全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月228
羽衣甘蓝授粉过程中柱头蛋白质的泛素化
蓝兴国, 杨佳, 赵昕, 于凯, 李玉花 *
东北林业大学生命科学学院发育生物学研究室, 哈尔滨 150040
提要: 分析自花授粉与异花授粉后的羽衣甘蓝柱头蛋白质泛素化变化的结果表明, 自花授粉30 min后的柱头蛋白质泛素化
水平显著增加, 45 min时达到峰值; 异花授粉的柱头蛋白质泛素化水平没有变化。
关键词: 羽衣甘蓝; 自交不亲和; 柱头; 蛋白质泛素化
Ubiquitination of Protein Level of Stigma after Pollination in Brassica oleracea
var. acephala
LAN Xing-Guo, YANG Jia, ZHAO Xin, YU Kai, LI Yu-Hua*
Department of Developmental Biology, College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: The ubiquitinated protein levels of stigma were detected after self-pollination and cross-pollination in
ornamental kale (Brassica oleracea var. acephala). The results showed that the ubiquitinated protein level in-
creased within 30 min following a self-pollination, which had a high peak at 45 min after self-pollination.
However, the noticeable change of the ubiquitinated protein level didn’t occur after cross-pollination compared
with self-pollination.
Key words: Brassica oleracea; self-incompatibility; stigma; protein ubiquitination
收稿 2010-01-12 修定 　2010-02-08
资助 国家自然科学基金(30900115)和中央高校基本科研业务
费专项基金(DL0 9BA0 8)。
* 通讯作者(E-ma i l : lyhsh en@1 2 6 .c om; T el : 0 4 5 1 -
8 2 1 9 1 7 8 3 )。
蛋白质的泛素化/去泛素化调节是一种可逆过
程, 是细胞对环境刺激的基本调节方式(Pickart 2001;
Reyes-Turcu等 2009)。在植物中, 蛋白质泛素化
广泛参与细胞内多种生理过程, 如激素信号转导、
花发育、光周期现象、光形态建成、衰老、抗
逆境反应以及自交不亲和性(self-incompatibility, SI)
等(于晓敏等 2006; Smalle和Vierstra 2004)。现有
的研究表明, 芸苔属植物自交不亲和是由ARC1介
导的柱头细胞内信号通路引起的(Zhang等 2009)。
ARC1具有泛素E3连接酶的活性, 可能是通过调控
底物蛋白质泛素化引起的 SI (Stone等 2003; Gu等
1998)。本文研究羽衣甘蓝自花和异花授粉后柱头
蛋白质泛素化水平的变化以及蛋白质泛素化与 SI
的关系。
材料与方法
羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala DC.)
S13-bS13-b自交不亲和系和W14自交亲和系种植于本
校花卉生物工程研究所(蓝兴国等 2009)。S13-bS13-b
自交不亲和系授粉之前去雄后, 分别进行自花与异
花授粉(由W14自交亲和系提供花粉)。于授粉后
0、15、30、45、60、120 和 180 min收集柱
头, 每个组合大约取 200个柱头, 速冻于液氮中。
柱头总蛋白质的提取参考Stone等(2003)文中
方法: 在300 μL总蛋白提取缓冲液[50 mmol·L-1 Tris-
HCl (pH 7.5), 150 mmol·L-1 NaCl, 10 mol·L-1 MgCl2, 5
mmol·L-1 EDTA, 5 mmol·L-1 DTT, 10% (V/V)甘油]中
加入一小勺聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,
PVP)和 2 μL的蛋白酶抑制剂后, 柱头放在液氮中
研磨成粉末, 加到蛋白缓冲液中, 剧烈混匀。冰上
保温 30 min后, 于 4 ℃下、以 15 000×g离心 20
min。吸取上清液, 再于 4 ℃下、以 15 000×g离
心 20 min。吸取上清液, 并分装保存。
蛋白质浓度用2-D Quant kit试剂盒(Amersham
Biosciences)定量测定。取 10 μg蛋白样品, 以 8%和
12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离。Western blot分
析时, 将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜(Amersham
Biosciences)。用含有 5%牛血清白蛋白(BSA)的
TBST (含 0.1 %的 Tween-20)于室温下封闭 2 h, 一
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抗为抗泛素的抗体(Sigma Aldrich, 稀释倍数为 1:
100), 二抗为与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗
体(稀释倍数为 1:5 000)。制备 LumiGLO混合液
(Cell Signaling Technology)均匀地滴在PVDF膜上,
在Kodak IS2000R图像工作站上作化学发光检测。
实验结果
1 柱头蛋白质的提取与分离
收集 S13bS13b自交不亲和系自花授粉和异花授
粉的柱头提取蛋白质并经定量后, 以 12% SDS-
PAGE电泳分离, 考马斯亮蓝染色的结果说明, 提
取的柱头蛋白质条带清晰, 质量较好(图 1)。
2 自花与异花授粉柱头蛋白质泛素化水平的变化
将等量的蛋白质样品以8%的SDS-PAGE电泳
分离后, 采用抗泛素的抗体通过Western blot的方
法检测蛋白质泛素化的结果表明, 自花授粉30 min
后的柱头蛋白质泛素化水平有明显增加; 自花授粉
45 min后的柱头蛋白质泛素化水平达到峰值; 随后
蛋白质泛素化水平下降, 并维持在基本的水平上(图
2-a)。而在异花授粉过程中, 柱头蛋白质泛素化水
平变化不明显 (图 2-b)。这说明蛋白质泛素化是特
异性地参与了自花授粉后引起 SI反应的。
讨　　论
芸苔属SI的生理学研究表明, 自花与异花授粉
会引起柱头细胞内不同的生理反应(D icki ns on
1995), 在柱头细胞内可能有2种不同的信号通路参
与授粉反应。本研究发现, 自花与异花授粉对柱头
蛋白质泛素化的影响是不同的。自花授粉诱导柱
头内蛋白质泛素化水平增高, 而异花授粉引起的蛋
白质泛素化变化并不明显。这说明自花授粉是特
异性地诱导柱头蛋白质泛素化的, SI信号通路的传
递与蛋白质泛素化密切相关, 而蛋白质泛素化可能
不参与异花授粉过程。
蛋白质泛素化是一种蛋白质翻译后修饰, 调控
蛋白质的生物活性。一般认为, 多聚泛素化修饰的
蛋白运送到26S蛋白酶体中降解, 一般标记靶蛋白
的泛素链不少于 4个泛素分子; 而少于 4个或是单
泛素化修饰可能与膜转运和转录调控等有关
(Vierstra 2009)。自花授粉中蛋白质泛素化条带的
图 1 柱头蛋白质的电泳图谱
Fig.1 Electrophorogram of protein extracts from stigma
1: 未授粉的柱头蛋白质; 2: 自花授粉后 1 h的柱头蛋白质;
3 : 异花授粉后 1 h的柱头蛋白质。
图 2 授粉后柱头的蛋白质泛素化水平
Fig.2 Level of ubiquitinated protein from stigma after pollination
a: 自花授粉后的柱头蛋白质; b: 异花授粉后的柱头蛋白质。
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增加, 一方面可能是由于有多种泛素化的底物, 另
一方面可能是由于不同数量的泛素化修饰引起的。
因此, 进一步鉴定这些泛素化的底物并对其功能进
行分析, 对揭示 SI的分子机制来说可能是有意义
的。
参考文献
蓝兴国, 杨佳, 李玉花(2009). 羽衣甘蓝花粉 SCR13-b基因的分离
及其功能分析. 园艺学报, 36: 539~544
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teolytic pathway. Annu Rev Plant Biol, 55: 555~590
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an E3 ubiquitin ligase and promotes the ubiquitination of
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