全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·427·
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霍山石斛种内遗传稳定性的RAPD初探
刘石泉，余庆波，李小军，周根余+
(i-海师范大学生命与环境科学学院生物系遗传学实验室，上海200234)
摘要：目的研究霍山石斛荚果内遗传稳定性及荚果间的差异大小。方法利用从20个随机引物筛选出来的3
个稳定性较好的10碱基引物对来自5个不同荚果的霍山石斛种群进行RAPD检测。结果5个荚果内遗传相似
系数较大，在92．5926％～100．00％，其中H1、H9、H10、H14存在一定程度的变异，H23是一个较为稳定的群体；5
个荚果问H1、H9、H10、H23的遗传距离较小，H14与其他4个荚果的遗传距离则较大。结论建立霍山石斛稳定
的元性快繁体系是切实可行的，同时说明霍山石斛种内存在一定的变异，H14与其他荚果的差异最大。
关键词：随机扩增多态性DNA；霍山石斛；荚果；遗传稳定性
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)03—0427—05
Hereditaryst bilityamongspeciesofDendrobiumhuoshanensebyRAPD
LIUShi—quan，YUQing—bo，LIXiao—jun，ZHOUGen—yu
(LaboratoryofGenetics，DepartmentofBiology，CollegeofLifeandEnvironmentSci ce，
ShanghaiNormalUniversity，Shanghai200234，China)
Abstract：ObjectiveTostudythhereditaryst bilityinthepodandthediversityw hinthepodsof
Dendrobiumhuoshanense．MethodsThreeoptimaldecameroligonucleotideprimerswithbetterstability
selectedfrom20randomprimerswereusedtodetectthepopulationsoffivedifferentpodsofD．huosha—
nensebyrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)．ResultsThecoefficientofgenetics milaritywere
higherwithinfivepodsattherangeof92．5926％一100．oO％，thevariationpresentedintheHI，H9，
H10，andH14，butH23wasastablegroup．Therewasasmallerg neticd stancewithinthepodsH1，H9，
收稿日期：2004—05—22
基金项目：上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(03DZ02)
作者简介：刘石泉(1969一)，男，湖南益阳人，讲师，在读研究生，研究方向为药用组织培养及分子检测。E—mail：lsq205@sina．com
*通讯作者Tel：(021)64323698E—mail：zhougenyu@sina．com
万方数据
·428· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月
H10，andH23，butabiggeronebetweentheabovefourandH14．ConclusionThestablishmentofrapid
cloningsystemofD．huoshanenseisfea ible，andtheresultsindicatethathevariationsexistamongthe
abovepodsofD．huoshanenseandthemostdiversityappearsbetweenH14andtheotherfour．
Keywords：randommplifiedpolymorphicDNA(RAPD)；DendrobiumhuoshanenseC．Z．TangetS．
J．Cheng；pod；hereditarystability
霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC．Z．Tang
etS．J．Cheng又名米斛，兰科石斛属植物，原产安
徽霍山，是药用石斛中的极品。由于石斛是一种附生
植物，对生态环境要求比较严格，自然繁殖频率极低
(<5％)，加上长期采集，野生植株已濒临灭绝。我国
现有的76种石斛属植物中，具药用价值的就有40
多种。其药理作用主要是强阴益精、补肾益力、明目
和延年益寿。近年来，包声雪[11等对霍山石斛资源进
行了大量研究。但对石斛离体条件下的遗传稳定性
和生理稳定性缺乏基础性研究，未能获得规范化石
斛繁殖技术体系和工艺流程，从而极大地阻碍了这
一名贵中药走向市场。霍山石斛因其质量上乘而驰
名中外，多年来市场上霍山石斛有名无实、有价无
市，资源接近枯竭。现在国内外市场上，凡冠以“霍山
石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名称的一些枫斗产
品，均不是用真正的霍山石斛加工而成的[1]，国内学
者对石斛药材的分类和鉴定作了大量研究[2~5]，但
真正应用于市场还有待进一步开发。笔者实地考察
了霍山县长冲乡种植的霍山石斛，从组织形态解剖
学上看，发现已有混杂。因此有必要对霍山石斛荚果
采用单荚果接种的方法进行提纯，严格培养过程，确
保是正宗的霍山石斛原种，以期获得霍山石斛遗传
性稳定的群体。本研究利用来自5个不同荚果的霍
山石斛进行RAPD研究，发现荚果内存在着较小的
遗传差异，来源不同荚果其RAPD条带差异性较
大，从而首次从分子水平上证明霍山石斛的产地差
异较为明显，很有可能已经混杂，有必要对其进行种
的真伪鉴定和遗传稳定性分析，以确保获得正宗霍
山石斛种群，发挥其应有的临床疗效。
1材料与来源
从霍山县长冲乡种植的霍山石斛中分别随机抽
取5个单株上各一个成熟荚果，在实验室中分别单
独继代，其采样时间和编号见表1。分别从继代8～
10次、生长一致的5个荚果群中随机抽取10株进
行实验。10碱基随机引物由生工公司合成，3个筛选
出来的稳定性较好的引物为P1341：GTCCAC—
CTCT；P1349：CCGATCCAAC；P1351：ACGCGC—
CTTC；Taq酶购自生工公司。PCR仪为美国MJ公
司PTC一100TM。
表1 5个霍山石斛荚果的采集情况
Table1 CollectionoffivepodsofD．huoshanense
2方法
2．1 DNA的提取：单株分别提取DNA[4]，将沉淀
于37℃干燥30min，加入30弘LTE溶解，一20。C
保存备用。用分光光度计测得其DNA质量浓度为
50ng／肛L。
2．2 PCR条件的优化：以张铭‘43RAPD反应体系
条件为基准，分别对缓冲液(2、3、4弘I。)、M92+(2．5
mmol／L，2、3、4扯L)、dNTPs(100弘mol／L，0．6、
1．0、1．2、2．0、3．0／xL)、引物(0．6tLmol／L，1．2、
2．0、2．4、3．0、4．0肚L)、模板DNA(0．5、1．0、1．5、
2．0址L)、Taq酶(0．5U／／_￡L，0．1、0．2、0．3pL)、复
性温度(34、36、38、42‘C)进行梯度筛选实验，最后
确定30肛L反应体系中含ddH。019．3弘L；缓冲液
3tLL；M92+(2．5mmol／L)3肛L；dNTPs(100
／lmol／L)1．2肚L；引物(0．6／amol／L)2．4弘L；模板
DNA1 tLL；Taq酶(0．5U／弘L)0．1肛L。程序：94℃
预变性3min，94℃变性50S、36℃复性1min、
72℃延伸2min，循环40次；最后72℃延伸5min。
用1．5％琼脂糖、3V／em电压、回流冷却电泳槽凝
胶电泳分离PCR产物，用天龙科技有限公司GIS一
2008凝胶成像仪成像。
3结果
3．1 5个荚果内遗传差异性分析：P1341、P1349、
P13513个引物在霍山石斛5个群体中的RAPD电
泳结果见图1。图1可见H110个单株带型在3个
引物中明显分为两种(H10、H11相同记为HIA，
H12～H19相同记为H1B)；H910个单株带型在3
个引物中明显分为两种(H20～H23相同记为
H9A，H24～H29相同记为H9B)；H1010个单株带
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·429·
型在P1341中明显分为3种(H30、H37相同记为
H10A，H31、H32相同记为HIOB，H33、H34、H35、
H36、H38、H39相同记为H10C)，在P1349中条带
一致，在P1351中则只有H31、H32与其他8株相
比，少一条带；H1410个单株带型在3个引物中只
有 43增加了一条条带，记为H14B，其余的均相
同，记为H14A；H2310个单株带型在3个引物中则
完全一致。
图1 P1341、P1349、P13513个引物在霍山石斛5个群体(10个体／群体)中的RAPD电泳结果
Fig．1RAPDeleetrophoretogramsfromfivepodgroupsofD．huoshanensewiththreeprimers
ofP1341，P1349，andP1351(tenindividualspergroup)
统计5个群体中的RAPD电泳结果时舍弃小
于200bp和大于2500bp的条带，只采用200～
2500bp的重复性较好的条带，以100bpMarkers
(Biolab公司)作为相对分子质量标记的标准，Cross
Checker(J．B．Buntijer，1999)软件将每个样品的
扩增带型中按有或无来记录，有此条带赋值1，无此
条带赋值为0，计算遗传相似系数(GS)和遗传距离
(GD)。GS一2NAB／(ⅣA+NB)(ⅣAB是样品A和样品
B共有的条带数，ⅣA和Ⅳ。分别是样品A和样品B
具有的条带数)，GD一1一GS。从表2看，荚果内的
GS是很高的，最低的也有92．5926％，最高为
100％，这主要是由于兰科植物属于严格自花授粉且
分别来自独立荚果，应该都象H23一样，条带完全
一致。至于荚果内出现的2种或3种RAPD带型，
笔者认为主要是在组培过程中出现的变异，因为在
组织培养过程中，其变异是普遍存在的，如薛建平[71
等、陆伟达[83等、李亮亮[91等分别在药菊、麻疯树、掌
叶半夏组织培养过程中等均有大量的报道。
3．2 5个荚果出现的10种RAPD带型的遗传差异
性分析：3个引物在5个荚果内出现的10种RAPD
带型见图2。5个荚果间的RAPD带型较为不一致，
其GD分析见表3。5个荚果内的不同RAPD带型
之间的GD明显要小得多，而荚果间的GD有较大
的，也有较小的，最大为0．1429，最小为0．0175，说
万方数据
·430· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月
明这5个荚果本身存在着较大的遗传差异，其中
H1、H9、H10、H23的GD较小，H14与其他4个荚
果的则较大，很有可能不是同一种，在产地就已经混
杂。这一结果与笔者在实验室得到的霍山石斛开花
株经专家鉴定的结果及野外实地考察结果基本上是
吻合的；H14是霍山石斛的一个亚种。当然这也并
不能排除H14是由正宗的霍山石斛变异而来，因为
只是进行了3个引物的RAPD分析，其GD结果并
不一定完全能说明问题，而且究竟要多大的GD才
能算得上是新种也并没有完全定论，实验说明即使
在霍山石斛单荚果内，同样条件下组织培养出来的
苗之间也存在一定的GD，只不过是相当小而已，荚
果问的GD要大一些，很显然说明在采集荚果之前
就存在一定差异。当然不排除实验误差，但单荚果培
养条件一致，组织培养导致的变异基本上几率是相
等的，RAPD实验条件也经过严格重复筛选，即使
存在误差的话，误差大小应该说是基本一致的。所以
说H14与其他荚果GD大，至少说明其变异较明
显，至于是否为非霍山石斛种，还有待于深入研究。
表2 3条引物从5个荚果群体(10个体／群体)中
扩增的条带数据
Table2 Dataofamplifiedbandswiththreeprimers
fromfivepodgroupsofD．huoshanense
(tenindividualspergroup)
P1349中：H9B与HgA同；H10B、H10C与H10A同；H14B与H14A同，在该引物中H9B、H10B、H10C、H14B略去；P1351中：H10C与
H10A同；H14B与H14A同，在该引物中H10C、H14B略去
H9B，H10B，H10C，H14BwereomittedinP1349becauseH9BandH9A，HlOB，H10CandH10A，H14BandH14Awereidentical；H10C
andH14BwereomittedinP1351becauseH10CandH10A，H14BandH14Awereidentical
图2 P1341、P1349、P13513个引物在5个荚果群体内出现的10种RAPD带型
Fig．2TenRAPDband—typesfromfivepodgroupsofD．huoshanensewiththreeprimersofP1341，P1349，andP1351
表3 5个荚果群体内出现的10种RAPD带型的遗传距离分析
Table3 Geneticd stanceoft nRAPDband—typesfromfivepodgroupsofD．huoshanense
4讨论
虽然对每一个引物而言，其检测的基因DNA
多态性是有限的，但可用的引物数很多，可检测区域
几乎覆盖整个基因组，所以从理论上讲，RAPD可
以对整个基因组DNA进行多态性检测。RAPD技
术目前已经十分成熟，运用相当广泛，几乎渗透于整
个基因组研究的各个方面，如进行遗传多样性与种
质资源的研究、物种进化与亲缘关系研究、中药真
伪、近缘药材及代用品鉴别研究、药材的野生类型与
栽培品种的研究、道地药材研究等口0|。
本研究首次运用RAPD技术，探讨了霍山石斛
组织培养过程中不同荚果内的遗传稳定性，说明荚果
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·431·
内存在一定程度的变异，所研究的5个荚果中，H1分
为2个RAPD带型，H9为2个，H10为3个，H14只
有一株在一个引物中有一条不同的条带，H23则所有
带型均相同，5个荚果群体内GS均很高，最小也为
92．5926％，说明同一荚果群体在组织培养过程中其
变异程度相当小，运用组培方法建立霍山石斛稳定的
无性快繁体系是切实可行的，不但能挽救濒临灭绝的
霍山石斛，而且能满足市场的大量需求；同时，H1、
H9、H10、H23群体间的GD较小，H14与其他4个
荚果的则较大，说明H14是距其他4个荚果亲缘关
系较远的一个群体，很有可能不是同一种，在产地就
已经混杂，当然这一结果还有待于进一步的研究。但
至少首次从分子水平证明在霍山产地，霍山石斛种群
内存在较大的差异，因此确定霍山石斛种源真伪、保
持遗传稳定性，是建立适合市场需求的稳定的霍山石
斛快繁体系首要的前提条件。
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不同种质资源及贮藏条件对缬草种子发芽率的影响
黄宝康，郑汉臣。，张巧艳，秦路平
(第二军医大学药学院，上海200433)
摘要：目的探讨不同种质资源、贮藏条件及萌发温度对缬草种子发芽率的影响。方法采用不同条件贮藏的缬
草种子进行常规种子发芽试验，计算不同萌发条件下的种子发芽率。结果 不同来源的缬草种子发芽率有较大差
异，缬草的种子发芽率要高于其变种宽叶缬草的发芽率，栽培缬草的种子发芽率要远高于野生缬草种子的发芽率。
贮存时间、贮存温度、萌发温度等因素对缬草种子发芽率均会产生影响。结论 为保持缬草种子的发芽率，贮藏过
程中要保持适当的低温和透气性，要长期保存缬草种子，则必须要以较低的温度保存；种子繁育要在适宜的时间和
温度等条件下进行。
关键词：缬草；种质资源；贮藏条件；发芽率
中图分类号：R282．21 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)03—0431—04
Effectsofvariousseedsourcesandifferentstorageconditions
onseedgerminationrateofValerianaofficinalis
HUANGBao—kang，ZHENGHan—then，ZHANGQiao—yan，QINLu—ping
(SchoolfPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsof eedsourcesandtorageconditionsontheeedger—
minationrateofValerianaofficinalis．MethodsTheseedsofV．officinalisunderdifferentstoragecondi一
收稿日期：2004—07—08
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30270152)
作者简介：黄宝康(1969一)，男，浙江东阳人，第二军医大学药学院副教授，在读博士研究生，主要从事中药资源与品质评价及中药新药
的研究与开发工作。 E—mail：hbk999@sohu．com
*通讯作者：Tel(021)25074577ECmail：hczheng@sohu．tom
万方数据
霍山石斛种内遗传稳定性的RAPD初探
作者： 刘石泉， 余庆波， 李小军， 周根余， LIU Shi-quan， YU Qing-bo， LI Xiao-jun，
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作者单位： 上海师范大学生命与环境科学学院,生物系遗传学实验室,上海,200234
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6.莫可元 RAPD技术在中药鉴定及相关领域应用的研究进展[期刊论文]-中国药师 2007(9)
7.刘春生 ITS序列和β-香树酯醇合成酶基因与甘草酸形成和积累的相关性研究[学位论文]博士 2006

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