全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (5): 715~720　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0485 715
收稿 2014-11-04　　修定 2015-03-25
资助 新疆农业大学科学技术学院青年科研启动基金项目(2014-
KJKY005)。
* 通讯作者(E-mail: cqq0707@sina.com; Tel: 13579992731)。
干旱胁迫对转CpHRD基因烟草的影响
陈琴*, 李星星, 童婷, 谢文华, 阎晓菲, 郝欢欢
新疆农业大学科学技术学院, 乌鲁木齐830052
摘要: HRD基因是AP2/EREBP转录因子家族的一员, 过表达HRD基因可以提高水稻的水分利用效率。本文采用同源序列
克隆的方法从线果芥中克隆了CpHRD基因, 并转化野生型烟草, 测定了干旱胁迫下转CpHRD基因烟草的丙二醛、游离脯
氨酸、可溶性淀粉、可溶性糖的含量以及过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性6项生理指标; 观察了转基因烟草的形态和气
孔的变化。结果显示, 除MDA含量外, 转CpHRD基因烟草的其余5项指标均显著高于野生型烟草, 而转基因烟草的叶表面
气孔数和气孔开度均低于野生型, 说明CpHRD基因参与了植物逆境应答过程, 并可以显著提高转基因烟草的抗旱能力。
关键词: 干旱胁迫; 转基因烟草; HRD基因; 生理指标
Influence of Drought Stress on Transgenic CpHRD Gene in Tobacco
CHEN Qin*, LI Xing-Xing, TONG Ting, XIE Wen-Hua, YAN Xiao-Fei, HAO Huan-Huan
College of Science and Technology, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China
Abstract: HRD is a member of the AP2/EREBP transcription factor family, Overexpression of HRD in rice
improved its water use efficiency (WUE). A CpHRD gene derived from Conringia planisiliqua was cloned by
homology-based cloning method and transformed the tobacco (Nicotiana tabacum) leaf. The six physiological
and biochemical indicators (the contents of MDA, PRO, H2O2, soluble starch, soluble sugar, and the activities
of CAT, SOD) were measured in transgenic CpHRD tobacco under drought stress. And the changes of
morphology and porosity of transgenic tobacco were observed. The results indicated that expect the MDA
contents, the other five indicators in transgenic tobaccos were significantly higher than those in the wild type to-
bacco. The stomata number and stomata aperture of transgenic tobacco leaves were lower than those of the wild
type. These results also indicated CpHRD gene involved in abiotic stress responses and strengthen the drought
resistance of transgenic tobaccos.
Key words: drought stress; transgenic tobacco (Nicotiana tabacum); HRD genes; physiological index
干旱是世界上最严重的灾害之一, 据统计全
世界因水分胁迫所致的作物减产, 超过了其他因
素造成减产的总和(朱旗和徐吉臣2010)。植物在
漫长的进化过程中, 面对干旱、盐渍、高温以及
冷冻害等非生物胁迫的恶劣环境, 其体内形成了
各种对水分亏缺反应-伤害-修复-适应-补偿的调节
机制(党云萍等2012)。有研究表明, 可以通过植物
表观形态、生理生化指标变化及复水后的补偿能
力等来直观的反应植物的抗旱性。在干旱条件下,
植物叶片气孔关闭、气孔密度减少、萎蔫、解剖
结构也会发生相应的变化(刘红茹等2012)。植物
体内渗透调节物质不断生成并大量积累, 使细胞
浓度增大而渗透势降低, 形成一定的膨压, 从而保
证细胞的正常生理过程(包文龙等2014; 季杨等
2014; Liang等2013)。植物体内的保护酶, 如超氧
化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化
物酶(peroxidase, POD)等在水分胁迫下不断大量生
成, 以保护脂膜和敏感分子免受活性氧的伤害(王
晶懋等2012; Munné-Bosch和Alegre 2003)。植物在
干旱后复水处理, 随着复水时间的延长, 各项生理
指标逐渐恢复, 但抗旱品种的可溶性糖和脯氨酸
含量以及丙二醛含量等要先于对照恢复, 表现出
复水后较强的补偿效应(郭贤仕等2012; 李文娆等
2008)。
HRD基因是由Aarati等(2007)从拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana)突变体中获得的一个新功能基因,
研究发现, HRD基因作为AP2/EREBP家族转录因
子的成员, 过量表达, 可增加叶片横截面海绵组织
植物生理学报716
和栅栏组织, 有效提高植物的水分利用率。在埃
及车轴草(Trifolium alexandrinum)中过表达, 可降
低车轴草蒸腾速率, 降低Na+的积累, 保护光合作
用系统不受离子侵害(Abogadallah等2011)。
我实验室前期通过对6种短命植物的种子和
幼苗进行了干旱实验, 筛选出抗旱性较强的线果
芥材料(许春华等2012)。因此本研究选用线果芥
为实验材料, 从中克隆HRD基因, 转入烟草, 通过
对干旱胁迫下转CpHRD基因烟草与野生型烟草的
6项生理生化指标以及形态、气孔变化进行了综
合对比分析, 为选择抗旱育种的目的候选基因以
及揭示CpHRD基因的抗旱机理提供了依据。
材料与方法
1 材料
线果芥(Conringia planisiliqua Fisch. et Mey.)
种子采自新疆乌鲁木齐市雅玛里克山, 野生型烟
草(Nicotiana tabacum L.)种子(NC89)由本实验室保
存, 将线果芥和烟草材料种于温室, 22 ℃, 16 h·d-1
光照, 相对湿度60%培养备用。
2 试剂
质粒提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、大肠杆
菌(Escherichia coli) DH5a感受态为北京天根生化
科技有限公司产品; 限制性内切酶SalI和BamHI购
自TaKaRa试剂公司; 根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens) EHA105及植物表达载体pCAM-
BIA1301均由新疆农业大学生物技术重点实验室
提供。甲硫氨酸、四氮唑蓝、聚乙烯吡咯烷酮、
核黄素、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、茚三酮、磺基
水杨酸、蒽酮和过氧化氢等均为国产分析纯, 引物合
成、测序工作由上海生工生物工程有限公司完成。
3 方法
3.1 载体构建
以PCAMBIA1301为载体, 进行SalI/BamHI双
酶切, 与测序正确的目的片段连接, 构建植物表达
载体PCAMBIA1301-CpHRD, 该载体含有GUS融
合蛋白基因作为筛选报告基因。
3.2 转基因烟草的获得和鉴定
采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草(何
华纲和朱姗颖2011)。取生长幼嫩的烟草无菌苗叶
片, 去主脉, 剪成1 cm×1 cm的方块, 放入含PCAM-
BIA1301-CpHRD质粒的农杆菌EHA105菌中浸染
15 min。暗培养2 d, 后转到筛选培养基(MS+1.0
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+30 mg·L-1 Hyg+200
mg·L-1 Cef, pH 5.8), 每15 d更换一次培养基。待分
化出小苗后, 切下, 转入生根培养基(MS+0.1 mg·L-1
NAA+30 mg·L-1 Hyg+200 mg·L-1 Cef, pH 5.8), 获得
再生苗。经炼苗, 移栽至花盆中(珍珠岩:蛭石:营养
土=1:1:1), 22 ℃, 光/暗周期16 h/8 h温室培养, 获得
转基因烟草。
进一步用GUS组织化学染色法(Jefferson等
1987)和RT-PCR方法筛选阳性转基因植株。RT-
PCR时用Trizol试剂盒法提取线果芥总RNA, 经
DNaseI消化后用cDNA第一链合成试剂盒获得
cDNA, 以2 μL cDNA为模板, 取CpHRD基因特异
引物5 GGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC
3和5 GTCGACTCATGGAAAATTCCACAAGTA-
AT 3各1 μL, 2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μL,
用ddH2O补足20 μL, 退火温度52 ℃, 产物564 bp。
3.3 转基因烟草的抗旱性测定
选取生长一致的已鉴定有CpHRD基因表达的
T0代阳性转基因植株及野生型植株各18株, 进行土
壤自然干旱处理, 设置3个重复, 每个重复6株。野
生型和转基因烟草同时停止浇水, 每3 d采样一次
(从上到下第5片功能叶), 检测生理指标、测量气
孔开度(每株10个视野)、观察形态变化, 于第20天
充分灌水, 进行复水, 全程23 d。
用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。游离脯
氨酸含量测定用酸性茚三酮比色法。用蒽酮比
色法测定淀粉和可溶性糖含量。过氧化氢酶
(catalase, CAT)活性测定采用紫外吸收法。SOD活
性测定采用氮蓝四唑比色法(邹琦等2000)。
气孔形态观察采用印迹法(陈佰鸿等2004), 用
Nikon Ci-L荧光显微镜软件测量气孔开度。随机
选取样本叶片20个视野观察气孔数目, 测量气孔
开度。
数据输入、作图用Excel处理, 用SPSS 17.0软
件进行多重比较。
实验结果
1 转基因烟草的获得和鉴定
将侵染后的烟草叶片放至筛选培养基上筛选,
陈琴等: 干旱胁迫对转CpHRD基因烟草的影响 717
15 d左右可见叶盘边缘出现绿色小芽(图1-A), 50 d
左右抗性芽长至2~3 cm后(图1-B), 剪断置于生根培
养基上生根培养(图1-C), 有部分抗性芽叶片变黄逐
渐死去, 为假阳性。待苗长出5片叶子时移栽到花
盆中(图1-D)。与野生型烟草相比, 转基因烟草表
现出植株矮小、叶片颜色较深的表型, 转基因烟草
的主根粗壮, 侧根发达, 移栽时也较容易成活。
选取T0代转基因植株进行GUS组织化学染色
后发现, Hyg抗性再生苗叶片显示蓝色(图2)。用
RT-PCR进一步筛选鉴定, 非转基因烟草无扩增条
带, 转基因植株在564 bp左右处得到一条清晰的条
带(图3), 证明PCAMBIA1301-CpHRD基因已整合
到烟草基因组中并可以表达。
2 自然干旱对转基因烟草生理指标的影响
CAT和SOD是植物细胞内H2O2的重要清除剂,
具有较强的抗旱、伤害修复和超补偿能力(赵咏梅
2011), 可作为植物耐旱性评价的一个重要指标。
如图4-A所示, 在自然干旱胁迫中, 转基因的烟草
CAT活性出现先减弱后升高又减弱, 在野生型烟草
的水平上下浮动; 在第18天时达到最大值, 是胁迫
前的2.35倍。表明CAT主要在胁迫后期大量参与
清除活性氧的活动, 从而对植物细胞起到保护作
用(陈金峰等2008)。SOD活性始终极显著高于野
生型烟草, 第9天是胁迫前的1.6倍(图4-B), 表明转
基因烟草能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧
自由基, 从而减少自由基对植物细胞膜的毒害。
图2 烟草叶片GUS染色图
Fig.2 GUS histochemical staining of tobacco leaf
图3 转基因烟草RT-PCR电泳图
Fig.3 RT-PCR electrophoresis of transgenic tobacco
M: DNA标准分子量DL2000; 1~4: 转CpHRD基因烟草; 5: 野生型烟草。
图1 转基因烟草的再生体系
Fig.1 Regeneration system of transgenic tobacco
A: 烟草愈伤组织; B: 抗性筛选再生苗; C: 再生苗生根培养; D 移栽。
植物生理学报718
转基因烟草的MDA、脯氨酸和可溶性糖含
量均随胁迫时间延长有所上升, 复水后呈现迅速
下降趋势(图4-C、D和E)。其中MDA含量上升幅
度没有野生型明显, 说明转CpHRD基因烟草的细
胞膜系统在胁迫后也发生了氧化作用, 但对比野
生型较轻。而脯氨酸含量大幅增加, 在第12天左
右达到最大, 是胁迫前的2倍, 含量始终极显著高
于野生型(P<0.01), 复水之后出现小幅减小。同时
随着淀粉酶活性的增加, 转基因烟草叶片的可溶性
淀粉含量不断减少, 复水后又大幅度增加(图4-F)。
说明在逆境下可溶性淀粉通过加快代谢的途径, 以
适应环境变化, 表现出较强的恢复补偿效应。
3 转基因烟草的形态和气孔的观察
如图5所示, 在自然干旱胁迫下, 野生型烟草
植株叶片在第14天开始萎蔫, 到第18天已整株萎
蔫, 复水后不能生长。而转基因的烟草植株在停
图4 干旱对转基因烟草生理指标的影响
Fig.4 Effect of drought stress on physiological indexes of transgenic tobacco
WT: 野生型; Cp: 转基因烟草。
陈琴等: 干旱胁迫对转CpHRD基因烟草的影响 719
图5 干旱胁迫下转基因烟草形态的变化
Fig.5 Morphological changes of transgenic tobacco under drought stress
图6 干旱胁迫下转基因烟草气孔的变化
Fig.6 The changes in stomates of transgenic tobacco under drought stress
植物生理学报720
止浇水后的第18天才开始萎蔫, 第20天叶片卷曲
明显, 但顶部叶片仍挺拔翠绿, 复水后正常生长。
可见, 在自然干旱胁迫实验中, 转CpHRD基因烟草
植株耐旱性明显优于野生型烟草。
如图6所示, 在干旱条件下, 烟草叶片气孔密
度均降低, 气孔相对开度在胁迫下变小, 复水后增
大, 转基因烟草变化尤为明显。说明转基因烟草
为了适应水分胁迫环境, 通过关闭气孔或减小气
孔开度来减少蒸腾作用, 提高了抗旱性和水分利
用效率。
讨　　论
干旱胁迫和旱后复水条件下, 植物的形态指
标和生理指标都会表现出一系列的适应性变化,
甚至产生一定的抗性, 因此可以通过植物的形态
指标(叶片、气孔等)及相应的生理指标(MDA、游
离脯氨酸、CAT和SOD等)来判断植物对干旱的响
应程度及适应性。
CpHRD基因属于AP2/EREBP家族, 该家族是
植物特有的一类转录因子家族, 主要参与植物多
个生长发育及应答外界环境信号的过程。本研究
结果表明, 随着水分胁迫程度的加强, 转CpHRD基
因烟草的SOD和CAT活性、脯氨酸和可溶性糖含
量都明显高于对照。转基因烟草首先通过增强渗
透调节类物质, 即可溶性糖、淀粉以及游离脯氨
酸的含量来维持细胞微环境的膨压, 保持原生质
体结构的完整(胡国霞等2011); 其次通过增加
SOD、CAT等酶的活性清除氧自由基, 减少活性氧
的积累(Munné-Bosch和Alegre 2003), 从而降低水
分胁迫下烟草叶片MDA的产量(邓茳明等2010);
再次通过控制气孔开度减少叶片水分蒸腾, 以提
高水分利用效率。同时, 转基因烟草在复水后具
有较强的补偿能力, 促使整个植株能够恢复正常
生长, 表现出比野生型烟草更强的耐旱能力。该
实验结果证实CpHRD基因可以提高植物的抗旱
性, 也为进一步揭示CpHRD基因的抗旱机理提供
了依据。
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