全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月 423
收稿 2009-11-30 修定 　2010-03-05
资助 安徽省教育厅重点项目(2006KJ054A)和安徽省教育厅
十五人才基金。
* 通讯作者(E-mail: swkx12@ahau.edu.cn; Tel: 0551-5786232)。
硝普钠、植酸和水杨酸对悬浮培养的霍山石斛原球茎生长和生理活性的
影响
黄蓓, 洪萨丽, 金青, 张士鸿, 蔡永萍 *, 林毅
安徽农业大学生命科学学院, 合肥 230036
提要: 在建立霍山石斛的液体悬浮培养技术的基础上, 添加诱导子硝普钠(SNP)、植酸(PA)和水杨酸(SA)。3种诱导子均可
促进霍山石斛原球茎中生物碱的积累, 0.1 mmol·L-1 SNP、7.5 g·L-1 PA和100 μmol·L-1 SA处理的原球茎, 其生物碱含量分别
为不作处理的 2.02倍、1.84倍和 1.62倍。促进霍山石斛生物碱积累的适宜诱导子为SNP, 其适宜浓度为 0.1 mmol·L-1。高
浓度的3种诱导子均导致培养液酸化, 原球茎的相对电导率上升, 其生物量和生物碱含量明显下降。
关键词: 霍山石斛; 原球茎; 悬浮培养; 生物碱; 诱导子
Effects of SNP, PA and SA on Cell Growth and Physiological Activities of Sus-
pension-Cultured Protocorn-Like Bodies of Dendrobium huoshanense C. Z.
Tang et S. J. Cheng
HUANG Bei, HONG Sa-Li, JIN Qing, ZHANG Shi-Hong, CAI Yong-Ping*, LIN Yi
School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: It was studied the influence of sodium nitroprusside (SNP), phytic acid (PA) and salicylic acid (SA)
on cell growth and the alkaloid accumulation of suspension-cultured protocorn-like bodies (PLBs) of Dendrobium
huoshanense. The results showed that all the three elicitors could enhance the accumulation of alkaloid. When
treated with 0.1 mmol·L-1 SNP, 7.5 g·L-1 PA, and 100 μmol·L-1 SA, respectively, the alkaloids accumulation
elevated to 2.02-, 1.84-, and 1.62-fold compared with control. The appropriate elicitor was SNP, whose opti-
mum concentration was 0.1 mmol·L-1. High concentration of three elicitors could cause the medium acidifica-
tion and increase the relative conductivity of PLBs, resulted in reduced biomass and alkaloids quantity.
Key words: Dendrobium huoshanense; protocorm-like bodies; suspension culture; alkaloids; elicitor
霍山石斛富含生物碱和多糖等生物活性成分,
对人体抗衰老、提高免疫力有功效(吕素芳等2006)。
我国霍山石斛野生种质资源十分匮乏, 随着组织培
养技术的发展, 有人以其试管苗大量繁殖出霍山石
斛(吴志刚等 2005)。还有研究表明, 液体悬浮培养
条件下, 原球茎中生物碱含量与试管苗和栽培苗相
当(罗建平等2003), 因此, 探讨原球茎悬浮培养技术
可能是解决霍山石斛资源短缺的有效途径之一。
植物细胞培养中, 诱导子的添加是增强代谢产物合
成的有力手段(Wang等 2004)。它能快速、专一和
有选择的诱导某些特定基因的表达, 通过改变次生
代谢途径中催化酶活性来达到提高次生代谢产物产
量的目的(肖春桥等 2004)。我们课题组在建立霍山
石斛液体悬浮培养体系后(金青等2008), 在悬浮培养
体系中加入诱导子硝普钠(sodium nitroprusside,
SNP)、植酸(phytic acid, PA)和水杨酸(salicylic
acid, SA), 比较分析其对霍山石斛悬浮培养原球茎
的生长和生物碱积累以及对生物碱合成过程中的过
氧化物酶(peroxidase, POD)和苯丙氨酸解氨酶(L-
phenylalanin ammonia lyase, PAL)活性的影响, 以期
为采用植物细胞悬浮培养技术提高霍山石斛的生物
碱含量提供技术参考。
材料与方法
实验材料为霍山石斛(Dendrobium huoshanense
C. Z. Tang et S. J. Cheng)原球茎, 由本校生命科学
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月424
学院诱导。培养基为 1/2MS(大量元素减半)+0.25
mg·L-1 NAA+0.30 mg·L-1 6-BA+40 g·L-1蔗糖, pH为
5 .8。诱导期间在转速为 120 r ·min- 1和温度为
(25±2) ℃的恒温摇床进行培养, 使用漫射光, 光照
强度为 2 μmol·m-2·s-1, 相对湿度为(60±10)%。
霍山石斛原球茎的诱导处理时, 取生长疏松、
淡黄色的原球茎接种于分别含有SNP浓度为 0 (对
照)、0.025、0.05、0.1、0.2和 0.5 mmol·L-1, PA
浓度为 0 (对照)、1、2.5、5、7.5和 10 g·L-1, SA
浓度为 0 (对照)、10、50、100和 200 μmol·L-1的
液体培养基中悬浮培养, 每个处理重复 3次。悬浮
培养生长 40 d后, 测定原球茎生长量、生物碱含
量、相对电导率和培养液中 pH, 以及原球茎的
POD和 PAL活性。在确定适宜诱导子剂量后, 用
适宜剂量的诱导子处理的原球茎培养 1次生长周
期, 共培养 44 d (马绍鋆 2008), 以不作处理的原球
茎为对照, 每 4 d随机取样1次, 检测原球茎生长量
和生物碱积累的变化, 重复 3次。
测定原球茎生长量时, 将培养的原球茎取出抽
滤, 称鲜重, 然后将原球茎置于 80 ℃烘干至恒重
(韩忠明等 2006), 称干重。每组实验重复 3次。
用碱性氯仿提取生物碱后, 再通过溴甲酚绿酸
性染料比色法(李亚芳等 2002; 徐宁 2000), 以 TU-
1800SPC紫外可见分光光度计测定波长 620 nm处
的吸光度。采用愈创木酚法测定 POD活性(王学
奎 2006), PAL活性测定参照王学奎(2006)书中方
法。粗酶液中相对蛋白含量采用考马斯亮蓝 G-
250法测定(王学奎 2006)。培养液的 pH值采用
Sartorius标准型 pH计 PB-20测定, 每组处理重复
3次。采用DDS-11A型电导率仪, 参照张宪政等
(1994)书中方法测定原球茎的相对电导率。
图 1 SNP、PA和 SA对霍山石斛原球茎生长量和生物碱含量的影响
Fig.1 Effects of SNP, PA and SA on the biomass and the alkaloid contents of Dendrobium huoshanense PLBs
植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月 425
结果与讨论
1 不同浓度 SNP、PA 和 SA 对霍山石斛原球茎生
长量和生物碱含量的影响
如图 1所示, (1)经SNP和PA处理的霍山石斛
原球茎生长量随着处理浓度的增加都出现先上升后
下降趋势。原球茎生长量分别在SNP浓度为0.025
mmol·L-1和PA浓度为 5 g·L-1时达到最大, 而SA处
理的原球茎生长量则一直下降。0.2 mmol·L-1 SNP、
10 g·L-1PA和200 μmol·L-1SA处理的原球茎生长量
大幅度下降, 生长明显受到抑制。(2) PA和 SA处
理的霍山石斛原球茎的生长量和生物碱变化趋势较
缓慢。SNP、PA和 SA处理的生物碱含量分别在
处理浓度为 0.1 mmol·L-1 SNP、 7.5 g·L-1 PA和 100
μmol·L-1 SA时含量达到最大。由此可见, 不同浓度
SNP、PA和 SA处理的原球茎, 其生长量和生物碱
的积累并不是同步的, 生长量的积累先于生物碱的积
累, 生物碱积累的同时原球茎生长受抑制。
2 不同浓度 SNP、PA 和 SA 对霍山石斛原球茎培
养液中pH和原球茎相对电导率的影响
如表 1所示, 0.2 mmol·L-1 SNP处理的培养液
pH降到 4.57, 已不适合原球茎生长, 而此时原球茎
生长量大幅度下降, 生长明显受抑制, 再增加 SNP
浓度, 生长量和生物碱的变化不明显。这与徐茂军
等(2005)的结果类似。PA对培养液 pH的影响不
是很明显。随着SA浓度的增加, pH值呈下降趋势,
10 g·L-1 SA的培养液出现酸化, pH为 5.77时的培
养液已不适宜培养原球茎。随着 3种诱导子处理
浓度的增加, 原球茎的相对电导率呈逐渐上升趋
势。0.2 mmol·L-1 SNP、10 g·L-1 PA和 200 μmol·L-1
SA中的相对电导率有明显上升。可见, 高浓度
SNP、PA和 SA会导致原球茎细胞膜受伤害, 细胞
生长受抑制, 同时原球茎的生物量和生物碱含量均
下降, 培养液酸化, 培养液已不适合霍山石斛原球
茎的液体悬浮培养。
3 不同浓度 SNP、PA 和 SA 对霍山石斛原球茎中
几种酶活性的影响
由表 2可知, 3种诱导子浓度增加后, 原球茎
的 PAL活性都先上升后下降, 0.1 mmol·L-1 SNP、
7.5 g·L-1 PA和 100 μmol·L-1 SA下的 PAL活性达到
最大值。随SNP和SA浓度的增加, 原球茎的POD
表 2 SNP、PA和 SA对霍山石斛原球茎
POD和 PAL活性的影响
Table 2 Effects of SNP, PA and SA on POD and PAL
activity in Dendrobium huoshanense PLBs
处理浓度 POD活性 /U·min
-1· PAL活性 /U·min-1·
mg-1 (蛋白) mg-1 (蛋白)
SNP/mmol·L-1 0 5.49±0.771f 5.59±0.069f
0.025 9.37±0.250c 7.82±0.077c
0.050 10.80±1.269b 9.35±0.098b
0.100 14.67±0.567a 11.80±0.013a
0.200 6.95±0.569d 6.29±0.304d
0.500 6.29±0.311e 5.97±0.055e
PA/g·L-1 0 7.69±1.439a 7.22±0.329f
1.0 6.62±0.550b 8.54±0.213d
2.5 6.50±0.571c 9.84±0.574c
5.0 5.31±0.783d 10.27±0.654b
7.5 4.26±0.713f 12.11±0.407a
10.0 4.66±0.970e 7.66±0.256e
SA/μmol·L-1 0 5.57±0.308e 3.84±0.856e
1 0 6.73±0.136d 4.76±0.210d
5 0 10.61±0.407b 9.72±0.217b
100 11.30±0.202a 12.59±0.137a
200 9.03±0.462c 7.53±0.873c
　　
表 1 SNP、PA和 SA对霍山石斛原球茎培养液中 pH和
原球茎的相对电导率的影响
Table 1 Effects of SNP, PA and SA on the medium pH and
electrical conductivity of Dendrobium huoshanense PLBs
处理浓度 培养液 pH 原球茎相对电导率 /%
SNP/mmol·L-1 0 6.18±0.030a 16.7±0.700d
0.025 5.70±0.030b 18.2±0.400cd
0.050 5.36±0.310c 19.6±1.800c
0.100 5.05±0.070d 21.2±1.600b
0.200 4.57±0.070e 29.9±1.600a
0.500 4.50±0.120e 30.4±0.700a
PA/g·L-1 0 6.11±0.255c 16.2±1.880d
1.0 6.12±0.226c 16.8±1.300c
2.5 6.30±0.060a 16.1±0.800d
5.0 6.22±0.005b 16.4±0.600d
7.5 6.16±0.060c 17.3±0.650b
10.0 5.77±0.125d 20.6±0.100a
SA/μmol·L-1 0 6.24±0.010a 16.7±0.350e
1 0 6.15±0.140ab 18.6±0.850d
5 0 6.09±0.150b 19.4±0.700c
100 5.54±0.020c 20.4±0.500b
200 5.22±0.150d 21.7±0.300a
　　表中数值为平均值 ±标准误, 同一物质不同浓度处理的同列
数据旁不同字母表示 P ≤ 0 .0 5 水平差异显著。表 2 同。
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活性先升后降, 也是分别在0.1 mmol·L-1 SNP和100
μmol·L-1 SA时达到最大。但原球茎的 POD活性随
着 PA浓度的增加而逐渐下降。这表明, 诱导子可
以诱发霍山石斛原球茎中PAL的活化, 即可提高苯
丙烷代谢途径中相关酶的活性, 因而生物碱含量提
高。而添加 PA则明显抑制原球茎中 POD的活性,
因而醌类物质减少, 最终是细胞衰老延缓, 而原球
茎中生物碱的积累增加。
4 0.1 mmol·L-1 SNP处理不同时间对霍山石斛原球
茎生长和生物碱积累的影响
3种诱导子均能促进霍山石斛原球茎生物碱的
积累, 其中 SNP的促进效应最好, 0.1 mmol·L-1的
SNP为适宜的诱导子。为此, 我们专门探讨了SNP
对霍山石斛原球茎生长和生物碱积累的影响。由
图 2可见, 在培养初期, 不作 SNP处理的原球茎生
长量与 0.1 mmol·L-1 SNP处理的差异不明显, 但在
培养后期, 不作 SNP处理的生长量开始高于 0.1
mmol·L-1 SNP处理的, 在 40 d左右前者达到最大
值, 而后者在 32 d左右就达最大值, 然后生长量开
始下降。不作 SNP处理的生物碱含量在培养周期
内的变化不明显, 但 0.1 mmol·L-1 SNP处理的生物
碱含量则高于不作 SNP处理的, 在 36 d左右时为
最大(图 3)。
图 2 SNP对霍山石斛原球茎生长的影响
Fig.2 Effects of SNP on the cell growth of
Dendrobium huoshanense PLBs
图 3 SNP对霍山石斛原球茎生物碱积累的影响
Fig.3 Effects of SNP on accumulation of alkaloids of
Dendrobium huoshanense PLBs