全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (9): 1347~1352　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.1022 1347
收稿 2014-06-26　　修定 2014-08-18
资助 国家自然科学基金(30971767)、河北省杰出青年科学
基金(C2014205165)和教育部博士点基金博导类项目
(20131303110002)。
* 通讯作者(E-mail: cjzhou@hebtu.edu.cn; Tel: 0311-
80787527)。
小麦叶片衰老相关基因TaMYBAS2-1的克隆及功能分析
赵明明, 李鸣, 宋秋航, 王耕, 周春江*
河北师范大学生命科学学院, 石家庄050024
摘要: MYB类转录因子在调控植物生长发育、响应逆境胁迫等方面发挥重要作用。根据基因芯片数据, 我们从小麦的衰
老旗叶组织中扩增得到了与衰老相关的MYB转录因子基因TaMYBAS2-1, 并初步研究了其功能。半定量RT-PCR结果表明,
TaMYBAS2-1在小麦旗叶自然衰老过程中呈上调表达趋势, 与GFP的融合蛋白主要定位于细胞核中, 并且具有转录激活活
性。我们扩增得到了长度为1 561 bp的启动子序列, 构建了TaMYBAS2-1promoter:GUS的表达载体, 并转化模式植物拟南芥。在
转基因植株中, 衰老叶片的GUS染色更明显。以上的初步研究结果表明, 该基因可能在叶片衰老进程调控中发挥作用。
关键词: 小麦; 衰老; 转录因子; MYB
Cloning and Functional Analysis of Senescence-Associated Gene TaMYBAS2-1
in Wheat Leaves
ZHAO Ming-Ming, LI Ming, SONG Qiu-Hang, WANG Geng, ZHOU Chun-Jiang*
College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China
Abstract: MYB transcription factors play an important role in regulating plant growth and response to various
stresses. Based on microarray data, TaMYBAS2-1, encoding an MYB transcription factor, was identified from
senescent flag leaves of wheat. Semi-quantitative RT-PCR showed that TaMYBAS2-1 was up-regulated in natu-
ral senescence process. Sub-cellular localization analyses indicated that TaMYBAS2-1:GFP fusion protein
mainly localized in nucleus. TaMYBAS2-1 showed transcription activation activity in yeast cells. A 1 561 bp of
TaMYBAS2-1 promoter sequence was fused to GUS and was introduced to Arabidopsis. GUS staining assay in-
dicated that old leaves showed higher GUS activity than young leaves. These preliminary data indicated that
TaMYBAS2-1 might play a role in leaf senescence regulation.
Key words: wheat; senescence; transcription factor; MYB
叶片是光合作用的主要器官, 对小麦产量有
重要影响。小麦籽粒产量主要来源于旗叶的同化
产物。研究表明, 适当延缓旗叶衰老可以提高小
麦的产量。通过调控衰老进程, 获得延缓旗叶早
衰的新品种是当今小麦衰老研究的重要方向(Wu
等2012)。植物叶片衰老是一个高度复杂的过程,
启动和进程调控受到诸多内外因素的影响(Zhang
和Zhou 2013)。研究表明, 多个转录因子家族基因参
与了叶片衰老调控(Guo和Gan 2006; Li等2012)。
MYB转录因子是重要的一类转录因子家族,
参与植物生长发育、逆境胁迫反应、激素信号调
控等多种生理过程(Bedon等2010)。植物MYB类
蛋白包含1~3个不完全的重复, 每个重复都编码3
个螺旋, 当与DNA结合后第二和第三螺旋形成一
个螺旋-转角-螺旋(HLH)的结构。根据重复次数的
不同, 植物MYB类转录因子可以分为1R-MYB、
R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB四个亚族。其
中, R2R3-MYB是数量最多、功能最多样化的亚
族, 在调节花青素合成(Piazza等2002)、参与赤霉
素(gibberellic acid, GA)、脱落酸(abscisic acid,
ABA)和水杨酸(salicylic acid, SA)等激素的信号通
路方面发挥着重要的作用(Yuan等2013)。例如, 拟
南芥AtMYB44能够与ABA的受体相互作用, 在
ABA信号通路发挥作用 (Li等2014) ; 水稻Os-
MYB48-1能够增强植物的抗旱性和耐盐性(Xiong
等2014)。
植物生理学报1348
小麦MYB基因的报道较少, 有研究表明, 在小
麦中分离得到23个cDNA片段, 其中有6个编码小
麦MYB基因(TaMyb1~6)。它们分布在不同组织中,
在激素诱导下的表达模式各不相同 , 是典型的
R2R3-MYB类转录因子, 可能与聚乙二醇(polyeth-
ylene glycol, PEG)、GA信号有关(Chen等2005)。
TaMYB13基因与ABA信号转导途径有关, 参与了
植物响应高盐、干旱、ABA胁迫(Xue等2011)。
本研究利用实验室前期的小麦旗叶基因芯片
数据, 选取其中一段EST序列, 利用NCBI数据库,
经电子克隆、拼接获得其开放阅读框(open reading
frame, ORF)序列和部分启动子序列, 将其命名为
TaMYBAS2-1。该基因的转录水平在小麦旗叶自然
衰老过程中呈上调表达趋势, 与GFP的融合蛋白主
要定位于细胞核中, 并且具有转录激活活性。在
TaMYBAS2-1promoter:GUS转基因植株中, 衰老叶片染
色更显著。我们的初步研究结果表明该基因可能
在小麦叶片衰老进程调控中发挥作用。
材料与方法
1 材料
采用优质小麦(Triticum aestivum L.)品种‘师栾
02-1’, 拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为Col-0生态
型, 烟草为本氏烟(Nicotiana benthamiana Domin)。
大肠杆菌菌株X-blue, 酵母菌株AH109, 质粒载体
pMD18-T、pEGAD-GFP、pGBKT7、pCAM-
BIA1300等为本实验室保存。
2 方法
2.1 衰老相关MYB转录因子EST的获得
根据本实验室前期完成的小麦旗叶4个不同
发育时期的基因芯片数据分析结果, 选取在衰老
过程中表达量呈上升趋势的MYB类转录因子EST
序列gb: BT009536.1。搜索NCBI中的小麦EST数
据库, 通过比对、电子克隆, 得到该EST序列编码
基因全长cDNA序列。
2.2 RNA的提取及反转录
小麦不同发育时期旗叶的RNA采用Invitrogen
公司的TRIzol进行提取, 经1.2%琼脂糖电泳检测提
取质量, Nanodrop 2000核酸定量分析仪测定浓
度。反转录cDNA步骤按照Promega公司M-MLV
反转录试剂盒说明操作。
2.3 衰老相关MYB基因的克隆、序列特征及表达
分析
根据电子克隆获得的全长cDNA序列设计
ORF扩增引物P211-F和P212-R, 以cDNA为模板进
行PCR, 产物回收后连接至T载体上并测序。用
DNAMAN软件进行序列特征分析。以4个不同发
育时期小麦cDNA为模板, P516-F和P517-R为引物
扩增该基因片段, P187-F和P188-R为引物扩增内参
β-actin片段, 采用半定量RT-PCR方法检测该基因
在小麦旗叶发育过程中的表达情况。引物序列见
表1。
2.4 亚细胞定位
以引物P294-F和P249-R (表1)扩增cDNA, 将
该基因ORF序列连接到pEGAD-GFP载体上, 构建
亚细胞定位载体。采用注射烟草瞬时表达的方法,
在激光共聚焦扫描显微镜下观察荧光的分布情况
(周善跃2009)。
2.5 转录激活活性的测定
以引物P294-F和P249-R (表1)扩增cDNA, 将
该基因连接到pGBKT7载体上, 构建转录激活实验
载体, 提取质粒。将该质粒与pGBKT7 (阴性对照)
和pGBKT7-TaNAC6 (阳性对照)等质粒转化酵母
AH109, 涂布在SD/His-Ade-Trp-三缺固体平板上,
30 ℃恒温培养2~3 d后观察。
2.6 TaMYBAS2-1promoter:GUS表达载体构建及转基
因植株分析
根据NCBI数据库中小麦基因组DNA序列比
对的结果, 以引物P506-F和P507-R (表1)扩增DNA,
获得部分启动子序列。采用引物P565-F和P566-R
(表1)扩增DNA, 将启动子序列连接到pCAM-
BIA1300载体上, 构建TaMYBAS2-1promoter:GUS的表
达载体, 采用浸花法转化野生型拟南芥Col-0生态
型(Clough和Bent 1998), 根据抗生素筛选和PCR鉴
定结果, 将阳性植株进行GUS染色(Jefferson等
1987)。
实验结果
1 TaMYBAS2-1基因序列特征分析
根据电子克隆的初步结果, 用引物P211-F和
P212-R从小麦cDNA中扩增出一条清晰的PCR产
物, 测序结果表明, 该片段长度为519 bp, 包含起始
赵明明等: 小麦叶片衰老相关基因TaMYBS2-1的克隆及功能分析 1349
密码子和终止密码子, 可以编码172个氨基酸。在
NCBI数据库中进行比对, 发现与水稻中同源基因
OsMYBAS2-1的相似性最高, 因此命名为TaMY-
BAS2-1。该基因具有完整的MYB结构域, 进化树
分析结果表明, 与水稻、玉米中的MYB聚为一类,
而和拟南芥MYB亲缘关系较远(图1)。序列比对结
果表明, TaMYBAS2-1具有典型的R2R3-MYB类蛋
白特征。
2 TaMYBAS2-1基因在旗叶衰老过程中的表达模式
选取田间栽培的小麦‘师栾02-1’不同发育时
期旗叶为实验材料 , 提取总RNA, 反转录得到
cDNA, 用β-actin作内参, 检测TaMYBAS2-1基因的
表达情况。结果表明, TaMYBAS2-1在所检测的4个
时期旗叶中均有表达, 随着叶片由幼嫩阶段(S1)、
成熟阶段(S2), 开始启动衰老(S3), 到衰老中期(S4),
叶片衰老特异标记基因TaSAG3表现出上调表达
(Zhao等2012), 而TaMYBAS2-1虽然在成熟叶片中
也有较高水平表达, 但在衰老中期的叶片中表达
量最高(图2)。
3 TaMYBAS2-1亚细胞定位分析
作为转录因子家族成员, TaMYBAS2-1应该
在细胞核中发挥其生物学功能。为了探讨其亚细
胞定位情况 , 将含有空载pEGAD-GFP质粒和
TaMYBAS2-1-pEGAD-GFP质粒的农杆菌用注射
法转染烟草叶片, 40 h后, 在激光共聚焦显微镜下
观察。结果表明, 空载体pEGAD-GFP在烟草叶肉
表1 本研究中用到的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 引物序列(5→3) 用途
P211-F ATGACTCCCCATGAAGAACG TaMYBAS2-1基因全长ORF扩增
P212-R TCAATAACTGGGGCCAATTC
P294-F GGAATTCATGACTCCCCATGAAGAACG TaMYBAS2-1基因亚细胞定位载体和转录激活载体构建
P249-R CGGGATCCCGTCAATAACTGGGGCCAATTC
P516-F GAATTGGCGAGCAGGAAC TaMYBAS2-1基因半定量RT-PCR
P517-R CGGTGATGGCAGCAGAG
P187-F TGCTATCCTTCGTTTGGACCTT β-actin基因半定量RT-PCR
P188-R AGCGGTTGTTGTGAGGGAGT
P366-F CGACATCCGACGATTCAAC TaSAG3基因半定量RT-PCR
P367-R TCGCACCACCATCCATTC
P506-F TTTCCGAGCCGTTTGAT TaMYBAS2-1基因启动子克隆
P507-R CGAGTTTCTTTGCCAGGTAG
P565-F GCTCTAGACCGCTTCCTTTGCTATGA 启动子:GUS载体构建
P566-R CGGGATCCCGGGTGGAACCTGAAC

图1 TaMYBAS2-1和部分其他MYB序列的进化树分析
Fig.1 Phylogenetic tree of TaMYBAS2-1 and some other MYBs
植物生理学报1350
细胞的细胞膜和细胞核上均有强烈的表达 ; 而
TaMYBAS2-1-pEGAD-GFP在烟草叶肉细胞的细
胞核上强烈表达, 在细胞膜上只能见到微弱荧光
(图3), 说明TaMYBAS2-1主要定位在细胞核中, 符
合转录因子的特性。
4 转录激活活性分析
为了验证TaMYBAS2-1是否具有转录激活活
性, 我们将TaMYBAS2-1构建到pGBKT7载体上, 与
阳性对照载体和空白对照载体分别转化入酵母
AH109菌株。结果表明, pGBKT7转化酵母后不能
在SD/His-Ade-Trp-平板上生长, 而已报道的具有转
录激活活性的pGBKT7-TaNAC6转化酵母后能够
启动His的表达, pGBKT7-TaMYBAS2-1转化酵母
后表现的结果与pGBKT7-TaNAC6的一致。同时,
图2 TaMYBAS2-1基因在小麦旗叶衰老过程中的
转录水平分析
Fig.2 Transcriptional level analyses of TaMYBAS2-1 in flag
leaves during senescence process
S1: 幼嫩叶片(叶面积为成熟叶片面积的一半); S2: 成熟叶片;
S3: 衰老早期叶片(衰老面积小于10%); S4: 衰老叶片(衰老面积约
为50%)。TaSAG3为小麦叶片衰老研究中常用的标记基因; β-actin
为内参基因。
图3 TaMYBAS2-1:GFP融合蛋白在烟草叶肉细胞中的亚细胞定位分析
Fig.3 Sub-cellular localization analyses of TaMYBAS2-1:GFP fusion protein in tobacco mesophyll cells
A: TaMYBAS2-1-pEGAD-GFP的荧光图; B: TaMYBAS2-1-pEGAD-GFP的白光透射图; C: TaMYBAS2-1-pEGAD-GFP的荧光图和透射
图的叠加图; D: pEGAD-GFP的荧光图; E: pEGAD-GFP的白光透射图; F: pEGAD-GFP的荧光图和透射图的叠加图。
含有pGBKT7-TaNAC6和pGBKT7-TaMYBAS2-1
的转化菌株可以被X-Gal染成蓝色(图4)，表明它
们都具有转录激活功能。
5 TaMYBAS2-1promoter:GUS转基因植株分析
本研究克隆了TaMYBAS2-1起始密码子上游
1 561 bp的启动子序列, 并构建了TaMYBAS2-1promoter:
GUS融合基因表达载体。通过农杆菌介导的浸花
转化法, 获得了T0代转基因植株, 再经过筛选、繁
殖, 得到T2代纯合转基因株系, 用于后续实验。对
生长30 d的拟南芥植株进行GUS染色分析, 结果显
示, TaMYBAS2-1启动子驱动的GUS在莲座叶和花
序中都有表达(图5-A和D); 转基因植株叶片气孔
赵明明等: 小麦叶片衰老相关基因TaMYBS2-1的克隆及功能分析 1351
保卫细胞中也有微弱的表达(图5-B); 新生叶片染
色较浅, 衰老的叶片染色较深, 莲座叶的着色程度
随着叶龄的增大而逐渐加深(图5-C)。
讨　　论
在植物众多转录因子中, MYB家族占据了很
大一部分, 其中R2R3-MYB类转录因子的规模最
大。拟南芥中有100多个不同的R2R3-MYB类基因
表达, 玉米中有78个, 水稻中也有80多个(Rabino-
wicz等1999; Stracke等2001; Jia等2004)。本研究通
过电子克隆的方法得到TaMYBAS2-1基因的ORF全
长序列, 共519 bp, 编码172个氨基酸, 具有明显的
MYB蛋白结构域, 与水稻中的MYBAS2-1和MYB17
相似性达75%, 是典型的R2R3-MYB类蛋白。
TaMYBAS2-1蛋白在R3区域有一段核定位信
号(nuclear localization signals, NLS), 说明TaMY-
图4 转录激活活性的分析
Fig.4 Transcriptional activation analyses
A: 转化菌株在SD/Trp-His-Ade-培养基上的生长情况; B: 转化菌株的X-Gal染色; C: 菌株分布。
图5 TaMYBAS2-1promoter:GUS转基因拟南芥的GUS染色情况
Fig.5 GUS staining of TaMYBAS2-1promoter:GUS transgenic Arabidopsis
A: 生长30 d的拟南芥植株; B: 气孔保卫细胞; C: 不同叶龄的莲座叶, 从右至左为叶龄逐渐增大; D: 花序。
植物生理学报1352
BAS2-1可能是定位在细胞核上。本研究构建了
TaMYBAS2-1-pEGAD-GFP载体, 通过注射农杆菌
浸染烟草叶片后, 在激光共聚焦显微镜下观察到,
与GFP的融合蛋白主要定位在细胞核中, 与其含有
核定位信号的结构是一致的。
根据酵母单杂交的原理, 可以利用转录自激
活载体pGBKT7来检验目的基因是否具有转录激
活活性。本研究结果显示, 将TaMYBAS2-1基因全
长与pGBKT7载体上GAL4蛋白的DNA结合域融
合, 然后将重组质粒转入酵母AH109中, 能激活
HIS3和ADE2的转录, 在SD/His-Ade-Trp-平板上正
常生长, 即该基因具有转录激活活性。
我们初步探究了TaMYBAS2-1基因在叶片衰
老进程中的表达情况, 发现TaMYBAS2-1基因在旗
叶衰老阶段表达量最高, 暗示其可能是衰老相关
基因(senescence associated gene, SAG)。通过对
TaMYBAS2-1promoter:GUS转基因植株进行分析, 发现
随着衰老程度逐渐加大, GUS染色也逐渐加深。同
时, 在气孔保卫细胞中也检测到了GUS活性, 暗示
其可能与ABA信号有关。我们已经构建了该基因
的过表达载体和RNAi载体, 转化模式植物拟南芥
和烟草, 进一步观察表型, 探讨其参与衰老调控可
能的信号途径和分子机制。
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