全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 49~56 4 9
收稿 2010-08-02 修定 　2010-08-18
资助 国家高技术研究发展计划(“863” 计划) (2007AA10Z1
05)、国家自然科学基金(30670193)和天津市自然科学
基金(08JCYBJC03800)。
* 通讯作者(E-mail: wangnn@nankai.edu.cn; Tel: 022-
2 3 5 0 4 0 9 6 )。
大豆 GmcpSecA 基因的克隆及表达特异性
党利洁, 李鹏丽, 刘栋, 诸锡莉, 龚清秋, 王宁宁 *
南开大学生命科学学院, 天津 300071
摘要: Sec途径是将核编码的叶绿体蛋白输入到类囊体腔的蛋白分选途径之一, 对叶绿体正确行使其功能有重要作用。前
期研究获得了拟南芥AtcpSecA功能缺失的突变体agy1, 其叶片呈黄白色, 叶绿体发育缺陷, 内部缺少类囊体片层结构。我
们从大豆中克隆了拟南芥AtcpSecA的同源基因GmcpSecA基因的全长 cDNA序列和5端ATG上游1.5 kb的启动子序列, 通
过RT-PCR的方法对GmcpSecA基因表达的器官特异性进行了初步分析; 并构建了GmcpSecA::GUS和35S::GmcpSecA融合
基因, 以农杆菌介导的转化方法获得转基因拟南芥。GUS组织化学染色结果表明: 在转基因拟南芥的子叶、叶片、花萼等
绿色组织中都有较强的GUS表达, 而在非绿色组织中没有GUS表达。通过将过表达载体p35S::GmcpSecA转化agy1, 结果
表明GmcpSecA能够部分回补拟南芥agy1突变体的表型。推测GmcpSecA基因具有与AtcpSecA基因相似的功能, 在叶绿体
发育过程中发挥重要作用。
关键词: 大豆; GmcpSecA基因; 表达特异性; 回补
Cloning and Expressional Characterization of Soybean GmcpSecA Gene
DANG Li-Jie, LI Peng-Li, LIU Dong, ZHU Xi-Li, GONG Qing-Qiu, WANG Ning-Ning*
College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: The Sec-dependent protein sorting pathway is essential for protein import into the thylakoid lumen
and is important for the proper function of the chloroplast. We have previously reported the characterization of
a loss-of-function mutant of cpSecA, the ATPase subunit of the Sec protein complex. The homozygous mutant
is albino and seedling lethal, and lacks the thylakoid structure. We cloned the full-length cDNA of GmcpSecA and
its 1.5 kb promoter sequence upstream of the coding region from soybean, and examined the expression pat-
terns of GmcpSecA by RT-PCR in soybean. In this study, we constructed GmcpSecA::GUS and 35S::GmcpSecA
fusion genes and introducted into Arabidopsis by Agrobacterium-mediated floral diping. Histochemical staining
of GUS revealed that GmcpSecA is strongly expressed in all green tissues including cotyledons, rossette leaves,
and sepals whereas no expression could be detected in non-green tissues such as roots, inflorescencs, and
siliques. Then we transformed the agy1 mutant with p35S::GmcpSecA, and the results showed that GmcpSecA
can partialy restore the phenotype of agy1. Our data indicates that the GmcpSecA gene has a function similar to
AtcpSecA, and that GmcpSecA plays an important role in chloroplast biogenesis.
Key words: soybean; GmcpSecA gene; expression pattern; complementation
叶绿体是绿色植物进行光合作用的重要的细
胞器, 叶绿体内有 2 000~2 500 种蛋白, 只有不足
100 种蛋白是由叶绿体的基因组编码的, 其余大部
分都是由核基因组编码(Chi等2008)。核基因编码
的叶绿体蛋白首先在胞质中合成前体, 然后通过不
同的途径, 最终到达类囊体膜或类囊体腔。目前所
了解的类囊体蛋白转运机制有 Tat 途径、Sec 途
径、SRP 途径和自发途径。SecA (cpSecA)是叶
绿体蛋白转运Sec途径中一个重要组分(Di Cola等
2005), 它的功能是作为重要的蛋白转位因子将核编
码的叶绿体蛋白转运到类囊体腔(Hawwrd等 1997)。
它参与转运的类囊体腔蛋白是光系统 I和光系统II
的重要组分(Keegstra和Cline 1999), 对光合作用以
及叶的发育有重要的作用。我们在前期研究中获
得了叶片呈黄白色表型的拟南芥突变体agy1, 并证
明这是由于 T- D N A 插入造成 A t c p S e c A 基因
(At4g01800)被破坏导致的(Liu 等 2010), 此突变体
叶片呈黄白色, 叶绿体发育缺陷, 内部缺少类囊体
研究报告 Original Papers
植物生理学报5 0
片层结构, 不能进行正常的生长发育、开花、结
实。
大豆是全球重要的经济作物, 深入了解大豆叶
绿体发育的特点, 对于提高大豆叶片的光合效率并
最终提高大豆产量, 具有重要的理论和实践意义。
根据同源序列比对我们从大豆中找到了拟南芥
AtcpSecA 的同源基因 GmcpSecA, 并克隆了其全长
cDNA序列及其 5 端 ATG 上游 1.5 kb 的启动子序
列。通过对 GmcpSecA 全长 cDNA 序列分析表明,
该基因与豌豆、菠菜和拟南芥的 SecA基因具有很
高的同源性; 分别利用 RT-PCR 和启动子 -GUS 报
告基因系统检测该基因的表达特点, 发现该基因特
异于绿色组织中表达。SecA 功能回补实验表明
GmcpSecA基因能够部分地回补拟南芥agy1突变体
由于 T-DNA 插入造成的 SecA 功能缺陷。这些研
究结果, 暗示着GmcpSecA基因在大豆叶绿体的蛋
白转运和功能建成中发挥重要作用。
材料与方法
实验所用的植物材料为模式植物拟南芥(Ara-
bidopsis thaliana L.) Colombia-0 型, 生长条件: 光 /
暗时间为 16 h/8 h; 光照强度为 75 μmol·m-2·s-1; 温
度为(22±1) ℃。拟南芥 agy1 突变体为 T-DNA 插
入突变体, 将在 4 ℃黑暗下春化 3 d 的 AGY1/agy1
杂合突变体种子均匀铺在含有40 mg·L-1卡那霉素
的 1/2MS (0.7% 琼脂、1% 蔗糖)培养基上, 生长
条件同上, 待幼苗长到 2 周大时, 将幼苗移到土里,
在相同的条件下继续生长。
实验所用大豆[Glycine max (L.) Merr.]品种为
‘ 中黄 13’, 生长条件: 光 / 暗时间为 16 h/8 h; 光照
强度为 80 μmol·m-2·s-1; 温度为 25 ℃。
大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株用于感
受态细胞的制备; 根癌农杆菌(Agrobac ter ium
tumefaciens) GV3101菌株用于拟南芥的遗传转化;
pMD-18T Vector用于基因克隆, 携带GUS基因的植
物表达载体 pCAMBIA1301 用于载体构建, 以上菌
株和载体均为本实验室保存。
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、用于 PCR
的 DNA 聚合酶、高保真聚合酶 Pfu、质粒提取试
剂盒及DNA回收试剂盒均购自宝生物(TaKaRa)公
司; 用于 RT-PCR 的 DNA 酶和反转录酶等购自
Promega 公司。上海生物工程公司代为合成引
物。潮霉素(hygromycin)购自 Roche 公司; 其他生
化试剂均为国产分析纯。
分别选取 V2 时期的大豆子叶、V5 时期大豆
的根、茎和叶材料; R2 时期大豆花(包括萼片)材
料; R3 时期大豆的种荚材料[大豆发育时期的界定
参考 Fehr 等(1971)方法]。每个样品随机取样 3次,
液氮速冻后, -70 ℃冰箱保存备用。大豆材料总
RNA的提取用异硫酸腈胍 -酚法, 药品的使用、配
制以及具体操作步骤参考《分子克隆实验指南》
(第三版) (Sambrook和Russell 2002)。提取总RNA
后用一定量的 DNase (RNase free)消化, 然后用基
因特异引物以总 RNA为模板进行 PCR反应, 经电
泳检测后没有发现任何扩增带, 说明RNA样品中的
基因组DNA已经去除干净。样品经过严格定量后,
取 2 μg利用 Promega ImProm-IITM 反转录酶进行反
转录, 得到 cD N A。操作方法参照说明书。将
cDNA稀释 10倍作为 PCR反应的模板。以大豆核
糖体 18S rRNA 基因为 RT-PCR 反应的内标, 内标
引物为 SRNA-1 (5-CCTTGCTTGTTGCTTTACT-
AAATAG-3)和 SRNA-2 (5-ATGCACCTTTTC-
GTTTGTTTCGGAG-3), 扩增 209 bp 的内标基因;
GmcpSecA 基因的特异引物为 GmcpSecA-1 (5-
GATTGAAGGTTGGCCTCATTCAGCAGA-3)和
GmcpSecA-2 (5-CTGCATGACTCGACCAGTA-
AACTCATC-3), 扩增目的片段长度 527 bp。半定
量 RT-PCR 反应程序为: 94 ℃变性 30 s, 55 ℃复性
30 s, 72 ℃延伸 1 min, 25 个循环; 72 ℃延伸 10
min。本研究中所有 RT-PCR 结果均经过 3 次自
RNA 提取开始独立的重复实验, 结果一致。
提取大豆 ‘ 中黄 13’ 的基因组, 以此基因组为
模板, 用引物 GmSecA_F1 (5-CCTCCGCAATTCT-
TAATTCATTCGAACC-3)和 GmSecA_F2 (5-
CTCCAGATACATATTAGTCTTGAGTGCT-3)扩增
GmcpSecA 基因。PCR 程序为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃
30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 31 个循环; 72 ℃ 10
min; 用引物 GmcpSecA_Pro1 (5-GGTACCGGA-
AACGGTGGGGGTTTCGGGAAG-3, 斜体部分为引
入的 KpnI 酶切位点)和 GmcpSecA_Pro2 (5-CC
ATGGTTCGAATGAATTAAGAATTGCGGA-3, 斜
体部分为引入的NcoI酶切位点)扩增GmcpSecA启
党利洁等: 大豆 GmcpSecA 基因的克隆及表达特异性 5 1
动子。PCR 程序为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃
30 s, 72 ℃ 1.5 min, 31 个循环; 72 ℃ 10 min。将
PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收目的
DNA 片段, 然后分别连入 TA 克隆载体 pMD-18T
Vector, 16 ℃, 连接过夜, 然后转化大肠杆菌DH5α。
选取阳性克隆摇菌提质粒。将测序正确的GmcpSecA
基因的TA克隆质粒用NcoI和BstEII双酶切, 回收
3 kb 的目的基因片段; 将测序正确的GmcpSecA基
因启动子的TA克隆质粒用KpnI和NcoI双酶切, 回
收 1.5 kb 启动子片段。分别用相同的酶对双元表
达载体 pCAMBIA1301 质粒进行双酶切, 回收载体
大片段, 连接回收的目的基因片段和载体大片段, 连
接回收的启动子片段和载体大片段, 转化大肠杆菌
DH5α, 在含有 50 mg·L-1 卡那霉素的 LB 培养基上
筛选转化子。提取阳性转化子的质粒进行酶切鉴
定, 并测序, 构建成35S启动子驱动的GmcpSecA基
因和GmcpSecA启动子驱动的GUS报告基因的双元
表达载体, 分别命名为p35S::GmcpSecA和pGmcp-
SecA::GUS。
将鉴定正确的 p35S::GmcpSecA 和 pGmcp-
SecA::GUS 转化子分别转入农杆菌 GV3101 中, 经
卡那霉素、硫酸庆大霉素和利福平筛选阳性转化
子, 再经过菌裂解 PCR 及质粒 DNA 酶切进行鉴
定。利用农杆菌介导的花苞浸泡法将 p G m c p -
SecA::GUS转化子转化野生型拟南芥, 收获的种子
在含有 30 mg·L-1 潮霉素的 1/2MS培养基上进行抗
性筛选; 利用农杆菌介导的花苞浸泡法将 p35S::
GmcpSecA 转化子转化 AGY1/agy1 杂合突变体, 收
获的种子在含有 30 mg·L-1潮霉素和 40 mg·L-1卡那
霉素的 1/2MS 培养基上进行抗性筛选。抗性植株
转土培养后进行分子检测和鉴定。
大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101感受态细胞
的制备与转化采用氯化钙法, 转化分别采用热激法和
冻融法, 药品的配置及具体操作步骤参考《分子克
隆实验指南》(第三版) (Sambrook和Russell 2002)。
提取上述抗性拟南芥的基因组 DNA, 基因组
DNA 的提取参考《分子克隆实验指南》(第三版)
(Sambrook和Russell 2002)方法进行。用GmcpSecA
启动子的特异性引物检测野生型拟南芥中外源片段
的插入情况; 用GmcpSecA目的基因的特异性引物
检测agy1突变体拟南芥中外源片段的插入情况, 用
T-DNA边界引物和AtcpSecA基因的特异性引物检
测 agy1 突变体的纯合情况。
分别取一周苗、成熟莲座叶和成熟苗的花序
和种荚进行GUS组织化学染色, GUS组织化学染色
方法参照Blume和Grienrson (1997)的方法进行, 染
色时间为 6 h, 将植物的染色结果用 EPSON PER-
FECTION 1260 型扫描仪扫描成照片保存。
分别选取一个月苗龄的野生型拟南芥、AGY1/
agy1 杂合体拟南芥和 agy1 纯合突变体背景下转
35S::GmcpSecA的拟南芥的叶片, agy1纯合突变体
拟南芥, 按照上述方法提取总 RNA, 定量, 进行反
转录。以拟南芥 Tip41-like 基因为RT-PCR反应的
内标, 内标引物为 Tip41-like-F (5-GAAATTCAG-
GAGCAAGCCGTCTCAG-3)和 Tip41-like-R (5-
ATCAACTCTCAGCCAAAATCGCAAG-3), 扩增目
的片段长度 331 bp; GmcpSecA 基因的特异引物为
GmcpSecA-3 (5-TGATGCCAAGAGTTGTTAA-
ACCATCTG-3)和 GmcpSecA-4 (5-TAGGT-
CTTCAACTCTGAACGCTTGC-3), 扩增目的片段
长度 524 bp; AtcpSecA-1 (5-CGCATCCATC-
GTCGCATCCGT-3)和 AtcpSecA-2 (5-CGAGCT-
CCTCAACACTCGTGGC-3)扩增目的片段长度700
bp。半定量 RT-PCR 反应程序为: 94 ℃变性 30 s,
56 ℃复性 30 s, 72 ℃延伸 1 min, 30 个循环; 72 ℃
延伸 10 min。本研究中所有 RT-PCR 结果均经过
3 次自 RNA 提取开始独立的重复实验, 结果一致。
实验结果
1 GmcpSecA基因 cDNA序列克隆与分析
以拟南芥 cpSecA基因的CDS为探针, 对大豆
EST序列数据库进行筛选, 根据EST拼接获得的基
因序列信息设计双引物, 利用 RT-PCR 方法, 克隆
得到特异扩增产物并进行序列测定, 序列测定结果
与 EST 拼接结果完全一致。
序列分析表明, 所克隆的cDNA序列包含完整
的 CDS序列以及部分 5- 和 3-UTR, 其 3 045 bp开
放阅读框(open reading frame, ORF)编码一个 1 014
个氨基酸的蛋白。它与其他高等植物如豌豆
(PsSecA)、拟南芥(AtSecA)、菠菜(SoSecA)的同
源性分别达到 90%、80%、78%, 与原核生物大
肠杆菌(EcSecA)的同源性达到了 39%, 与藻类的
植物生理学报5 2
SecA也具有很高的同源性。在这些同源序列的起
始区域有很高的保守性, 所有序列的ATP高亲和结
构域和 ATP 低亲和结构域也相当保守(Mitchell 和
Oliver 1993)。高等植物 SecA 的 N- 端有一段转运
肽序列, 负责引导前体蛋白通过不同的途径进入类
囊体腔, 完成转运后被类囊体腔中的加工肽酶所剪
切(Nohara 等 1995)。SignalP3.0 (http://www.cbs.
dtu.dk/services/ChloroP)预测 GmcpSecA的前 62 个
氨基酸是它的转运肽序列(图1), 这与拟南芥和豌豆
中的情况类似, 拟南芥和豌豆的转运肽剪切位点在
图 1 GmcpSecA以及同源基因的多重序列比对
Fig.1 Multiple sequence alignment and structural analysis of GmcpSecA and its homologues
A 和 B 代表 ATP 高亲和结构域; C 和 D 代表 ATP 低亲和结构域; 向下的箭头代表推测的 GmcpSecA 基因转运肽的剪切位点。
第 61 和第 62 个氨基酸之间。
2 大豆中GmcpSecA基因的器官表达特点
利用半定量RT-PCR的方法来研究GmcpSecA
基因在大豆不同器官中的表达, 结果如图 2 所示。
GmcpSecA 基因在子叶、叶片中有较强的表达, 在
花和幼嫩种荚中有较弱的表达, 而在根和茎中几乎
没有表达。
3 GmcpSecA 基因和启动子序列克隆及融合基因
表达载体的构建
我们根据获得的大豆GmcpSecA基因启动子的
序列信息, 设计克隆引物。提取大豆的基因组
DNA, 用启动子特异性引物进行PCR扩增, 得到大
豆GmcpSecA基因启动子的克隆。以大豆cDNA为
模板, 用 GmcpSecA 基因特异性引物进行 PCR, 得
到大豆GmcpSecA基因的克隆。将所克隆的1.5 kb
的 GmcpSecA 基因启动子替换植物双元表达载体
pCAMBIA1301 上的 35S 启动子, 构建 GmcpSecA::
GUS融合基因。GmcpSecA::GUS融合基因序列经
序列测定结果正确。该载体带有潮霉素筛选标记,
用于转化过程中转基因植株的筛选。将此表达载
党利洁等: 大豆 GmcpSecA 基因的克隆及表达特异性 5 3
体命名为 pGmcpSecA::GUS (图 3-A)。以同样的方
法将克隆到的3 kb的GmcpSecA基因替换植物双元
表达载体 pCAMBIA1301上的GUS基因序列, 构建
35S::GmcpSecA融合基因, 并将此表达载体命名为
p35S::GmcpSecA (图 3-B)。
4 转基因植株的获得
采用农杆菌介导的花苞浸泡法(Clough和 Bent
1998), 以 pGmcpSecA::GUS 转化野生型拟南芥, 收
获的种子经过30 mg·L-1潮霉素抗性筛选; 利用农杆
菌介导的花苞浸泡法以 p35S::GmcpSecA 转化
AGY1/agy1 杂合体拟南芥, 收获的种子在含有 30
mg·L-1 潮霉素和 40 mg·L-1 的 1/2MS 培养基上进行
抗性筛选。抗性植株转土培养。提取这些抗性植
株的基因组DNA, 分别用GmcpSecA的启动子和基
因特异性引物进行PCR检测, 扩增产物经琼脂糖凝
胶电泳分析(图4-A、B), 证明外源基因已经整合到
拟南芥基因组中, 所获得的抗性植株为转化株。
5 GmcpSecA::GUS在转基因拟南芥中的表达特性
为了研究GmcpSecA在转基因拟南芥中的表达
模式, 利用GUS组织化学染色方法, 对GmcpSecA::
GUS转基因拟南芥中GUS报告基因的表达进行了
分析。分别选取一周苗、成熟莲座叶、花序和
种荚进行 G U S 染色。染色结果 ( 图 5 ) 表明 :
GmcpSecA::GUS 转基因拟南芥在 16 h光照 /8 h黑
暗的培养条件下, 在子叶、叶片、下胚轴、莲座
叶以及茎生叶等绿色组织中都有很强的GUS活性,
而在根、花瓣和种荚等非绿色组织中没有GUS活
性。经基因组检测共获得 12 株转基因拟南芥, 其
中经 GUS 组织化学染色, 有 7 株 GUS 染色明显。
6 SecA 的功能回补
为进一步研究GmcpSecA基因在拟南芥中的作
用, 利用农杆菌介导的遗传转化方法将 3 5 S : :
图 2 GmcpSecA 基因在大豆不同器官中的表达
Fig.2 Expression levels of GmcpSecA in different soybean organs
子叶取自 V 2 时期的大豆; 根、茎和叶取自 V 5 时期的大豆; 花(包括萼片)取自 R 2 时期的大豆; 种荚取自 R 3 时期的大豆。
G m 1 8 S RNA 作为内标。
图 3 植物表达载体基本结构示意图
Fig.3 Schematic structure of the plant expression vector pGmcpSecA::GUS
A: pGmcpSecA::GUS 结构示意图; B: p35S::GmcpSecA 结构示意图。TB (L)和 TB (R)分别表示 T-DNA 的左、右边界。
植物生理学报5 4
GmcpSecA融合基因转化AGY1/agy1杂合体拟南芥,
收获的种子经 30 mg·L-1潮霉素和 40 mg·L-1卡那霉
素的抗性筛选, 发现在含有 30 mg·L-1 潮霉素和 40
mg·L-1卡那霉素的1/2MS培养基上生长的抗性苗全
部都是绿色或者黄绿色, 而没有白化的幼苗, 将抗
性苗移土, 这些抗性苗都能在土里生长。虽然与野
生型相比抗性苗表现出明显的生长迟滞, 叶片呈黄
绿色(图 6-C), 但是能够正常开花结实。通过半定
量RT-PCR进一步验证, 这些抗性苗确实是在agy1
纯合背景下表达了 GmcpSecA 基因(图 6-D)。
讨　　论
核编码的叶绿体蛋白输入类囊体膜和类囊体
腔主要有 4种途径, 其中类囊体腔蛋白的转运通过
Sec 和 Tat 两途径实现。SecA 是类囊体腔蛋白转
运途径的Sec途径中的重要组分(Di Cola等2005)。
叶绿体 cpSecA 参与前体蛋白到类囊体腔的转运。
SecA 参与转运的囊腔蛋白是光系统 I 和 II 的重要
组分(Keegstra和Cline 1999), 这些类囊体腔蛋白包
括质体蓝素(plastocyanin)、光系统 II 的放氧复合
体(oxygen-evolving complex of photosystem II)的 33
kDa 多肽OEC33、光系统 I复合物 F亚基 PSI-F (F
subunit of photosystem I)和细胞色素 f (cytochrome
f)等。大豆是重要的经济作物, 是人类主要植物性
图 4 转基因拟南芥基因组 PCR 检测
Fig.4 Identification of the transgenic plants
A: GmcpSecA::GUS 转基因拟南芥基因组 PCR 检测。泳道 M: 2K plus Marker; 泳道 1~12: GmcpSecA::GUS 转基因拟南芥基因
组 DNA 为模版的 PCR 产物; WT: 用野生型拟南芥的基因组 DNA 为模板的负对照; +: GmcpSecA::GUS 质粒为模板的 PCR 的正对
照。 B: 35S::GmcpSecA 转基因拟南芥基因组 PCR 检测。泳道 M: 2K plus Marker; 泳道 1~6: 35S::GmcpSecA 转基因拟南芥基因组
DNA 为模版的 PCR 产物; 7: 拟南芥 agy1 突变体基因组 DNA 为模版的 PCR 产物; 8: 用野生型拟南芥的基因组 DNA 为模板的负对照;
9 (上、中): H2O 为模板的 PCR 的负对照; 9 (下): 35S::GmcpSecA 质粒为模板的 PCR 的正对照; 10: H2O 为模板的 PCR 的负对照。
蛋白质来源之一, 又是重要的家畜饲料和许多工业
的原料, 在医学上也有很大价值。深入了解大豆叶
绿体发育的特点, 能够通过调控叶片的光合效率和
光合功能以期为提高大豆产量提供理论基础。
前人的研究表明 Sec 系统是一个进化上十分
保守的叶绿体蛋白转运机制, 从细菌到藻类到高等
植物都具有很高的保守性(Liu 等 2010)。cpSecA
的序列比对表明SecA序列在高等植物中具有高度
的保守性, 推测 SecA 在不同植物中的功能具有很
高的保守性, 那么GmcpSecA也许具有与AtcpSecA
类似的功能和表达特点。半定量 RT-PCR 检测大
豆GmcpSecA器官表达模式的结果是GmcpSecA在
子叶、花和种荚这些绿色组织中有表达(图 1), 转
基因拟南芥的GUS染色结果证明了我们克隆到的
GmcpSecA基因启动子片段具有启动转录的活性, 驱
动GmcpSecA基因在拟南芥的绿色组织中特异表达
(图 5), 前期的研究中发现AtcpSecA的表达也具有
绿色组织特异性(李金萍等 2009)。这些结果初步
验证了 SecA 在大豆和拟南芥中功能的保守性, 同
时也说明了 GmcpSecA 在大豆的叶绿体和叶片的
正常发育过程中可能起到了重要的作用。
我们前期的研究证明拟南芥突变体agy1由于
T-DNA插入 AtcpSecA 基因造成叶绿体发育受阻、
党利洁等: 大豆 GmcpSecA 基因的克隆及表达特异性 5 5
图 5 不同苗龄中 GmcpSecA::GUS 转基因拟南芥的 GUS 染色
Fig.5 GUS expression of GmcpSecA::GUS recombinant transgene in the developing plants
A: 一周苗; B: 成熟莲座叶; C: 花序和种荚。
叶片呈黄白色(马媛媛 2006), 通过将构建 35S::
GmcpSecA 转化 AGY1/agy1 杂合体拟南芥, 转基因
幼苗的叶片呈黄绿色(图6-C), 能部分地进行光合自
养并正常开花结实, 能够完成其生活史, 表明
GmcpSecA基因部分地回补了agy1的生长缺陷。半
定量 RT-PCR 也表明回补了的 agy1 体内确实表达
了GmcpSecA, 而没有AtcpSecA的表达(图6-D)。这
些结果充分说明了GmcpSecA基因在拟南芥agy1中
能够部分代替AtcpSecA基因发挥作用, 参与叶绿体
功能的正常发挥, 回补拟南芥 agy1 由于 AtcpSecA
被破坏造成的生长缺陷。但不管从回补幼苗的表
型还是RT-PCR的结果都可以看出, 转基因幼苗并
没有被回补到野生型的程度, 这可能是因为转基因
幼苗里GmcpSecA的表达水平低于野生型中AtcpSecA
的表达水平。这些结果说明了拟南芥和大豆中
SecA 的功能虽然相似, 但同时又有细微的差异。
那么GmcpSecA是否能够完全回补agy1由于cpSecA
被破坏造成的生长缺陷？GmcpSecA基因在大豆叶
绿体发育过程中发挥功能的详细分子机制是怎样
的？这些问题有待进一步的实验来探索。
图 6 SecA功能回补
Fig.6 Complementation of agy1 with GmcpSecA
A: 25 d 苗龄的野生型拟南芥; B: 25 d 苗龄的 agy1; C: 30 d 苗龄的野生型拟南芥和被回补的 agy1 (左为野生型拟南芥; 右为回补
的 agy1 ) ; D: 半定量 RT-PCR 分别检测野生型拟南芥、agy1 纯合体、AGY1 /agy1 杂合体和被回补的 agy1 拟南芥中 AtcpSecA 和
GmcpSecA 的表达。泳道 1: 野生型拟南芥 cDNA 为模板的 PCR 产物; 泳道 2: AGY1/agy1 杂合体拟南芥 cDNA 为模板的 PCR 产物;
泳道 3: agy1 纯合体拟南芥 cDNA 为模板的 PCR 产物; 泳道 4: 被回补的 agy1 cDNA 为模板的 PCR 产物。
植物生理学报5 6
参考文献
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