全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 6 期, 2010 年 6 月 537
收稿 2010-01-11 修定 　2010-04-01
资助 国家自然科学基金(30971725, 30671214)。
* 通讯作者(E-mail: zhaohj303@163.com; Tel: 0371-63555319)。
水杨酸对高温强光胁迫下小麦叶绿体基因 psbA表达的调节
赵鹏飞, 王林华, 赵会杰*, 梁书荣, 吕淑敏, 曲小菲, 汪月霞
河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002
提要: 以0.1、0.3和0.5 mmol.L-1的水杨酸预处理灌浆期的小麦叶片, 测定在高温强光胁迫下小麦叶绿体基因psbA表达、D1
蛋白含量和PSII功能。结果表明, 叶面喷施SA不仅可减缓高温强光对psbA表达的抑制, 而且可促进胁迫后在适宜光温条
件下恢复表达的水平。
关键词: 小麦; 水杨酸; 高温强光; psbA基因; 光系统 II
Regulation of Exogenous Salicylic Acid on Expression of Chloroplast Gene
psbA in Wheat (Triticum aestivum L.) Leaves under Heat and High Irradiance
Stress
ZHAO Peng-Fei, WANG Lin-Hua, ZHAO Hui-Jie*, LIANG Shu-Rong, LÜ Shu-Min, QU Xiao-Fei, WANG Yue-Xia
College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Wheat leaves were sprayed with salicylic acid (SA) solution of three concentrations (0.1, 0.3, 0.5
mmol·L-1) at grain-filling stage. The expression of chloroplast gene psbA, content of D1 protein and perfor-
mance of photosystem II (PS II) under heat and high irradiance stress were investigated. The results showed
that pretreatment with SA not only retarded inhibition to psbA expression caused by heat and high irradiance
stress, but also promoted restoration of psbA expression level after stress under proper temperature and light
condition.
Key words: wheat; salicylic acid; heat and high irradiance stress; psbA; photosystem II
一般来说, 在植物的光合机构中, 光系统 II
(PSII)反应中心是高温、干旱等多种逆境伤害的
关键部位(Allakhverdiev和Murata 2004), 它受损伤
的程度取决于逆境胁迫期间破坏和修复的平衡
(Adir 等 2003; Murata 等 2007; Mohanty 等 2007)。
PSII是1个多亚基蛋白复合体, 由25种以上亚基构
成, 其中由叶绿体基因 psbA编码的D1蛋白是许多
逆境破坏的靶位, PSII 的修复需要 D1 蛋白的快速
周转(Yamamoto 等 2008)。强光胁迫下 D1 蛋白的
周转途径已基本清楚。首先是受损D1蛋白在蛋白
激酶的作用下, 发生磷酸化作用, 然后磷酸化的蛋
白质向非垛叠区的基质类囊体转移, 进而发生脱磷
酸化和降解, 最后受损蛋白被新合成 D1 蛋白取
替。这些说明, D1蛋白周转的速率主要取决于D1
蛋白的可逆磷酸化和D1蛋白的合成速率2个方面
(Aro等 2005; Lindahl 等 2000)。Yoshioka 等(2006)
报道, 高温处理菠菜类囊体后, D1蛋白即降解为23
kDa 和 9 kDa 片段, 其降解模式与 PSII受体侧光抑
制相似。受破坏的D1蛋白如不能及时被新的拷贝
取代, 就会抑制 PSII的功能。Liu等(2006)的研究表
明, 在水分胁迫下, 小麦的 psbA 基因表达水平下降,
抗旱品种的下降幅度小于干旱敏感品种。Grennan
和 Ort (2007)认为低温下番茄 D1 蛋白减少主要是
由于翻译过程中肽链延长受到干扰。水杨酸
(salicylic acid, SA)是植物体内诱导防御机制的重要
信号分子(Halim等 2006)。Dat 等(1998)首次报道
了喷施SA可以改善芥菜的抗热性。随后, 外源SA
对植物抗热性的诱导作用在烟草(Nicotiana tabacum,
Dat 等 2000)、豌豆(Pisum sativum, Pan 等 2006)、
黄瓜(Cucumis sativus, Shi等 2006)、拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana, Larkindale和Knight 2002)等植物中
得到证实。我们实验室初步研究了外源SA对高温
强光下小麦光合机构的保护效应, 发现 SA 预处理
小麦叶片, 可以维持较高的 D1 蛋白含量和较强的
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PSII 功能(马培芳等 2008)。本文研究了高温和强
光协同胁迫下psbA基因表达及外源水杨酸的调节
作用, 为进一步了解高温强光损伤光合机构的机制
和设计防护措施时参考。
材料与方法
以小麦(Triticum aestivum L.)品种 ‘ 豫农 949’
为试验材料。用盆栽方法培养, 盆高 40 cm, 内径
40 cm, 盆内装入 20 kg 本校科教园区的耕层潮土。
10月15日播种, 播种后将盆埋入试验田土中, 出苗
后每盆留苗 3 株, 共计 240 盆。按常规措施管理。
于灌浆期(开花后 20 d)将试验材料分为 4 组, 进行
不同的预处理。叶面分别喷施浓度为 0.1、0.3 和
0.5 mmol·L-1 的水杨酸(记作 SA1 、SA2 和 SA3),
以叶面喷水作为对照。3 d后将盆带回实验室进行
不同的温度和光照处理。人工气候室设 2 种温度
和光强, 分别为适温中光[25 ℃, PFD (量子通量密
度)为 600 μmol·m-2·s-1]和高温强光(36 ℃, PFD 为
1 800 μmol·m-2·s-1)。
照光前各处理先经 12 h 的暗适应, 高照度光
由 1 000 W 钨灯提供。在人工气候室中设置一铁
架, 钨灯与材料之间放置 10 cm厚的有机玻璃流动
水槽, 以避免光下温度过高, 通过调节材料与光源
的距离, 控制小麦旗叶接收的光强。于高温强光处
理前和处理后 1 h、2 h 取旗叶。高温强光 2 h 处
理的植株置于适温中光下恢复3 h, 再次取样测定。
每个处理重复 5 次, 每个重复取 3 株, 所取的旗叶
一部分用于荧光参数和光合速率的测定, 另一部分
立即保存到液氮中备用。
采集的旗叶用液氮研磨, 参照Trizol试剂盒(购
自 Invitrogen公司)说明书提取 RNA, 经由 1% 琼脂
糖凝胶电泳鉴定 RNA 的质量, 260/280 nm吸光值
测定 RNA 浓度和纯度。质量检测合格后的 RNA
用于其后的实验操作。用 Fermentas 反转录试剂
盒反转录合成 cDNA第一链, cDNA合成总反应体
系为 20 μL , 含有 2 μL总 RNA (1 μg·μL-1), 9 μL 无
RNA酶双蒸水, 1 μL随机六聚体引物(random hexamer
primer), 混匀后于 65 ℃下放置 5 min 后, 迅速置于
冰上冷却, 再加入 2 μL dNTP mix (10 mmol·L-1), 4
μL RT缓冲液, 1 μL RNA酶抑制剂(20 U·μL-1), 1 μL
M-MuLV 反转录酶(200 U·μL-1)。混匀, 短暂离心,
于25 ℃下反应5 min, 42 ℃下反应1 h, 70 ℃下反应
5 min, 终止反应。RT产物立即进行 PCR 或于-20
℃保存。
为了做到结果标准化, 以18S rRNA基因(Gen-
Bank 登录号为 AJ272181)的相对丰度作为内参。
内参及 psbA 基因(GenBank登录号为NC002762)
引物由上海生工生物工程公司合成, 名称与序列分
别为: 18S rRNA-f: 5 CAAGCCATCGCTCTGGAT-
ACATT 3; 18S rRNA-r: 5 CCTGTATTGCCTCAAA-
CTTCC 3; psbA-f: 5 ACTAGCACTGAAAATCGTCT
3; psbA-r: 5 TTACGTTCGTGCATTACTTC 3。
以cDNA为模板用上述引物进行PCR, 扩增程序为
94 ℃预变性 3 min; 94 ℃变性 30 s, 60 ℃退火 30 s,
72 ℃延伸1 min, 30 个循环; 72 ℃延伸10 min, 4 ℃
保存。18S rRNA 基因和 psbA 基因转录本扩增的
长度分别为 658 bp 和 941 bp。PCR 产物用 1% 琼
脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭(EB)染色, 拍照, 用UVBand
紫外-可见分光光度计计算机软件对电泳条带进行
灰度分析。
测定类囊体膜 D1蛋白含量时, 参照郭军伟等
(2006)、Tripathy 和 Mohanty (1980)文中的方法提
取不同处理叶片的类囊体膜。得到的样品按
Arnon (1949)的方法测定叶绿素含量, 然后储存于
液氮中备用。SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-
PAGE)和Western Blotting分析参照杜林方等(1995)
和Rintamäki等(1996)文中的方法进行, SDS-PAGE
采用 12% 含 6 mol·L-1 尿素的分离胶(pH 8.8)和 5%
浓缩胶(pH 6.8)。Western Blotting 分析的一抗为
叶绿体D1蛋白多克隆抗体(Agrisera公司提供), 二
抗为碱性磷酶标记抗体IgG (H+L) (中杉金桥公司)。
显色系统为 BCIP/NBT 显色浓缩液。图片采用凝
胶成像系统照相并进行定量分析。
用FMS-2型脉冲调制式叶绿素荧光分析仪(英
国Hansatech公司)测定叶绿素荧光参数, 测定前叶
片暗适应 15 min, 作用光强度为 400 μmol·m-2·s-1,
饱和脉冲光强度为 8 000 μmol·m-2·s-1。Fv/Fm (PSII
潜在光化学效率)=(Fm-Fo)/Fm, 其中, Fo为初始荧光,
Fm 为最大荧光, Fv 为可变荧光。Φ PSII (PSII 实际
光化学效率)＝(Fm-Ft)/Fm, 其中Ft为稳态荧光, Fm
为稳态最大荧光。净光合速率(Pn)用 Chlorolab-2
氧电极系统(英国 Hansatech 公司)测定。
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以 EXCEL 处理数据, 结果以 5 次测定的平均
值 ± 标准差(mean±SD)表示。
结果与讨论
1 水杨酸对小麦叶绿体基因 psbA表达的影响
由图1可以看出, 高温强光对psbA的表达有明
显的抑制, SA 预处理可以促进此基因表达。分析
各处理的相对表达量(资料未列出), 适温中光下,
SA1、SA2 和 SA3 的 psbA 表达量比 CK 分别高
29.9%、59.8% 和 42.0%; 高温强光处理 1 h 后,
SA1、SA2和SA3的psbA表达量比CK分别高47.9%、
图 1 外源水杨酸对不同光温条件下小麦叶绿体基因 psbA
表达的影响
Fig.1 Effect of exogenous SA on expression of chloroplast
gene psbA in wheat leaves under different temperature and
light conditions
A: 适温中光下 psbA 基因的 RT-PCR; B: 高温强光 1 h 后
psbA 基因的 RT-PCR; C: 高温强光 2 h 后 psbA 基因的 RT-PCR;
D: 高温强光 2 h, 然后适温中光下恢复 3 h 后 psbA 基因的 RT-
P C R 。
图 2 外源水杨酸对不同光温条件下小麦叶绿体 D1 蛋白的
影响
Fig.2 Influence of exogenous SA on D1 protein in wheat
chloroplasts under different temperature and light conditions
A: 适温中光; B: 高温强光 2 h 后。
图 3 外源水杨酸对不同光温条件下小麦叶片 Fv/Fm、
ΦPSII 和净光合速率(Pn)的影响
Fig.3 Influence of exogenous SA on Fv/Fm、ΦPSII and net
photosynthetic rate (Pn) in wheat leaves under different
temperature and light conditions
0: 适温中光处理(对照); 1: 高温强光 1 h 后; 2: 高温强光 2 h
后; 恢复: 高温强光 2 h, 然后适温中光下恢复 3 h 后。
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253.4%和102.6%; 高温强光处理2 h后, SA1、SA2
和SA3的psbA表达量比CK分别高113.5%、306.2%
和 179%; 高温强光 2 h 后将各处理材料置于适温
中光下 3 h 后, SA1、SA2 和 SA3 的 psbA 表达量
比 CK 分别高 428.7%、752% 和 468.2%。这些表
明外源SA不仅可以减缓高温强光对psbA基因转录
的抑制, 而且可促进胁迫后适宜条件下基因表达的
恢复。其中, 以 0.3 mmol·L-1 SA 的效果最好。
2 水杨酸对小麦叶绿体D1蛋白含量的影响
图2显示, 在适温中光条件下, 各处理的D1蛋
白含量差异不大。高温强光处理 2 h 后, 各处理的
D1 蛋白含量均明显下降, 但 SA1、SA2、SA3 的
D1蛋白含量均高于对照, 表明外源SA预处理可有
效抑制高温强光导致小麦叶片中D1蛋白含量的减
少。其中以喷施浓度为 0.1 mmol·L-1 SA 的效果较
好。D1 蛋白的含量高低, 一方面取决于其合成速
率, 另一方面取决于其降解速率。要想全面了解
D1 蛋白变化的原因, 尚需进一步研究。
3 水杨酸对小麦叶片 Fv/Fm、Φ PSII和 Pn的影响
图 3 显示, 高温强光导致 Fv/Fm、ΦPSII 和净光
合速率(Pn)持续降低, 但这种胁迫造成的伤害是可
逆的, 小麦叶片经高温强光 2 h 后, 再置于适温中
光下, 光合功能可以部分恢复。与对照相比, 水杨
酸预处理可以减缓高温强光下Fv/Fm、ΦPSII和Pn的
下降, 并可促进回到适温中光下光合功能的恢复。
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