列进行线性扩增，效率
高，具有进行复合检测的潜力，且检测极限为靶序
列的 10 个拷贝［55］，故可以应用到以芯片为基础进
行多重分析的检测中，非常适合转基因检测对灵敏
度的要求。
5 展望
随着各种转基因植物的迅速发展，由此衍生而
来的转基因产品数量也迅速增加，并引起了社会各
界对转基因的关注。为了促进转基因产品的健康发
展，各国政府对转基因产品的研制、生产及销售环
节都制定了相关管理条例，转基因产品的标识也陆
续被各国政府列为强制性措施。转基因产品标识制
度能否顺利实行的关键在于能否建立准确可靠的转
基因产品检测技术。人们对健康和环境的日益关注
以及国际贸易的需求都对转基因检测技术及其准确
度和可靠性不断提出挑战。因此，各种新的检测技
术不断涌现。
目前，基于 PCR 技术的检测方法是转基因检测
的常规方法。以 PCR 技术为基础的转基因检测方法
主要的挑战在于，转基因材料的获取、DNA 抽提的
方法、有效的成本控制、多重检测以及检测的重复
性和稳定性 ；过去的研究主要包括特定作物内标准
基因的确定、转化相关的特征、对一些 GMOs 进行
特异性、灵敏度定性、定量检测方法的探讨，使得
对 GMOs 进行检测的方法和策略的理解和表述更加
科学、成熟。尽管传统 PCR 有着各种各样的优点，
但在应用方面，由于其所需仪器精密、复合检测的
局限性和不能用于现场检测等缺点，在某些检测的
应用中略显不足。其他可选择的核酸扩增新方法在
某些方面弥补了传统 PCR 技术的不足。在表 1 中列
出了上文所述的核酸扩增方法的优缺点。
表 1 各种转基因核酸检测方法的比较
a ：94℃变性，55-60℃退火，72℃延伸
常用的基于 PCR 技术的定性、定量转基因成分
检测方法，具有特异性好、灵敏度高等优点而被普
遍的运用。近年来发展起来的核酸扩增检测新技术
与传统 PCR 技术相比，在简单的条件即可实现靶模
板的扩增，其扩增效率高、操作简便、产物肉眼可
见，适合于现场和试验条件较简单的实验室进行快
捷检测。这类技术如 NASBA 方法，所使用的关键试
剂尚不是常规产品而是受到专利保护的试剂，因而
基于 PCR 扩增方法 核酸扩增新方法
参数 普通 PCR 巢式 PCR 复合 PCR 荧光定量 PCR 竞争定量 PCR LAMP NASBA LCR MDA RCA
反应温度 循环温控 循环温控 循环温控 循环温控 循环温控 等温 等温 循环温控 等温 等温
反应酶种类 1 1 1 1 1 1 2-3 1 1 1
引物设计 简单 较复杂 复杂 较复杂 简单 复杂 复杂 较复杂 复杂 简单
模板是否需
要变性 是 是 是 是 是 否 是 是 是 是
运用难度 容易 难 难 难 难 难 难 难 难 难
专用仪器 要 要 要 要 要 不要 不要 要 不要 不要
能否定量 不能 不能 不能 能 能 不能 不能 不能 不能 不能
特异性 高 高 高 高 高 高 高 高 低 高
灵敏性 高 很高 高 很高 较高 高 高 高 高 高
应用范围 科研检验现场 科研 科研 科研 科研 科研检验现场 科研 科研 科研 科研
需要时间 1-2 h 2-4 h 2-3 h 2-3 h 4-5 h 1-2 h 4-5 h 1-2 h 16 h 4-6 h
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期60
其检测的成本较高。在使用中，因灵敏度的提高对
操作人员和检测环境也提出了更高的要求，而 MDA
技术还只是用于样品的预扩增，不能进行特异片段
的直接检测。同样受专利保护的 LAMP、LCR 技术
虽无需特殊的试剂，但对引物的设计的要求比较高，
有时无法区分发生的非特异扩增。另外，RCA 是一
种适合在芯片上（on chip）进行信号扩增的新技术，
可以应用到以芯片为基础进行多重分析的检测中。
虽然 RCA 可以进行高通量的检测，但其合成的产物
需要连接在固相支持物（如玻片、微孔板等）表面
的 DNA 引物或抗体上，操作复杂，成本较高。由此
可见，在以 PCR 方法为主导的前提下，需要各种技
术互相配合、互为补充才能使实现转基因检测的灵
敏、特异和操作简便。
近年来，随着基因芯片技术的成熟化、常规化
和新一代高通量测序技术（WGS）的低成本化，这
些先进技术的普及必然推动转基因检测技术更快发
展，使转基因定性定量检测技术朝着高灵敏度、高
特异性、低成本、高通量、自动化和使用方便的方
向发展。
参 考 文 献
［1］ 贾月梅 . 转基因植物检测技术的发展 . 世界农业 , 2007（6）：
54-56.
［2］ 黄东亚 , 赵文 , 李校堃 , 等 . 利用放射免疫技术快速检测转基因
植物 . 农业生物技术学报 , 2005, 13（3）：310-314.
［3］ http ：//www. most. gov. cn/tztg/201010/t20101026_82914. htm.
［4］ Clive J. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops［M］.
Ithaca, NY ：ISAAA, 2011 ：43.
［5］ 段武德 . 转基因植物检测［M］ . 北京 ：中国农业出版社 , 2009.
［6］ 郭斌 , 祁洋 , 尉亚辉 , 等 . 转基因植物检测技术的研究进展 . 中
国生物工程杂志 , 2010, 30（2）：120-126.
［7］ Holst-Jensen A, Ronning SB, Lovseth A, et al. PCR technology
for screening and quantification of genetically modified organisms
（GMOs）. Anal Bioanal Chem, 2003, 375（8）：985-993.
［8］ Bryant J, Leather S. Removal of selectable marker genes from
transgenic plant ：needless sophisti-cation or social necessity.
Trends Biotechnol, 1992, 10（8）：274-275.
［9］ 袁磊 , 赵蕾 , 孙红炜 , 等 . 转基因玉米的定性 PCR 检测 . 山东
农业科学 , 2009（11）：8-10.
［10］ 史宗勇 , 袁建琴 . 抗虫和耐除草剂玉米 Btl76 定性 PCR 检测的
灵敏度研究 . 农业与技术 , 2009, 29（3）：25-27.
［11］ 杨立桃 , 蒋玲曦 , 沈凯琳 , 等 . 转基因棉花 MON88913 转化体
特异性定性、定量 PCR 检测方法 . 食品安全质量检测技术 ,
2009, 1（1）：10-19.
［12］ 黄昆仑 , 罗云波 . 用巢式和半巢式 PCR 检测转基因大豆
Roundup Ready 及其深加工食品 . 农业生物技术学报 , 2003,
11（5）：461-466.
［13］ 闻伟刚 , 盛蕾 , 张吉红 , 等 . 痕量及微量转基因大米成分半巢
式 PCR 检测方法的建立 . 食品科学 , 2008, 29（12）：622-626.
［14］ Onishi M, Matsuoka T, Kodama T. Development of a multiplex
polymerase chain reaction method for simultaneous detection of
eight events of genetically modified maize. J Agric Food Chem,
2005, 53（25）：9713-9721.
［15］ James D, Schmidt AM, Wall E. Reliable detection and identification
of genetically modified maize, soybean, and canola by multiplex
PCR analysis. J Agric Food Chem, 2003, 51（10）：5829-5834.
［16］ Germini A, Zanetti A, Salati C. Development of a seven-target
multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean
and maize in feeds and foods. J Agric Food Chem, 2004, 52（11）：
3275-3280.
［17］ 敖金霞 , 高学军 , 于艳波 , 等 . 转基因大豆、玉米、水稻深加
工产品的五重巢式 PCR 技术检测 . 中国农业大学学报 , 2010,
15（2）：93-99.
［18］ 黄留玉 . PCR 最新技术原理、方法及应用［M］. 北京 ：化学
工业出版社 , 2005.
［19］ Whitcombe D, Brownie J, Gillard HL, et al. A homogeneous
fluorescence assay for PCR amplicons ：its application to real-time,
sing-tube genotyping. Clin Chem, 1998, 44（5）：918-923.
［20］ Morros T, Tobertson B, Gallagher M. Rapid reverse transcription-
PCR detection of hepatitis C virus RNA in serum by using the
TaqMan fluorogenic detection system. Clin Microb, 1996, 34（12）：
2933-2936.
［21］ 蒋春燕 . 实时荧光定量 PCR 技术 . 动物医学进展 , 2005, 26
（12）：97-101.
［22］ Babekova R, Funk T, Pecoraro S, et al. Development of an event-
specific Real-time PCR detect-ion method for the transgenic Bt rice
line KMD1. Eur Food Res Technol, 2009, 228（5）：707-716.
［23］ Gasparic MB, Tengs T, La Paz JL, et al. Comparison of nine
different real-time PCR chemistries for qualitative and quantitative
2012年第10期 61李亚南等 ：转基因植物核酸检测策略与体外扩增技术研究进展
applications in GMO detection. Anal BioanalChem, 2010, 396（6）：
2023-2029.
［24］ Lee SH, Kim JK, Yi BY. Detection methods for biotech cotton MON
15985 and MON 88913 by PCR. J Agric Food Chem, 2007, 55（9）：
3351-3357.
［25］ Gilliland G, Perrin S, Bunn HF, et al. Analysis of cytokine mRNA
and DNA ：Detection and quantitation by competitive polymerase
chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87（7）：2725-
2729.
［26］ Studer E, Rhyner C, Lüthy J, et al. Quantitative competitive PCR
for the detection of genetically modified soybean and maize. Z
Lebensm Unters. Forsch A, 1998, 207（3）：207-213.
［27］ Hübner P, Studer E, Luthy J. Quantitative competitive PCR for the
detection of genetically modified organisms in food. Food Control,
1999, 10（6）：353-358.
［28］ Hardegger M, Brodmann P, Herrmann A. Quantitative detection
of the 35S promoter and the NOS terminator using quantitative
competitive PCR. Eur Food Res Technol, 1999, 209（2）：83-87.
［29］ Zimmermann A, Lüthy J, Pauli U. Event-specific transgene
detection in Bt11 corn by quantitati-ve PCR at the integration site.
LWT-Food Science and Technol, 2000, 33（3）：210-216.
［30］ Fukuta S, Mizukami Y, Ishida A, et al. Real-time loop-mediated
isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening
method for genetically modified organisms. European Food
Research and Technology, 2004, 218（5）：496-500.
［31］ Maeda H, Kokeguchi S, Fujimoto C, et al. Detection of periodontal
pathogen Porphyromonas gingivalis by loop-mediated isothermal
amplification method. FEMS Immunology and Medical Microbio-
logy, 2005, 43（2）：233-239.
［32］ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated
isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 2000, 28
（12）：e63.
［33］ Guan X, Guo J, Shen P, et al. Visual and rapid detection of two
genetically modified soybean events using loop-mediated isothermal
amplification method. Food Analytical Methods, 2010, 3（4）：
313-320.
［34］ 刘彩霞 , 梁成珠 , 徐彪 , 等 . 抗草甘膦转基因大豆及加工品
LAMP 检测研究 . 大豆科学 , 2009, 28（2）：305-309.
［35］ Liu M, Luo Y, Tao R, et al. Sensitive and rapid detection of genetic
modified soybean（Roundup Ready）by loop-mediated isothermal
amplification. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73（11）：
2365-2369.
［36］ Compto J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature,
1991, 350（7）：91-92.
［37］ Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, et al. NASBA isothermal
enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the
diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods, 1991, 35（3）：273-
286.
［38］ Berard C, Cazalis MA, Leissner P, et al. DNA nucleic acid
sequence-based amplification-based genotyping for polymorphism
analysis. Bio Techniques, 2004, 37（4）：680-686.
［39］ Timmermans EC, Tebas P, Ruiter JP, et al. Real-time nucleic
acid sequence-based amplification assay to quantify changes in
mitochondrial DNA concentrations in cell cultures and blood cells
from HIV-infected patients receiving antiviral therapy. Clin Chem,
2006, 52（6）：979-987.
［40］ Morisset D, Dobnik D, Hamels S, et al. NAIMA：target amplification
strategy allowing quantitative on-chip detection of GMOs. Nucleic
Acids Res, 2008, 36（18）：e118.
［41］ Dobnik D, Morisset D, Gruden K. NAIMA as a solution for future
GMO diagnostics challenges. Anal Bioanal Chem, 2009, 396（6）：
2229-2233.
［42］ Bordoni R, Mezzelani A, Consolandi C, et al. Detection and
quantitation of genetically modified maize（Bt-176 transgenic
maize）by applying ligation detection reaction and universal array
technology. J Agric Food Chem, 2004, 52（5）：1049-1054.
［43］ Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using
cloned thermostable ligase. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88（1）：
189-193.
［44］ Gerry NP, Witowski NE, Day JP, et al. Universal DNA microarry
method for multiplex detection of low abundance point mutations. J
Mol Biol, 1999, 292（2）：251-262.
［45］ Bordoni R, Germini A, Mezzelani A, et al. A microarray platform for
parallel detection of five transgenic events in foods ：a combined
polymerase chain reaction-universal array method. J Agric Food
Chem, 2005, 53（4）：912-918.
［46］ Zhang D, Wu J, Ye F, et al. Amplification of circularizable probes
for the detection of target nucleic acids and proteins. Clin Chim
Acta, 2005, 363（1-2）：61-70.
［47］ Hawkins TL, Detter JC, Richardson PM. Whole genome amplifi-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期62
cation-applications and advances. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13
（1）：65-67.
［48］ Hughes S, Arneson N, Done S, et al. The use of whole genome
amplification in the study of human disease. Prog Biophys Mol Biol,
2005, 88（1）：173-189.
［49］ Dean FB, Hosono S, Fang L, et al. Comprehensive human genome
amplification using multiple displacement amplification. PNAS,
2002, 99（8）：5261-5266.
［50］ Lasken RS, Egholm M. Whole genome amplification ：abundant
supplies of DNA from precious samples or clinical specimens.
Trends Biotechnol, 2003, 21（12）：531-535.
［51］ Roth L, Zagon J, Laube I, et al. Generation of reference material
by the use of multiple displacement amplification（MDA）for
the detection of genetically modified organisms（GMOs）. Food
Analytical Methods, 2008, 1（3）：181-189.
［52］ Gonzalez J, Portill OM, Saiz-Jimenez C. Multiple displacement
amplification as a pre-polymer-ase chain reaction（pre-PCR）to
process difficult to amplify samples and low copy number sequences
from natural environments. Environmental Microbiology, 2005, 7
（7）：1024-1028.
［53］ Zhang D, Wu J, Ye F, et al. Amplification of circularizable probes
for the detection of target nucleic acids and proteins. Clin Chim
Acta, 2006, 363（1-2）：61-70.
［54］ Zhang DY, Zhang WD, Li XP, et al. Detection of rare DNA targets
by isothermal ramification amplification. Gene, 2001, 274（1-2）：
209-216.
［55］ Demidov VV. Rolling-circle amplification in DNA diagnostics ：the
power of simplicity. Expert Rev Mol Diagn, 2002, 2（6）：542-548.
（责任编辑 狄艳红）