全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (12): 2163~2168　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0483 2163
收稿 2015-09-09　　修定 2015-11-13
资助 国家自然科学基金(31272167和31471880)。
* 通讯作者(E-mail: luanyush@dlut.edu.cn; Tel: 0411-84706365)。
番茄MIR398基因的克隆及其在烟草中的表达分析
贺晓丽, 刘萍, 栾雨时*
大连理工大学生命科学与技术学院, 辽宁大连116024
摘要: miRNA作为真核生物的一类调控因子, 在植物胁迫应答中发挥着重要的作用, 成熟的miRNAs能降解或者阻遏靶
mRNA的翻译。为从不同角度揭示miR398的生物学功能, 我们从番茄中克隆到MIR398基因并构建了该基因的过表达载体
pBI121-MIR398, 通过农杆菌介导的叶盘法将重组质粒导入异源植物烟草中, 利用psRNATarget预测miR398在烟草中的靶基
因有PR5和CSD等。采用实时定量PCR检测基因表达, 发现转基因烟草中MIR398的表达量增加, 靶基因的表达量减少, 为阐
明miR398的异源调控功能奠定了基础。
关键词: miR398; 烟草; 胁迫应答; PR5; CSD
Cloning of Tomato MIR398 Gene and Its Expression Analysis in Tobacco
HE Xiao-Li, LIU Ping, LUAN Yu-Shi*
School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116024, China
Abstract: As a kind of regulatory factor in eukaryote, miRNA plays an important role in the plant stress re-
sponse. The mature miRNAs can degrade or repress the translation of the target mRNA. To explore the biologi-
cal function of miR398, we cloned the MIR398 gene from tomato and constructed the over-expression vector
pBI121-MIR398. Then we introduced this over-expression vector into tobacco and predicted the target genes of
miR398 in tobacco, which were CSD, PR5 and so on. Then we detected the expression of MIR398 and its target
genes with real-time PCR and found that the expression level of MIR398 was increased and its target was con-
trary, which provide a basis on elucidating the different source control of miR398.
Key words: miR398; tobacco; stress response; PR5; CSD
MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的
一类内源性的具有调控功能的非编码RNA, 大小
为20~25个核苷酸, 是植物胁迫应答过程中不可或
缺的调控因子。以往的研究证明植物miRNA可响
应多种生物及非生物胁迫, 包括病毒和病菌的感
染、高盐和干旱等 (丁艳菲等2 0 1 0 )。成熟的
miRNA与RISC (RNA induced silencing complex)结
合后, 可通过直接剪切或翻译抑制的方式作用于
靶基因, 实现对基因表达的调控。miRNA的作用
机制取决于其与靶基因之间碱基互补配对的程
度。当它们完全互补或近乎完全互补时, miRNA
介导对其靶基因的剪切; 结合程度较低时, miRNA
则会启动对其靶基因的翻译抑制(吕帝瑾等2013)。
截至目前, 人们已通过各种方法发现了数千
个miRNA (Wang和Luan 2015), 但通过实验验证的
miRNA及靶标远未达到饱和。此前, 我们利用同
源比对的生物信息学方法(Luan等2014)以及支持向
量机分类算法(孙超等2012)预测了番茄中保守的
miRNA, 得到了pri-MIR398的序列, 分析了MIR398
的表达模式; 通过psRNATarget软件在线预测与
NCBI搜索比对得到了miR398的靶基因有病程相
关蛋白5 (pathogenesis-related proteins 5, PR5)和Cu/
Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutases,
CSD)等。
PR5是植物体内的一类受病原物或其他外界
因子胁迫而诱导表达的蛋白质 , 在植物抵御疾
病、响应外界胁迫以及适应不良环境等方面发挥
着重要作用(张玉等2012)。在高盐胁迫下烟草中
PR5的表达量增加, 而且在接种有印度梨形孢菌的
烟草中PR5大量表达(惠非琼等2014)。CSD是活性
氧(reactive oxygen species, ROS)的清除剂, 能够将
具有剧毒的O2¯·等转变为毒性较小的H2O2, 植物中
植物生理学报2164
的miR398通过靶向CSD实现对病原物的抗性。
CSD在多种逆境胁迫响应中扮演着重要角色, 如调
节铜代谢平衡, 应答重金属、蔗糖、臭氧等非生物
胁迫, 以及参与生物胁迫响应等(丁艳菲等2010)。
我们近期的研究发现, 用疫霉菌处理番茄后, 植株
体内MIR398的表达量下降, 而CSD的表达量升高
(Luan等2015); 鲁玉柱等(2011)的研究发现过表达
CSD的水稻对重金属铜胁迫表现出良好的抗性。
上述工作都为研究番茄中miR398的作用提供了重
要信息。
在番茄与烟草植株中均有miR398的存在, 但
二者的基因序列存在一定的差异。目前 , 关于
miR398与靶基因互作尤其是miR398在烟草中参与
胁迫响应的报道相对较少。为了进一步研究
miR398的功能, 我们从番茄中克隆pri-MIR398基因,
构建相应的过表达载体, 利用农杆菌介导的叶盘法
转化烟草, 通过实时定量PCR检测烟草中MIR398及
其靶基因的表达量变化, 掌握miR398参与抗逆相
关基因的调控方式, 为全面揭示miR398参与抗逆
相关基因的表达和异源调控机制奠定了基础。
材料与方法
1 实验材料
醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium L.)材料
L3708、烟草(Nictiana tabacum L. cv. ‘89’)、根癌
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101、大肠
杆菌DH5α及质粒pBI121均为本实验室保存。
RNAiso plus试剂、切胶回收试剂盒、T4 DNA连
接酶、限制性内切酶、pMD18-T载体、DNA
Marker和Ex Taq均为大连宝生物公司产品。植物
基因组DNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒为天根
公司产品。引物合成、测序工作在华大基因(北
京)公司完成。
2 实验方法
2.1 番茄中MIR398基因的克隆
参照试剂盒的说明, 提取番茄基因组DNA。
根据我们得到的MIR398基因序列 (GenBank:
AC232704.1), 用Primer 5软件设计其特异性引物进
行PCR扩增, miR398-FP为5′-TACTTGGATTTG-
TACCCT-3′; miR398-RP为5′-TCTGACTCTGT-
CACCGAT-3′。将PCR产物与载体pMD18-T在16
℃下连接过夜, 获得重组质粒pMD18-T-MIR398,
用热激法将其转入大肠杆菌感受态细胞中, 提取
菌液质粒进行PCR扩增, 用限制性内切酶EcoRI和
HindIII对质粒进行双酶切鉴定。将阳性质粒送华
大基因(北京)公司测序, 分析结果。
2.2 植物过表达载体的构建
在MIR398的特异性引物的上、下游分别插入
BamHI和SacI的酶切位点(下划线部分), 以质粒
pMD18-T-MIR398为模板进行PCR扩增并做电泳
检测。引物序列为, miR398-FP: 5′-CGGGATCC-
AATGATGATGAGCAATGGTG-3′; miR398-RP:
5′-CGAGCTCTCGTTGTTGGTGTTAGAGTTA-3′。
分别将PCR产物和质粒pBI121于37 ℃双酶切
过夜, 回收纯化产物, 在16 ℃下连接, 获得MIR398与
35S启动子基因融合的表达载体pBI121-MIR398。
将其转入大肠杆菌感受态细胞, 提取重组菌中的
质粒做PCR检测和酶切验证。
2.3 农杆菌对烟草的转化
用冻融法将pBI121-MIR398转化至根癌农杆菌,
挑取阳性菌落于新鲜的YEB培养基中, 振荡培养后,
以该菌液为模板进行PCR鉴定。采用农杆菌介导的
叶盘法转化烟草, 提取野生型和转化株的DNA, 对
MIR398进行PCR扩增, 分别以pBI121-MIR398和水作阳
性对照和空白对照, 对比分析基因转化是否成功。
2.4 烟草中miR398的靶基因预测
用psRNATarget软件在线预测miR398在烟草中
的靶基因, 参数均设为默认值。在NCBI的BLAST
程序中对靶基因序列进行搜索比对并确定其功能。
2.5 MIR398及其靶基因的表达特性以及抗逆作用
的分析
利用TRIzol法提取转基因烟草和野生型烟草
的RNA, 以反转录后的cDNA为模板, 通过QRT-PCR
检测MIR398及其靶基因的表达情况。以番茄Actin
(GenBank: U60478.1)作内参, MIR398下游引物使用
试剂盒中的Uni-miR qPCR Primer, 利用Primer 5设
计MIR398的上游引物及其靶基因引物(表1)。
实验结果
1 番茄MIR398基因及其过表达载体
以番茄DNA为模板做PCR扩增, 得到MIR398
的电泳条带(图1-A), 符合预期。将该目标条带回
贺晓丽等: 番茄MIR398基因的克隆及其在烟草中的表达分析 2165
收构建重组质粒pMD18-T-MIR398并转化大肠杆
菌, 对获得的阳性克隆质粒测序, 结果与原始序列
相同, 证明可以用于载体的构建。以pMD18-T-
MIR398为模板进行PCR扩增, 得到带有限制性内
切酶酶切位点的MIR398的片段(图1-B)。对质粒
pBI121进行双酶切后, 获得2个大小不同的片段(图
1-C), 回收大片段。
表1 MIR398及其靶基因的实时定量PCR引物
Table 1 Real-time PCR primers of MIR398 and its target genes
引物名称 引物序列(5′→3′)
miR398-FP TGTGTTCTCAGGTCACCCCTT
PR5-FP ACTTTGATGGTGCTGGTAGAG
PR5-RP CGCGTATTCGGCTAAGGTATT
CSD-FP GCATGGTGCTCCTGAAGAT
CSD-RP TCTGCTTGTCGGTAATGGTAAA
图1 MIR398 (A)及其加酶切位点的PCR产物(B)和质粒pBI121的双酶切(C)电泳
Fig.1 The electrophoresis of the PCR product of MIR398 (A) and its with cleavage site (B) and pBI121 double-enzyme cleavage (C)
M1: DL2000 DNA Marker; M2: λ-EcoT14 I DNA Marker; 1: MIR398的PCR产物; 2: 加酶切位点的MIR398的PCR产物; 3: 质粒pBI121的
双酶切产物。
图2 重组质粒pBI121-MIR398的PCR检测(A)和
双酶切验证(B)
Fig.2 The detection of pBI121-MIR398 by PCR (A) and
double-enzyme cleavage (B)
M1: λ-EcoT14 I DNA Marker; M2: DL2000 DNA Marker; 1:
MIR398的PCR产物; 2: pBI121-MIR398的双酶切产物。
用pBI121-MIR398转化大肠杆菌, 对获得的阳
性重组质粒进行PCR检测(图2-A)和酶切验证(图
2-B), 所得电泳条带符合预期, 说明MIR398植物过
表达载体构建成功。
2 MIR398转化烟草植株的获得
利用菌液PCR检测转化有pBI121-MIR398的
农杆菌的阳性克隆, 电泳条带如图3所示。根据条
带亮度, 选择6号菌株用于烟草的转化。
图3 菌液PCR检测目的基因导入农杆菌的阳性克隆
Fig.3 PCR analysis of the genes transformed into Agrobacterium
M: DL2000 DNA Marker; 1~9: 农杆菌工程菌株。
将侵染农杆菌的烟草叶片在分化培养基上
(含500 mg·L-1羧苄青霉素)培养至长出不定芽, 转
移至含50 mg·L-1卡那霉素和500 mg·L-1羧苄青霉素
的MS生根培养基上生长, 得到转化烟草(图4-A)。
植物生理学报2166
特异性扩增MIR398, 产物电泳结果(图4-B)显示, 转
基因植株能够扩增出与阳性质粒一致的条带, 而
野生型植株无目的条带, 说明MIR398基因成功转
入烟草中。
3 烟草中预测得到miR398的靶基因
将psRNATarget软件预测得到的miR398的靶
基因序列提交到NCBI的BLAST程序中进行比对
得到其靶基因有PR5和CSD (表2)。
4 MIR398及其靶基因的表达
利用QRT-PCR对转基因烟草植株中MIR398
及其靶基因的表达量进行分析, 发现MIR398的表
达量升高(图5-A), 表明所构建的过表达载体确实
使目的基因在植株体内的表达量增加; 而靶基因
PR5和CSD的表达量均有不同程度的下降, 尤其是
PR5的下降程度更大(图5-B、C), 表明MIR398过表
达会抑制PR5和CSD的表达。
表2 miR398在烟草中的靶基因
Table 2 Potential targets of the miR398 in tobacco
靶基因 序列 NCBI序列号 配对比/%
PR5 AAGGGTCCACTGTTGA XM009800707.1 80
CSD AAGGGTCCAGTG XM009777926.1 57
讨　　论
在植物生长过程中, 难免会受到外界环境的
影响, 对其产生各种胁迫, 参与植物抗逆过程的很
多基因都是miRNA的靶标。作为第一个被报道的
受多种胁迫调控的miRNA, miR398能对致病疫
霉、高盐、干旱和ABA等胁迫做出不同模式的应
答, 这些都源于miR398与其靶基因的调控作用
(Zhu等2011)。自Sunkar和Zhu (2004)在各种胁迫
下克隆了MIR398等26个与逆境胁迫应答相关的
miRNA以来, 关于miR398在拟南芥、水稻和杨树
等植物中响应各种胁迫的实验相继报道。Luan等
(2014)证实了番茄中存在保守的miR398, 并对其组
织特异性以及在各种生物及非生物胁迫下的表达
情况进行了分析, 发现MIR398在各种胁迫条件下
的表达均受到抑制。本实验通过psRNATarget软件
在线预测和NCBI比对, 得到miR398在烟草中的靶
图4 转MIR398基因烟草的获得(A)及其PCR检测(B)
Fig.4 Acquire (A) and PCR analysis (B) of the MIR398 transgenic tobacco
M: DL2000 DNA Marker; 1: pBI121-MIR398质粒; 2: 野生型烟草; 3: 空白对照; 4~7: MIR398转基因植株。
图5 实时定量PCR检测转基因烟草中MIR398 (A)及其靶基因PR5 (B)和CSD (C)的相对表达量
Fig.5 Real-time PCR analysis of MIR398 (A) and its targets PR5 (B) and CSD (C) in the transgenic tobacco
WT: 野生型烟草; 1、5、6、8: MIR398转基因烟草株系。
贺晓丽等: 番茄MIR398基因的克隆及其在烟草中的表达分析 2167
基因有PR5和CSD, 并通过实验验证了它们之间的
负调控关系。由于PR5和CSD均属于抗性基因, 会
对各种胁迫产生防卫, 因此为研究番茄中miR398
的抗逆相关性提供了一定的理论支持。
当植物受到病原物侵染时, 会积累大量的病
程相关蛋白抵御其入侵, 保护自身免受攻击。枯
草芽孢杆菌和烟草花叶病毒都会引起烟草防卫相
关基因的表达, 激活ISR (诱导系统抗性)的SA信号
通路和PR蛋白的表达(任鹏举等2014)。目前, 关于
miRNA与PR5互作的报道相对较少, 本实验发现在
MIR398过表达烟草植株中, PR5的表达受到明显的
抑制, 初步判断二者之间存在负调控关系。由靶
基因预测结果得知miR398与PR5的碱基互补配对
程度相对较高; Zhang等(2011)的研究发现miR393*
会通过调节MEMB12的表达, 间接的影响植株中
PR1的表达量; 在PR1和PR5的表达模式分析中, 曾
看到二者在干旱、乙烯等胁迫条件下表现出一致
的响应(胡宗利等2009)。因此, 我们推断在烟草中
可能存在其他因素间接地调节PR5的表达, 使烟草
中PR5的表达量大幅增加。关于miR398的靶基因
及其相应的调控机制还有待进一步研究。
在拟南芥中, miR398靶向两种CSD: 细胞质
CSD1和叶绿体CSD2。CSD是植物抵御ROS毒害
的最主要的超氧化物歧化酶(Mittler 2002)。低温
胁迫下, 烟草叶片中H2O2和O2¯·含量显著升高, 在烟
草中异源表达番茄的LeMPK3基因会使SOD具有
更强的抗氧化酶活性, 能够更好的清除ROS, 提高
其抗低温胁迫能力(于力等2015)。这暗示了miR398
可能在氧化胁迫响应中发挥一定的作用。CSD1在
各种生物及非生物胁迫下与miR398表现出动态的
负调控关系, 而CSD2表达量的变化并不完全与
CSD1一致, 其表达量在重金属、甲基紫精和强光
照的胁迫下增加(Sunkar等2006), 而在臭氧和病菌
的感染胁迫下减少(Jagadeeswaran等2009), 由此推
断CSD2的表达并非严格受miR398的调控。本实
验获得的MIR398过表达烟草植株中CSD的表达量
受到一定程度的抑制, 通过对miR398在烟草中的
靶基因预测, 我们了解到其靶基因是叶绿体CSD2,
它与miR398的碱基互补程度较低, 这与之前的研
究一致, 为揭示CSD2与miR398的调控关系提供了
更好的证据。
植物受到外界胁迫时会表现出产量降低甚至
直接死亡, 这些问题都亟待解决。目前, 人们已通
过多种技术手段得到了不同抗性的植株。Anu等
(2015)利用VIGS技术沉默了辣椒的PR5基因后, 植
株对疫霉菌的感病性增强; Guan等(2013)通过对
C S D基因的突变获得了耐热性更强的植株。
miR398是第一个被报道的、在植物逆境胁迫应答
中下调表达的miRNA。为了提高烟草对外界胁迫
的抗性, 以miR398与靶基因之间的负调控作用为
依据, 我们可以利用基因沉默、敲除或突变等技
术通过对烟草中miR398及其靶基因的改变, 解除
miR398对靶基因的抑制作用从而改善植物的抗逆
性。关于miR398在烟草中的作用机制及其有效利
用还有待于进一步探索。
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