全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (5): 642~648　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0062642
收稿 2015-02-02　　修定 2015-03-24
资助 国家自然科学基金(31171472)、高等学校博士学科点
专项科研基金(优先发展领域) (20111302130001)、河
北省科技厅河北省应用基础研究计划重点基础研究项
目(12967149D)和河北省人事厅留学人员科技活动项目
(20120316)
* 共同第一作者。
** 共同通讯作者(E-mail: dongmeiwang63@126.com, Tel:
0312-7528276; E-mail: houchunyan@126.com, Tel: 0312-
7528249)。
小麦与叶锈菌互作过程中实时定量PCR内参基因的选择及TaSGR基因的
表达分析
李晖1,*, 牛宏伟2,*, 刘娜1, 陈琰1, 侯春燕1,**, 王冬梅1,**
1河北农业大学生命科学学院植物逆境实验室, 河北保定071001; 2河北省环保产品质量监督检验院, 石家庄050000
摘要: 实时定量PCR (RT-qPCR)是确定基因功能的重要手段之一。为了量化基因表达水平, 选择合适的内参基因是实验准
确的先决条件。本文以小麦ACTIN1、ACTIN2、GAPDH、GAPDH2、ATUB、BTUB、EF1A1、EF1A2和TA共9个基因作为
候选内参基因, 在小麦(Triticum aesetrum)与叶锈菌(Puccinia triticina)互作过程中, 利用RT-qPCR技术, 检测这9个基因的表
达情况。经geNorm和NormFinder软件分析可知, 在小麦接种叶锈菌后不同时间点, GAPDH和TA基因的表达稳定性较高, 可
以作为RT-qPCR的内参基因。在此基础上, 利用筛选得到的最适内参GAPDH对小麦与叶锈菌互作过程中, TaSGR基因的相
对表达量做了定量分析。结果显示, 在亲和组合接种后中后期, TaSGR基因的相对表达量迅速增加, 达到了对照的近7倍水
平, 而在不亲和组合接种后不同时间点, TaSGR基因的表达量与对照0 h相比差异均不明显。
关键词: 小麦; 叶锈菌; RT-qPCR; 内参基因; geNorm; NormFinder
Reference Gene Selection for RT-qPCR and Expression Analysis of TaSGR
Gene in Defense Response of Wheat to Puccinia triticina
LI Hui1,∗, NIU Hong-Wei2,∗, LIU Na1, CHEN Yan1, HOU Chun-Yan1,∗∗, WANG Dong-Mei1,∗∗
1Plant Stress Laboratory, College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071001, China; 2Hebei Pro-
vincial Institute of Environmental Protection Products Quality Supervision and Inspection, Shijiazhuang 050000, China
Abstract: Real time quantitative PCR (RT-qPCR) has many potential applications in the determination of gene
function. The quality of reference gene plays an essential role in analyzing gene expression. In this study, we
took nine genes widely used in wheat (Triticum aesetrum) as candidate reference genes and evaluated the ex-
pression stability of the nine candidate genes, in the interaction between wheat and Puccinia triticina, by using
RT-qPCR. With the help of geNorm and NormFinder, we analyzed the data of RT-qPCR and got the expression
stability of the nine candidate genes. Our results showed that GAPDH and TA were most stable two genes
which can be reliably used in the stress conditions assessed. Based on this, we took GAPDH as the reference
gene and analyzed gene expression profiles of TaSGR in the interaction between wheat and Puccinia triticina.
Our data showed that the relative expression of TaSGR had a rapid increase in the compatible combinations at
middle and later time after inoculation, nearly seven times than the level of control. While in the incompatible
combinations, the relative expression of TaSGR did not change obviously.
Key words: wheat; Puccinia triticina; RT-qPCR; reference gene; geNorm; NormFinder
研究报告 Original Papers
近年来, 实时定量PCR (real time quantitative
PCR, RT-qPCR)技术已被广泛应用于不同物种基因
表达的绝对定量和相对定量研究(孙美莲等2010;
Paolacci等2009)。该技术实现了聚合酶链式反应
技术(polymerase chain reaction, PCR)从定性到定量
的飞跃, 具有重复性好、灵敏度高、定量准、速度
快等优点, 已成为分子生物学研究中分析基因表达
的重要工具(Huggett等2005; Radonic等2004)。
李晖等: 小麦与叶锈菌互作过程中实时定量PCR内参基因的选择及TaSGR基因的表达分析 643
在RT-qPCR中, 为了去除不同样本在RNA产
量、质量和反转录效率上可能存在的差别而获得
目标基因特异性表达的真正差异, 通常需要选择
内参基因进行校正和标准化(Bustin 2002; Ma等
2013; Suzuki等2000)。一般认为组成型表达的管
家基因表达比较稳定, 适合作为内参基因。然而,
近年来大量的研究结果表明, 并没有表达绝对稳
定的基因, 任何一种管家基因的所谓恒定表达都
只是在一定类型的细胞或实验因素作用下“有范
围”的恒定(Andersen等2004; Long等2010; Vande-
sompele等2002; Ma等2013)。因此, 为了得到更可
靠的定量结果, 需要筛选在特定条件下稳定表达
的内参基因进行校正。
由小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病是影响我国
小麦稳产、高产的重要病害之一, 流行年份可使
小麦减产40%左右, 造成巨大的经济损失。本实验
室对小麦抗叶锈菌侵染的生理生化机制进行了较
为系统的研究。已经证明大量的H2O2可以诱发小
麦产生过敏性反应(hypersensitive reaction, HR)以
抵抗叶锈菌的侵染。SGR (Stay Green)基因是与叶
绿素降解相关的基因, 已经在很多物种中被发现,
它的功能缺失可以导致绿色植物出现滞绿突变
(Park等2007; Sato等2007)。有研究表明超表达
SGR基因的水稻幼苗会产生单线态氧, 且叶片出现
细胞坏死(Jiang等2011)。在小麦受叶锈菌侵染过
程中, 检测TaSGR基因是否被诱导表达, 将为我们
进一步研究参与HR诱发的特异的活性氧信号提供
实验证据。随着对小麦叶锈病研究的不断深入以
及对基因定量要求的不断提高, 筛选小麦受叶锈
菌侵染过程中稳定表达的内参基因, 在抗病相关
基因的表达分析中起着关键作用。
本研究选取了在小麦基因表达分析中常用的
管家基因ACTIN1、ACTIN2、GAPDH、GAPDH2、
ATUB、BTUB、EF1A1、EF1A2以及在小麦感染条
锈菌中筛选到的稳定表达的TA共9个基因作为候
选内参基因(Paolacci等2009), 利用RT-qPCR技术对
它们在小麦受叶锈菌侵染过程中的表达量进行测
定, 利用geNorm和NormFinder软件分析它们表达
的稳定性, 筛选最适于小麦感染叶锈菌过程中基
因表达分析的内参基因, 并利用筛选到的最适内
参基因分析TaSGR基因的相对表达情况。
材料与方法
1 材料
供试小麦(Triticum aesetrum L.)品种‘洛夫林
10’ (‘Lovin 10’, 以下简称‘L10’)。供试叶锈菌(Puccinia
triticina Eriks.)生理小种为165和260 (单胞菌系繁
殖)。‘L10’与叶锈菌小种165组成亲和组合, 与小
种260组成不亲和组合。
2 方法
2.1 材料处理
小麦幼苗在培养室培养7 d后, 在展开的第一
片真叶上用毛笔接种叶锈菌, 置于黑暗保湿箱内
保湿16 h, 分别于接种后的0、4、8、12、16、24、
48和72 h, 采集亲和组合、不亲和组合及对照组(模
拟接种)叶片, 共21份样品, 液氮冷冻, –80 ℃度冰
箱保存。
2.2 总RNA提取、纯化及cDNA合成
利用RNAiso Plus (TaKaRa)试剂盒提取总RNA,
所获得的总RNA经DNA酶处理去除基因组的污
染, 利用One Step SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit
(TaKaRa)试剂盒所提供的方法对所得RNA进行反
转录得到cDNA。
2.3 PCR引物设计和实时定量PCR反应
根据GenBank已登录的相关序列, 利用Primer
5.0软件, 分别设计各基因的实时定量PCR引物(表
1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。各基因片段PCR产物测序结果显示扩增序
列正确。
RT-qPCR反应按照SYBR premix Ex Taq II试
剂盒(TaKaRa)在CHROMO4型荧光定量PCR仪(Bio-
Rad)上运行, 采集融解曲线荧光信号。每个样品设
3次重复。熔解曲线为单峰时用于后续分析。
2.4 标准曲线的绘制及基因扩增效率
利用标准曲线对各引物的扩增效率进行检
测。将各内参基因PCR产物依次稀释到10-4、
10-5、10-6、10-7、10-8倍5个梯度, 每个梯度设3个重
复。根据实时定量PCR结果, 绘制标准曲线。并利
用公式E (%)=(10–1/斜率–1)×100计算基因的扩增效
率, 扩增效率在90%~105%的引物符合要求。
2.5 数据处理和分析
数据处理和分析采用常用的内参分析软件ge-
Norm和NormFinder。其中geNorm软件根据RT-qP-
植物生理学报644
CR结果, 计算出每个样品的Ct平均值, 利用公式
Q=E-∆Ct, 计算出各基因的相对表达量Q, 其中E为基
因扩增效率(一般情况下将基因扩增设为理想扩
增, 扩增效率E默认为2), ∆Ct=Ct样品–Ctmin (Ct样品为
每个样品的Ct值, Ctmin为所有样品中最低的Ct值)
(李钱峰等2008)。利用geNorm软件对各候选内参
基因的相对表达量Q进行表达稳定性统计学分析,
以表达稳定性(M)来确定最稳定的内参基因, 该软
件默认M=0.5为取舍值, 当M值小于0.5时, 被认为
可以考虑作为内参基因。M值越大, 稳定性越差。
软件还引入标准化因子的配对差异分析(V), 从而
确定合适的内参基因数目。该程序默认V值为
0.15, 若Vn/n+1<0.15, 则没必要引入第n+1个内参基
因(Vandesompele等2002)。与geNorm类似, Norm-
Finder软件是将原始数据先经标准曲线或∆Ct法将
其转换成相对表达量Q, 然后运用软件通过方差分
析得出基因的表达稳定值M, 直接评价基因的稳定
性(Andersen等2004)。
在计算TaSGR基因的相对表达量时, 首先分别
计算每个样品3个平行重复的平均Ct值, 然后按照
如下4个公式逐步计算。(1) ΔCt (test)=Ct (target,
test)–Ct (ref, test); (2) ΔCt (calibrator)=Ct (target,
calibrator)–Ct (ref, calibrator); (3) ΔΔCt (test)=ΔCt
(test)–ΔCt (calibrator); (4)表达量的比值=2-∆∆Ct。式
中, test: 目的基因, calibrator: 内参基因, target: 亲
和或不亲和组合, ref: 模拟接种。
2.6 ‘L10’与两个叶锈菌小种亲和与不亲和互作的
表型观察
不亲和组合接种后的72 h, 采集幼苗的第一片
真叶, 于解剖镜下观察并摄像。亲和组合接种后
的6 d, 采集幼苗的第一片真叶, 于解剖镜下观察并
摄像。
2.7 寄主细胞过敏性反应的观察
不亲和组合接种后的48 h, 采集3株幼苗的第
一片真叶, 除去叶尖和下部后取上、中、下各1.5 cm
的叶段, 采用Rohringer荧光染色法(Rohringer等
1977)进行染色, 荧光显微镜下观察过敏性反应及
菌的发育状态。
实验结果
1 引物特异性和PCR扩增效率分析
对RT-qPCR数据进行精确分析, 要求所有引
物必须有相同的扩增效率。扩增效率接近100%是
试验条件得到优化且试验结果重复性好的标志,
表1 候选基因引物序列及扩增产物长度
Table 1 The primer sequences and length of amplified fragment
基因符号 基因名称 GenBank登录号 引物序列(5′→3′) 产物长度/bp
ACTIN1 Actin AB181991 正向GTTCTACAACGAGCTCCGTGTC 116
反向GACATACATTGCTGGGCAAC
ACTIN2 Actin AY663392 正向GTCGGGATCTCACGGACTC 106
反向CATAATCAAGGGCAACATAC
ATUB Alpha tubulin U76558 正向CACCCTGAGCAGCTTATCAG 115
反向CAGTGCAGTTGTCTGAAAGC
BTUB Beta tubulin 5 U76896 正向GCACCATGGACAGTGTCCGT 80
反向CAGCACCAGACTGCCCAAAC
EF1A1 Elongation factor-1-alpha-subunit M90077 正向AGAAGACTCACATCAACATC 159
反向CGTACTTGAAAGACCTCTTG
EF1A2 Elongation factor-1-alpha AK334915 正向ACTGTTCAGACACCAAGCAG 160
反向AAGCTTACATTAGGACACAG
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate AY290728 正向CTGCATCATACGATGACATC 114
dehydrogenase-like 反向TGTCACCGACAAAGTCAGTG
GAPDH2 Glyceraldehyde-3-phosphate EU022331 正向GACTGTTAGACTTGCGAAGC 102
dehydrogenase 反向CATCAACGTAACCCAAAATG
TA TA27922 CD900190 正向ACATGTACATACTCCTCATC 119
反向TGGTACCTAGTTTTTGCATC
TaSGR Stay-Green protein GAJL01256413 正向ACTACATCTTCCACAAGGAG 126
反向GTCTGTTGCAACTTCTGTAG
李晖等: 小麦与叶锈菌互作过程中实时定量PCR内参基因的选择及TaSGR基因的表达分析 645
实际操作时PCR反应的扩增效率应该在95%~
115%之间。如表2所示, 经计算9个候选内参基因
扩增效率的变化范围为96.16%~103.38%, 并且标
准曲线R2值变化范围为0.994~0.999。
2 候选内参基因的表达水平
对于每一个基因, 我们可以通过计算Ct值来
比较基因表达的丰度, Ct值代表的是PCR产物出现
有效增长的循环数(Bustin 2000; Scharlaken等2008)。
内参基因的Ct值在不同处理条件下是不同的, Ct值
之间的差异值(变异系数)反应了内参基因的稳定
性, 变异系数越大表明基因越不稳定。内参基因Ct
值在不同样品中表达稳定性是选择内参的重要标
准。Ct值越高, 表明基因表达的mRNA含量越低;
Ct值越低, 表明基因表达的mRNA含量越高。试验
结果表明, 试验涉及的21个样品共9个内参基因中,
除BTUB外其他基因的平均Ct值在18到25之间(图
1), 并且大部分在19到22之间, 可用于后续试验。
BTUB表达量较低, Ct值为28左右。
3 geNorm软件分析
geNorm软件是常用的内参分析软件, 其通过分
析候选内参基因在不同样品中的表达稳定性(M)来
确定最稳定的内参基因。利用geNorm软件对各候
选内参基因的相对表达量Q进行表达稳定性统计学
分析, 结果如图2所示。ACTIN1、ATUB、EF1A1、
EF1A2、GAPDH、GAPDH2、TA的M值都小于0.5, 其
中稳定性最高的两个内参基因分别为GAPDH和TA,
而ACTIN2及BTUB的M值均大于0.5, 稳定性较差。
表2 候选内参基因的扩增效率及回归系数
Table 2 PCR efficiency and regression coefficient of
nine candidate reference genes
基因 斜率 扩增效率/% 回归系数(R2)
ACTIN1 –0.3064 102.49 0.998
ACTIN2 –0.3072 102.86 0.997
ATUB –0.3083 103.38 0.998
BTUB –0.0926 96.16 0.999
EF1A1 –0.3046 101.65 0.997
EF1A2 –0.2984 98.80 0.999
GAPDH –0.2960 97.78 0.999
GAPDH2 –0.3006 99.80 0.998
TA –0.3075 103.00 0.994
图1 实时定量PCR分析中各候选基因的表达水平
Fig.1 Expression levels of candidate reference genes in
RT-qPCR
图2 以geNorm软件分析候选内参基因在病程中的
表达稳定性
Fig.2 Expression stability of candidate reference genes during
pathogenic stages by geNorm
为了从RT-qPCR获得更可靠的结果, 一般推
荐使用两个或更多内参基因。因此我们通过
geNorm软件进行标准化因子的配对差异分析(V)
(Andersen等2004), 从而确定合适的内参基因数目,
从图3结果可见, V2/3<0.15, 说明第3个内参基因未
能明显表示出标准化因子差异, 选用两个最稳定
的内参基因GAPDH与TA就足以准确标准化了。
4 NormFinder软件分析
我们也用NormFinder软件对候选基因的RT-
qPCR数据进行了分析。类似geNorm软件, M值越
低稳定性越高, 高M值则表示低稳定性。从图4中
可以看出, 最稳定的2个基因为EF1A2和GAPDH。
植物生理学报646
所以在两种软件分析中, GAPDH均表现稳定, 而经
geNorm软件分析最稳定的TA在本软件分析排序中
列第4位, 也相对较稳定。NormFinder分析结果显
示 , 不稳定的内参基因为BTUB和ACTIN2 , 与
geNorm软件分析结果一致。
5 小麦与叶锈菌互作过程中TaSGR的相对表达分析
在小麦受叶锈菌侵染过程中, 不亲和组合叶
片侵染点处细胞会发生过敏性反应, 而亲和组合
小麦叶片在侵染中后期, 孢子堆周围出现明显的
褪绿斑, 即细胞发生坏死(图5)。其中不亲和组合
中的HR是一种主动性细胞死亡, 与亲和组合中由
于叶锈菌掠夺营养导致的叶肉细胞死亡明显不
同。在这两种细胞死亡过程中, TaSGR基因是否被
诱导表达, 将为我们进一步研究参与HR诱发的特
异的活性氧信号提供实验证据。因此, 我们选定
SGR基因为目的基因, 以筛选到的在小麦与叶锈菌
互作过程中稳定的GAPDH基因为内参 , 利用
RT-qPCR检测了TaSGR的相对表达量。同时也以
最不稳定的BTUB为内参, 以比较内参的稳定性对
小麦与叶锈菌互作过程中基因相对表达量的影
响。如图6所示, 以GAPDH为内参时, 在不亲和组
合中接种后不同时间点, TaSGR基因的表达量与对
图3 内参基因最适数目的确定
Fig.3 Determination of the optimal number of reference genes
for normalization
图4 以NormFinder软件分析候选内参基因在病程中的
表达稳定性
Fig.4 Expression stability of candidate reference genes during
pathogenic stages by NormFinder
图5 小麦与叶锈菌互作过程中不同亲和性组合的表型及不
亲和组合侵染点处HR
Fig.5 The phenotype of wheat leaves in the combinations of
different physiological compatibility and the HR of
penetration sites in the incompatible combinations
during the interaction between wheat and P. triticina
A: 不亲和组合叶片表型; B: 亲和组合叶片表型; C: 不亲和
组合叶片侵染点处发生HR的细胞及菌的结构。NC: 坏死细胞,
HMC: 吸器母细胞, SSV: 气孔下泡囊, AP: 附着胞。
图6 以GAPDH为内参时TaSGR的相对表达量
Fig.6 The relative expression of TaSGR taking GAPDH as
the reference gene
李晖等: 小麦与叶锈菌互作过程中实时定量PCR内参基因的选择及TaSGR基因的表达分析 647
照(接种后0 h)相比差异均不明显。而在亲和组合
中, 接种后4至24 h表达量无明显变化, 但在接种后
中后期, 即48和72 h表达量迅速增加, 达对照的近7
倍。SGR基因在亲和组合侵染中后期被特异诱导
表达, 说明TaSGR可能参与亲和组合中寄主细胞的
坏死过程, 而与不亲和组合HR的诱发无关。当以
最不稳定的BTUB基因为内参时, 如图7所示, 在不
亲和组合及亲和组合中, TaSGR在接种后12 h表达
图7 以BTUB为内参时TaSGR的相对表达量
Fig.7 The relative expression of TaSGR taking BTUB as
the reference gene
均下调近5倍, 而后逐渐增加, 接种后24 h恢复到对
照水平, 之后不亲和组合稍有增加, 而亲和组合在
接种后48 h又增加至对照的12倍。所以选取不合
适的内参基因时, 对TaSGR相对表达量的计算有很
大的影响。
讨　　论
在分子生物学研究中, 研究基因表达模式可
以帮助我们了解生物的生长和发育过程。而RT-
qPCR是量化基因表达水平最常用的一种方法, 也
是确定基因功能至关重要的一步。选择合适的内
参基因是利用RT-qPCR准确分析基因相对表达量
的先决条件。如果实验选用了不合适的内参基因,
将直接导致对目的基因相对表达量的误判。理想
的内参基因在不同的组织器官和发育阶段中表达
稳定(Hong等2008), 受生物或者非生物胁迫影响
小, 并且其稳定的表达水平与目标基因表达水平
相近(Luo等2010)。
geNorm软件和NormFinder软件都是目前最常
用的内参基因筛选软件, 主要用于候选基因表达
研究中内参基因稳定度排序及找出合适的内参基
因。综合这两款软件的分析可知, 在小麦与叶锈
菌互作过程中, GAPDH和TA是所候选的9个内参基
因中表达较稳定的, 而表达稳定性较低的是BTUB
和ACTIN2。从此结果可看出同一家族的基因如
ATUB和BTUB, 在不同的逆境中, 其表达量也是存
在差异的。另外在叶锈菌侵染小麦过程中, 通过检
测TaSGR的相对表达量, 也可看出选用不同的内参
基因会使基因相对表达量产生很大的差异。因此
在进行基因表达的研究时, 研究者必须结合各自的
实验条件和样品类型来选择合适的内参基因。
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