全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (1): 95~99 95
收稿 2012-11-16　　修定 2012-12-07
资助 中央高校基本科研业务费项目(GK201002026)。
* 通讯作者(E-mail: zhangjinjin@snnu.edu.cn; Tel: 029-
85310266)。
茶树叶片总RNA提取方法的比较研究
王梦娜, 武艳, 程国山, 张今今*
陕西师范大学生命科学学院, 西安710062
摘要: 针对茶树叶片中富含多酚类物质的特点, 以陕西地方茶树代表种质紫阳槠叶种的叶片为材料, 比较了Trizol法、异硫
氰酸胍法和改良SDS-酸酚法三种不同的总RNA提取方法。结果表明改良SDS-酸酚法能够从新鲜叶片、冷冻叶片和干燥
叶片中提取到质量高、完整性好的总RNA, 经检测28S rRNA亮度为18S rRNA的2倍, A260/A280值介于1.83~2.01之间。以鲜
叶、冻叶和干燥叶片的总RNA为材料, 进一步用于DDRT-PCR分析, 均可获得清晰稳定的多态性结果。说明改良的SDS-酸
酚法能抑制茶树叶片中多酚类物质对总RNA提取的影响, 是一种适于茶树叶片总RNA提取的有效方法。
关键词: 茶树; 改良SDS-酸酚法; 总RNA; 多酚
Comparison of Methods for Total RNA Extraction from Camellia sinensis
WANG Meng-Na, WU Yan, CHENG Guo-Shan, ZHANG Jin-Jin*
College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract: To develop an improved protocol to isolate total RNA in good yield and integrity from Camellia sin-
ensis leaves containing high levels of tea polyphenols, three different total RNA extraction techniques, the Tri-
zol method, the isothiocyanate guanidine method and improved SDS-phenol method were compared. Modified
SDS-phenol method can be used to extract the high quality and integral total RNA from fresh leaves, frozen
leaves and dry leaves. The testing result showed that the brightness of 28S rRNA was two times of 18S rRNA,
and the value of A260/A280 was between 1.83 and 2.01, and further DDRT-PCR experiment also acquired clear
and distinguished polymorphism results. So the modified SDS-phenol method is an effective way to extract to-
tal RNA for tea plants, meanwhile can inhibit the polyphenol influence on total RNA extraction.
Key words: Camellia sinensis; modified SDS-phenol method; total RNA; polyphenol
茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]为山茶
科山茶属的亚热带多年生木本常绿植物, 原产于
我国西南地区、缅甸北部和印度阿萨姆一带, 也
是我国的重要经济林木之一。陕西茶区地处秦巴
山区, 地理位置独特, 生态条件优异, 既是江北茶
区的主产区之一, 也是我国北方茶区茶树种质资
源的重要宝库。陕西地方茶树品种资源丰富, 目
前仍为原始组成状况。据其分布地域特点、栽培
历史以及组成类型可分为紫阳群体、西乡大河坝
群体等7 大群体28个品种(王镇恒和王广智2000)。
目前已从陕西茶树种质资源的多样性 (李剑
2008)、适制性(李剑2008)、特殊资源筛选(潘庆等
2007)及茶树抗寒性(武艳等2012)等方面开展了一
些基础性研究, 并取得了一定的成果。但陕西茶
树资源特有的抗寒(武艳等2012)、无花(潘庆等
2007)和富含茶多酚(李剑2008)等优良性状的分子
机制尚不明确。茶树的组织器官中富含茶多酚、
茶多糖和大量次生代谢物质(李剑2008), 且RNase
活性较高, 这都使得茶树总RNA提取难度增大, 从
一定程度上限制了茶树分子生物学研究的进行。
开展茶树功能基因的克隆和重要经济性状的
分子机制研究, 从茶树中提取纯度高、完整性好
的总RNA是必不可少的基本实验技术。因此, 本
研究拟进行茶树总RNA提取的方法研究, 基于对
核酸提取原理的了解, 比较Trizol法、异硫氰酸胍
法和改良后的SDS-酸酚法, 以期获得质量高、纯
度好的茶树叶片总RNA, 筛选并确定适合茶树这
种多酚多糖含量类植物叶片总RNA提取的最佳方
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报96
法。为今后合理开发和利用陕西地方茶树种质资源,
开展茶树重要基因的克隆和功能研究, 进一步探
索miRNA、siRNA等小RNA与茶树生长发育、抗
病耐逆基因的表达调控分子机制, 合理利用和改
良茶树资源, 提高茶叶产量和品质奠定实验基础。
材料与方法
1 供试材料
供试材料为茶树[Camellia sinensis (L.) O.
Kuntze]紫阳群体种中的代表种质紫阳槠叶种二年
生扦插苗, 取自陕西省安康市紫阳县茶叶试验站,
并移栽于陕西师范大学植物资源圃栽培保存。分
别以当年生新枝上的幼叶、冻叶(–20 ℃保存)和干
叶(硅胶干燥2~3 d)为材料提取总RNA。
2 主要试剂
聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) 、异硫氰酸胍、β-
巯基乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)、氯化锂(LiCl)、
乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na 2)、硼酸、尿素
(Urea)、柠檬酸三钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、L-
半胱氨酸为Amresco产品; 交联聚乙烯吡咯烷酮
(PVPP)为Sigma产品; 水饱和酚为Wolsen产品; 其
他均为常规试剂。锚定引物、随机引物均为上海
生工公司产品; Recombinant DNase I (RNase-
free)、Reverse Transcriptase M-MLV反转录酶、
Taq DNA聚合酶(5 U∙µL-1)、Mg2+ (25 mmol∙L-1)、
dNTPs (2.5 mmol∙L-1)、DL2000 Marker、DL500
Marker、Recombinant DNase I (RNase-free)以及
Ribonuclease Inhibitor等购自TaKaRa公司; 用于
RNA提取的所有试剂及一次性塑料耗材均用0.1%
DEPC水(V/V)处理并高压灭菌, 玻璃制品及研钵等
180 ℃烘烤8 h备用。
3 方法
3.1 总RNA提取
茶树叶片总RNA的提取采用以下三种方法:
3.1.1 Trizol法 Trizol法操作步骤参考孙德权等
(2009)方法, Trizol购自宝生物工程(大连)有限公司。
3.1.2 异硫氰酸胍法 参考董宁光等(2011)方法。
3.1.3 改良SDS-酸酚法 参考王暑辉等(2012)方法,
并加以改进: 于2 mL离心管中加入850 µL提取缓
冲液(100 mmol∙L-1 LiCl, 50 mmol∙L-1 EDTA, 100
mmol∙L-1 Tris, 1% SDS, 用前加入PVP和β-巯基乙
醇, 终浓度分别为16%和l%), 置于80 ℃预热; 分别
称取0.3 g鲜叶、冻叶、干叶置于液氮预处理过的
研钵中, 迅速加液氮及适量PVPP研磨成细粉末状,
分装于两个预热的离心管中, 冰浴15 min; 15 300×g,
4 ℃离心15 min; 将上清转移到1.5 mL离心管中,
加入l/3体积5 mol∙L-1 KAc (pH 4.8), 充分混匀后冰
浴15 min; 15 300×g, 4 ℃离心15 min; 将上清转移
到新的1.5 mL离心管中, 每管加入等体积氯仿:异
戊醇(24:1), 充分混匀后冰浴10 min; 15 300×g, 4 ℃
离心15 min; 将上清转移到新的1.5 mL 离心管中,
加入等体积异丙醇, 混匀后置于–20 ℃沉淀2 h;
15 300×g, 4 ℃离心15 min; 弃上清, 加入600 µL重
悬缓冲液(2 mol∙L-1 LiCl, 50 mmol∙L-1 EDTA)重悬
沉淀; 15 300×g, 4 ℃离心15 min; 加入600 µL 75%
乙醇洗涤2次, 每次冰浴5 min后15 300×g, 4 ℃离心
5 min; 室温放置 10 min使酒精完全挥发; 加入30
µL 0.1% DEPC ddH2O溶解RNA, –80 ℃的超低温
冰箱中保存。
3.2 总RNA样品中DNA的去除及检测
总RNA样品中DNA的去除参考张今今(2003)
方法。取溶解于DEPC ddH2O的总RNA溶液约2
µL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳, 紫外成像系统记录
电泳结果。分别取每种方法提取的总RNA 2 μL,
在核酸蛋白测定仪(ND2000超微量)上分别测定样
品在280、260 nm处的吸光值, 并计算A260/A280的比
值。
3.3 DDRT-PCR
反转录反应体系参照Reverse Transcriptase M-
MLV (RNase H)使用说明, 反转录引物为5-AAGC-
TTTTTTTTTTG-3 (B0327)和5-AAGCTTTTTTT-
TTTA-3 (B0328)。DDRT-PCR (differential display
reverse transcription PCR)步骤参考张今今(2003)方
法, 锚定引物为5-AAGCTTTTTTTTTTG-3 (B0327)
和5-AAGCTTTTTTTTTTA-3 (B0328)。随机引物
为5-TACAACGAGG-3 (B0301)。扩增产物用55 W
恒定功率进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染步骤
参考Ji等(2007)。
实验结果
1 三种方法对茶树叶片总RNA的提取
电泳结果显示(图1), 三种方法中仅异硫氰酸
胍法和改进的SDS-酸酚法能从新鲜叶片中提取出
不同产率的总RNA。Trizol法对应的泳道中, 无
王梦娜等: 茶树叶片总RNA提取方法的比较研究 97
28S rRNA和18S rRNA, 只可见少量5S rRNA, 说明
该方法提取的总RNA完全降解, 不适用于茶树总
RNA的提取。异硫氰酸胍法提取的总RNA可见
28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA, 但是条带锐度
不好, 有一定程度的弥散或降解, 且点样孔有明显
的残留; 改良的SDS-酸酚法2次平行重复的结果表
现一致, 28S和18S rRNA清晰可辨, 锐度好, 无弥散
或降解, 点样孔干净无残留。A260/A280分别为1.94
和2.0, 均处于1.9~2.0范围内, 说明此方法提取的总
RNA完整性最好, 纯度最高, 是三种方法中最适合
茶树叶片总RNA提取的方法。
2 改良SDS-酸酚法提取茶树鲜叶、冻叶、干叶的
总RNA
进一步采用改良SDS-酸酚法对茶树鲜叶、冻
叶、干叶分别提取总RNA, 电泳结果显示(图2), 该
方法从三种叶片材料中均能提取出总RNA, 其中
鲜叶的总RNA电泳条带清晰, 锐度好, 28S rRNA亮
度是18S rRNA亮度的2倍, 无明显的弥散或降解,
质量最好; 冻叶的总RNA电泳条带清晰, 无明显弥
散或降解, 28S rRNA亮度较鲜叶总RNA 28S rRNA
略差; 干叶的总RNA电泳条带清晰度较鲜叶、冻
叶低, 28S rRNA和18S rRNA亮度较差, 有一定的弥
散或降解, 但仍可见清晰的三条带, 说明茶树鲜
叶、冻叶和干叶中都能提取到一定纯度的总RNA。
分别检测三种茶树叶片总RNA在280 nm、
260 nm处的吸光值(表1)。结果表明鲜叶的总RNA
A260/A280值为1.99±0.01, 说明鲜叶的总RNA纯度好,
无蛋白质、酚类物质、β-巯基乙醇等污染, 且产率
最高, 平均浓度为480 ng∙µL-1; 冻叶的总RNA A260/
A280值为1.97±0.04, 说明冻叶的总RNA纯度较好,
无β-巯基乙醇等污染; 干叶的总RNA A260/A280值为
1.865±0.035, 说明干叶的总RNA有一定程度β-巯
基乙醇污染, 产率较低。
图1 3种不同方法提取茶树鲜叶总RNA的电泳结果
Fig.1 Electrophoresis results for total RNA extraction from
Camellia sinensis with three methods
1, 2: Trizol法; 3, 4: 异硫氰酸胍法; 5, 6: 改进SDS-酸酚法。
图2 3种不同茶树叶片的总RNA提取电泳结果
Fig.2 Electrophoresis result for total RNA extraction from
three leaves
1, 2: 茶树鲜叶; 3, 4: 茶树冻叶; 5, 6: 茶树干叶。
表1 改良SDS-酸酚法提取不同处理的茶树叶片总RNA的
产量与浓度
Table 1 Comparison of yield and purity of total RNA from
different materials with modified SDS-phenol
材料 A260 A280 A260/A280 总RNA浓度/ng∙µL
-1
鲜叶 11.774 5.901 2.00 471.0
12.368 6.246 1.98 491.8
冻叶 7.993 3.937 1.93 413.5
6.876 3.420 2.01 375.1
干叶 6.686 3.653 1.83 280.9
6.733 3.546 1.90 269.3
3 DDRT-PCR
为进一步证明改良的SDS-酸酚法提取的总
RNA完全可以用于DDRT-PCR等分子生物学方面
的研究, 将茶树苗置于4 ℃人工气候箱中进行冷胁
迫诱导, 取形态学顶部向下数第2片完全展开的功
能叶片, 分别提取鲜叶、冻叶和干叶的总RNA, 经
反转录反应后用于DDRT-PCR反应。从表1可见冻
叶和干叶在总RNA的质量和产率上与鲜叶相比略
差(图2、表1), 但三种叶片材料的总RNA在反转录
后, 都可以获得扩增条型丰富的DDRT-PCR结果
(图3)。从扩增结果可见, 每一种引物对在单一电
泳泳道可稳定显示数十个条带, 主带清晰, 扩增片
植物生理学报98
段介于100~2 000 bp之间, 条带丰富, 条带强度较
好, 稳定性、重复性好。表明改进的SDS-酸酚酚
法提取的总RNA 并反转录成的cDNA样品, 可用于
基因的克隆、表达等分子生物学研究。
讨　　论
总RNA的提取和纯化是基因表达、克隆及
功能等分子生物学研究的基础, 其质量直接影响
后续cDNA合成、DDRT-PCR及小RNA的提取和
二代测序等实验的进行。茶树叶片中含有丰富的
茶多糖、茶多酚及萜类化合物, 茶多酚会被氧化
成能与RNA共结合的醌类物质, 茶多糖因具有与
RNA相似的理化性质而与RNA形成很难分开的共
沉淀, 在对茶叶进行研磨时还会产生茶黄素、茶
红素等氧化产物(王暑辉等2012), 这些都增加了茶
树RNA提取的难度。
茶多酚是茶树叶片中多酚类物质的总称, 包
括黄烷醇类、花色素苷类、黄酮类、黄酮醇类和
酚酸类物质(黄丽凤等2010), 是形成茶叶色香味的
主要成分, 同时也是茶叶中具有保健功能的有效
成分。因此有效地防止和抑制茶多酚的氧化, 是
茶树总RNA提取的重要环节。在改进的SDS-酸酚
法中, 加入了络合物和强还原剂以有效抑制茶多
酚被氧化。液氮研磨时加入不溶性PVPP, 防止材
料在研磨过程中被氧化, 同时在提取液中加入水
溶性PVP。聚乙烯吡咯烷酮是多酚类化合物的螯
合剂, 可与多酚络合形成复合物, 以阻止醌类物质
的形成, 有效防止总RNA被裹挟损失(Medina等
2001)。提取缓冲液中还加入了强还原剂β-巯基乙
醇, 既可提供强还原条件防止多酚被氧化, 同时可
打断多酚氧化酶的二硫键使之失活, 从而有效地
提高了RNA的完整性。与常规的核酸提取方法不
同, 改进的SDS-酸酚法中, 未向组织匀浆液中加入
水饱和酚进行抽提, 而是在DNase酶解除去DNA后
加入酚, 是因为PVP结合多酚类物质的同时, 也与
水饱和酚发生不可逆的结合, 产生白色絮状物, 裹
携大量的RNA, 降低产率, 因此待除去DNA后再用
水饱和酚抽提就可完全除去残余蛋白质。
茶多糖是茶叶复合多糖的简称, 由糖类、果
胶、蛋白质等组成 , 其中多糖部分包括阿拉伯
糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、半乳葡聚等水溶性
多糖 , 也是茶叶中的主要有效成分 (周小玲等
2007)。但茶多糖的许多理化性质与RNA相似, 在
提取过程中往往产生难溶于水的凝胶状沉淀, 或
溶解后产生黏稠状的溶液而无法获得总RNA沉淀
(Logemann等1987)。以往去除多糖的方法通常有
低浓度乙醇沉淀法(Tesniere和Vayda 1991)、醋酸
钾沉淀法(Ainsworth 1994), 此外适当提高缓冲液
中NaCl浓度也有助于去除多糖(Fang等1992)。本
实验中, 在第一次离心去除大量细胞破碎物后, 即
向上清液中加入1/3体积5 mol∙L-1 KAc (pH 4.8), 离
心后得到大量凝胶状茶多糖沉淀物, 有效地去除
了茶多糖的干扰。
本研究针对茶树叶片富含茶多酚和茶多糖的
特点, 对SDS-酸酚法加以改进, 在提取缓冲液中加
入了16% PVP和1% β-巯基乙醇, 在匀浆上清液中
加入了5 mol∙L-1醋酸钾, 有效防止多酚与多糖的干
扰, 获得了完整性好、纯度高的总RNA, 完全能满
足后续茶树分子遗传学方面的研究。改进的SDS-
酸酚法还适合茶树冻叶和干叶的提取, 从干叶和
冻叶中获得的总RNA与鲜叶的DDRT-PCR结果无
明显差别, 这也为野生茶树种质资源的野外采样
和研究提供了便利。
图3 茶树叶片总RNA DDRT-PCR结果
Fig.3 DDRT-PCR for total RNA extraction from Camellia
sinensis
1, 2: 鲜叶; 3, 4: 冻叶; 5, 6: 干叶(1~6锚定引物B0327和随机引
物B0301); 7, 8: 鲜叶; 9, 10: 冻叶; 11, 12: 干叶(7~12锚定引物B0328
和随机引物B0301)。
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