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转星星草金属硫蛋白基因烟草的获得及其抗重金属镉能力分析



全 文 :植物生理学通讯 第 45卷 第 4期,2009年 4月318
收稿 2008-12-01 修定  2009-02-06
资助 黑龙江省重点科技攻关项目(GB06B303-5)。
* 通讯作者(E-mai l : tb j ia ng@yahoo.com; T el : 0 4 51 -
8 2 1 9 0 6 0 7 )。
转星星草金属硫蛋白基因烟草的获得及其抗重金属镉能力分析
王雷, 曲跃军, 杜人杰, 吴丽丽, 王玉成, 姜廷波 *
东北林业大学, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 用农杆菌介导法将星星草金属硫蛋白基因(MT)转化烟草, PCR及PCR-Southern检测的结果表明, 该基因已导入烟草
中。Real-Time PCR检测显示, 该基因在转基因后代中的转录水平高于非转基因植株。Cd2+胁迫下, 转基因植株能够正常
生长, 鲜重、株高、叶绿素含量、Cd2+含量和SOD活性均高于非转基因植株, 表明MT基因的过量表达可提高转基因烟草
的抗Cd2+能力。
关键词: 烟草; 金属硫蛋白; 转基因
Identification of MT Overexpression in Tobacco and Analysis of Cd2+ Resis-
tance in Transgenic Plants
WANG Lei, QU Yue-Jun, DU Ren-Jie, WU Li-Li, WANG Yu-Cheng, JIANG Ting-Bo*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Ministry of Education, Northest Forest University,
Harbin 150040, China
Abstract: The metallothionein gene (MT) from Puccinellia tenuiflora was transformed into tobacco by
Agrobacterium tumefaciens. The results of PCR and PCR-Southern hybridization showed that the transformed
MT gene expressed in tobacco. Real-Time PCR demonstrated that the transcript level of MT gene in T1 generation
was higher than that in wild plants. With the treatment of Cd2+, the transgenic tobacco plants could grow normally.
Fresh weight, plant high, chlorophyll content, Cd2+ content and activity of SOD were all higher than those in wild
plants. The overexpression of MT gene enhanced the resistance to Cd2+ in transgenic tobacco plants.
Key words: tobacco; metallothionein; genetic transformation
金属硫蛋白(metallothionein, MT)是一种低分子
量、富含半胱氨酸残基的金属结合蛋白, 由于其巯
基含量高, 对重金属的亲和力大, 因而对多种重金
属, 如 Cu、Zn、Pb、Ag、Hg和 Cd阳离子都
有螯合作用(Milan和 Jeremias 1981)。另外, 也有
报道称MT也是一类有效的活性氧清除剂, 能消除
细胞内活性氧, 增强植物对外界胁迫的适应性
(Campagne等 1999; Robinson等 1993)。目前, 人
们在小麦、拟南芥、大豆、星星草、番茄及羊
茅等植物中发现和克隆了编码该蛋白质的基因(刘
桂丰等 2005; Gir itch等 1998; Lane等 1987;
Kawashima等 1991; Ma等 2003; Murphy等 1997)。
星星草是禾本科碱茅属多年生草本植物, 具有较强
的抗寒、抗旱和耐盐碱能力。关于星星草是否耐
重金属镉(Cd)的问题, 未见有文献报道。迄今, 人
们已成功构建盐碱胁迫下星星草的消减文库(Wang
等 2007), 并发现在盐碱胁迫下星星草中金属硫蛋
白基因的表达量显著升高。为明确星星草金属硫
蛋白基因过量表达对提高植物抗Cd2+的作用, 本文
用农杆菌介导法将星星草中的金属硫蛋白基因导入
到烟草基因组中, 并对转基因烟草在Cd胁迫下的生
理变化和外源基因的表达进行了检测, 以期为用转基
因技术改良植物的重金属抗性和对重金属污染的土
壤进行植物修复提供参考。
材料与方法
植物材料为烟草(Nicotiana tobacum L.)。星
星草[Puccinellia tenuiflora (Turcz.) Scribn. & Merr.]
金属硫蛋白基因(MT)由本实验室根据文献(刘桂丰
等2005)中的序列信息克隆获得, 并将其导入植物表
达载体pBI121上以取代花椰菜病毒35S启动子下游
的 gus基因, 农杆菌 EHA105为本实验保存。
采用农杆菌介导的叶盘法对烟草进行遗传转
化, 具体操作过程见李凤娟(2007)文中的方法。将
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转基因烟草T0代获得的种子接种于100 mg·L-1卡那
霉素的MS培养基上进行抗性筛选。
用CTAB法(王关林和方宏筠2002)提取烟草总
DNA。以含有MT基因质粒DNA为阳性对照, 以
未转化烟草总DNA为阴性对照, 以提取的待测烟草
总DNA为模板同时进行PCR扩增, 以PCR扩增的
阳性株DNA为模板进行 PCR-Southern杂交。
用Trizol法提取T1代经PCR检测为阳性并且
经 C d 2 + 胁迫后的转化植株和未转化烟草的总
RNA, 按照 Reverse Transcriptase M-MLV进行反
转录, 用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(购于大连宝
生物公司)进行Real-Time PCR (黄留玉2005; Wang
等 200 6)。
随机挑选T1代中PCR阳性植株(6株 ·株系 -1),
将其移栽至含200 μmol·L-1 Cd2+的MS培养基中, 45
d后测定其株高、鲜重、POD活性、SOD活性、
MDA含量(郝建军和刘延吉 2001)和 Cd2+含量, 使
用 SPAD-502叶绿素仪测定样本叶绿素含量。
对于T1代转基因植株Kan抗性分离规律的检
验采用拟合优度检验中的适合性测验进行推断(杜
荣骞 1999)。其他数据均利用 SPSS11.0统计软件
进行单因素方差分析 Tukey检验(林杰斌等 2002)。
结果与讨论
1 转基因植株的获得
在 T0代中转化 160个外植体, 获得 43株Kan
抗性苗, 经PCR检测获得 37株阳性苗。在T1代中,
随机抽取9个阳性株系, 将其种子接种于100 mg·L-1
Kan的MS培养基上进行抗性筛选, 结果(表1)表明:
T-1和T-2自交后代Kan抗性植株与非抗性植株的
分离比例并不符合3:1 (χ2>χ20.05), 其余株系自交后代
符合抗性植株:非抗性植株 =3:1的比例(χ2<χ20.05)。
这同孟德尔的单个显性基因的分离规律相一致
(Horsch等 1984; 王忠华等 2000)。相对于外源基
因来说, 植物同源染色体上没有其相对应的等位基
因位点, 外源基因有可能作为一个单显性基因在转
基因后代中遗传。
2 转基因植株的分子检测
(1)用CTAB法提取T0和T1代Kan抗性植株的
总DNA进行 PCR检测的结果表明:转基因阳性
植株被扩增出分子量约为500 bp的特异条带, 与阳
性对照大小一致, 并且条带清晰, 没有杂带, 阴性对
照未被扩增出目的条带, PCR检测的重复性高, 比
较稳定(图 1)。
(2)随机抽取 PCR阳性植株 5株进行 PCR-
Southern杂交的结果(图2)表明, PCR阳性样品与阳
性对照皆有杂交带, 阴性对照则无杂交信号, 表明
PCR结果可靠。
(3)用Trizol法提取Cd2+胁迫下转基因烟草与
非转基因烟草总 RNA, 反转录后进行 Real-Time
PCR (Marino等 2003; Bustin 2002)的结果(图 3、4)
显示:各株系星星草金属硫蛋白基因的表达量均
高于对照, 其中 T-4和 T-6外源基因的表达量显著
高于对照(P<0.05), T-5外源基因的表达量极显著高
于对照(P<0.01)。上述结果表明星星草金属硫蛋
白基因已转入烟草基因组中, 并且该基因在烟草转
基因后代中实现表达并有较高的转录水平。
表 1 转基因烟草 T1代幼苗的卡那霉素抗性分析
Table 1 Kan-resistance analysis of transgenic tobacco seedlings of T1 generation
株系 总株数 抗性株数 敏感株数 分离比例 期望比例 χ2值
T-1 149 9 5 5 4 1.76:1 3:1 9.4519
T-2 213 139 7 4 1.88:1 3:1 10.2676
T-3 4 5 3 3 1 2 2.75:1 3:1 0.0074
T-4 5 1 4 2 9 4.67:1 3:1 1.1045
T-5 5 4 4 4 1 0 4.40:1 3:1 0.8889
T-6 3 7 3 1 6 5.17:1 3:1 1.0900
T-7 4 6 3 1 1 5 2.07:1 3:1 1.0435
T-8 4 9 3 7 1 2 3.08:1 3:1 0.0068
T-9 8 2 6 3 1 9 3.32:1 3:1 0.0650
  χ20.05=3.841, χ20.01=6.635。
植物生理学通讯 第 45卷 第 4期,2009年 4月320
3 转基因烟草的生理指标分析
(1)一般认为, 叶绿素含量在一定程度上可以反
映植物光合作用和合成碳水化合物的能力。在
200 μmol·L-1 Cd2+胁迫下, 叶片开始表现为黄萎, 但
2周后转基因烟草的叶片恢复正常绿色, 而非转基
因株系则不能恢复正常的绿色。转基因植株的叶
绿素含量均有提高, 其中 T-1、T-2、T-4和 T-5
株系的叶绿素含量均极显著高于非转基因株系(P<
0.01), T-3和 T-6显著高于非转基因株系(P<0.05)
(图 5 )。
图 1 转基因烟草 PCR检测
Fig.1 PCR analysis of MT gene in transgenic tobacco
M为 DL2000分子量标准; 1~16为待测植株; 17为阴性对照; 18为阳性对照。
图 5 Cd2+胁迫对烟草叶绿素含量的影响
Fig.5 Chlorophyll content of transgenic tobacco
under Cd2+ stress
(2)在含 200 μmol·L-1 Cd2+的MS培养基中, 转
基因植株的生长明显好于非转基因植株。转基因
株系的鲜重与株高均高于非转基因株系, 其中 T-2
株系的鲜重与株高均极显著高于非转基因株系(P<
0.01) (图 6、7)。
图 2 转基因烟草 PCR-Southern检测
Fig.2 PCR-Southern analysis of MT gene in
transgenic tobacco
上图为 PCR产物电泳图, 下图为 PCR-Southern杂交图。M
为DL2000分子量标准; 1~5为待检植株; 6为阴性对照; 7为阳
性对照。
图 3 转基因烟草中MT基因表达情况的Real-Time PCR检测
Fig.3 Real-Time PCR analysis of MT gene expression in
transgenic tobacco
图 4 转基因烟草金属硫蛋白基因的表达
Fig.4 The expression of MT gene in transgenic tobacco
1~6为转基因株系; 7为非转基因株系。
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(3)转基因株系SOD活性均高于非转基因株系
(图 8)。经重金属 Cd2+胁迫处理后, 转基因株系的
株高、鲜重、叶绿素含量和 SOD 活性均高于非
转基因株系, 这表明星星草金属硫蛋白的过量表达
对转基因烟草有保护作用, 因而转基因植株的抗氧
化能力得到提高。
总含量极显著高于非转化株系(P<0.01) (图 9)。这
说明转基因植株对 Cd2+的吸收能力及耐受能力均
强于非转基因植株。
(4)在含200 μmol·L-1 Cd2+的MS培养基中处理
45 d后, 转基因烟草中累积的Cd2+总含量均高于非
转基因植株。其中 T-2、T-4和 T-5株系中 Cd2+
(5)除T-2株系POD活性略高于非转基因株系
外, 其余转基因株系的POD活性均低于非转基因株
系(图 10)。这可能是由于外源基因的插入导致某
些与 POD活性相关的结构基因失活, 从而降低了
POD 的活性所致。PO D 活性降低, H 2O 2积累
(Banjerdkij等 2005), 膜脂过氧化程度加重, 导致转
基因株系(除 T-1和 T-3外) MDA含量高于非转基
因株系(图 11)。但转基因植株在Cd胁迫下叶片绿
色, 仍能正常生长, 说明MT可能对膜脂过氧化带
给植物的损伤有某种补偿作用。
图 6 Cd2+胁迫对烟草鲜重的影响
Fig.6 Fresh weight of transgenic tobacco under Cd2+ stress
图 7 Cd2+胁迫对烟草株高的影响
Fig.7 Plant height of transgenic tobacco under Cd2+ stress
图 8 Cd2+胁迫对烟草 SOD活性的影响
Fig.8 SOD activity of transgenic tobacco under Cd2+ stress
图 9 Cd2+胁迫对烟草Cd2+含量的影响
Fig.9 Cd2+ content of transgenic tobacco under Cd2+ stress
图 10 Cd2+胁迫对烟草 POD活性的影响
Fig.10 POD activity of transgenic tobacco under Cd2+ stress
从总体来说, 星星草金属硫蛋白的导入提高了
转基因烟草的抗重金属胁迫的能力。但外源基因
表达水平的高低与抗逆生理指标之间并未表现出线
性关系, 这也说明植物的抗逆机制是十分复杂的, 并
非简单的因果关系。MT基因的插入是否导致某
些基因失活, 以及MT除了与Cd2+形成结合态Cd2+
植物生理学通讯 第 45卷 第 4期,2009年 4月322
外, 是否还有其他解毒方式和功能, 都有待于进一
步研究。
参考文献
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