全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (9): 869~881 869
收稿 2013-05-21　　修定 2013-06-28
资助 国家自然科学基金(31070288和31161140345)、国家外专局
和教育部项目(B08044)、中央民族大学985工程项目(98506-
01000101)。
* 通讯作者(E-mail: long@mail.kib.ac.cn; Tel: 010-68936070)。
植物细胞培养生产次生代谢物的途径
谷荣辉, 洪利亚, 龙春林*
中央民族大学生命与环境科学学院, 北京100081
摘要: 利用植物细胞培养生产次生代谢产物是一种快速、高效获取天然产物的重要方法。本文从培养方法、培养技术、
生物转化及基因工程应用三个方面, 综述了近年来国内外应用于植物细胞培养生产次生代谢产物的途径及研究进展, 论述
了次生代谢产物的主要类型及合成途径, 列举了应用实例和次生代谢物种类以及相应的培养条件, 以期对快速选择提高目
的次生代谢物的培养条件起到了一定指导作用。
关键词: 植物细胞培养; 次生代谢物; 前体物; 诱导子
The Ways of Producing Secondary Metabolites via Plant Cell Culture
GU Rong-Hui, HONG Li-Ya, LONG Chun-Lin*
College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081, China
Abstract: Plant cell culture is an important approach for the production of secondary metabolites, which can
obtain the natural products quickly and efficiently. The different ways and research progresses of producing
secondary metabolites via plant cell culture in recent years were reviewed in this paper, from the three aspects of
culture methods, culture techniques, biotransformation and genetic engineering. In addition, it was expounded
the main types of secondary metabolites and synthetic pathways, and enumerated a large number of application
examples and types of secondary metabolites and the corresponding culture conditions. Thence, all of these play
a certain role in guiding the quick selection of culture conditions for the purpose of secondary metabolites.
Key words: plant cell culture; secondary metabolites; precursor; elicitor
随着经济的发展、社会的进步、人们生活水
平的普遍提高使得追求较高品质生活欲望愈来愈
强, “天然”、“绿色”、“健康”、“环保”等名词已成
为这个时代的主旋律, 于是对各种天然的染料、
食品添加剂、药物等的需求不断增加。目前有超
过60%的抗癌药和75%治疗感染性疾病的药物都
来源于天然产物(Cragg和Newman 2009), 这些天
然产物绝大部分属于植物的次生代谢物, 在植物
体内一般含量较低, 直接从植物中提取不但占用
大片的耕地, 而且还可能造成一些珍贵稀有植物
种类的灭绝, 例如抗癌药物紫杉醇最原始的获得
方法就是从红豆杉的树皮中提取。红豆杉生长缓
慢, 提取1 kg紫杉醇需要1 000棵生长了100年的红
豆杉(Kieran等1997), 如果一直用这种提取方法获
取紫杉醇, 那么红豆杉在地球上将不复存在。这
种需求量增加与生物多样性减少的矛盾, 推动着
人们努力去探索替代传统方法的途径来获取具有
重要价值的植物次生代谢物(Georgiev等2007)。
植物细胞培养作为一种有效生产有重要价值
次生代谢物的技术, 近年来受到广泛关注(Tepe和
Sokmen 2007)。为了更好地研究某些植物中的代
谢途径, 缓解工业中次生代谢物的生产压力, 细胞
培养正在逐步替代这些植物的传统农业种植方式
(Rao和Ravishankar 2002)。植物细胞培养为避免
整株植物的采伐、可控和可重复性地生产具有应
用价值的次生代谢物提供了一种很好的选择(Yang
等2001)。在一定的离体培养条件下, 植物的一些
代谢物所积累的含量高于整株植物, 这也表明了
通过植物细胞培养代替整株生产特定植物次生代
谢物具有广阔前景(Zhang等2001)。
与其他方法相比, 应用植物细胞培养技术生
产次生代谢产物具有以下优点: (1)能够减少各种
环境因素对产物的影响, 确保在一个限定的生产
植物生理学报870
系统中连续、均匀生产; (2)可以在生物反应器中
进行大规模培养, 并通过控制环境条件提高代谢
物产量; (3)所获得产物可从培养体系内直接提取,
快速、高效的回收与利用, 简化了分离与纯化步
骤; (4)有利于细胞筛选、生物转化, 合成新的有效
成分; (5)有利于研究植物的代谢途径, 还可以利用
某些基因工程手段探索与创造新的合成路线, 得
到价值更高的产品; (6)节省大量用于种植原料的
土地 , 以便土地资源得到高效利用 (吕春茂等
2007)。鉴于此, 本文简单介绍了次生代谢物的主
要类型、合成途径以及部分代谢物对人类的作用
价值, 重点从细胞培养方法、细胞培养新技术、
生物转化及基因工程应用三个方面, 综述了近年
来国内外应用于植物细胞培养生产次生代谢产物
的途径及研究进展, 以期对快速选择提高目的次
生代谢物的培养条件起到一定指导作用。
1 植物次生代谢产物的主要类型、合成途径及
功能
植物次生代谢的概念是在1891年由Kossei首
先明确提出的, 是指有些生物体利用某些初生代
谢产物为“原料”, 在一系列酶的催化下, 形成一些
特殊的化学物质的过程, 这些特殊的化学物质即
为次生代谢产物(secondary metabolites) (肖春桥等
2005; 王丹等2008; 徐世千等2011), 其产生和分布
通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异
性。植物次生代谢物在植物生命活动的许多方面
均起着重要作用, 有些植物次生代谢产物是植物
生命活动所必需的(Kutchan 2001)。
1.1 植物次生代谢产物的主要类型及合成途径
植物次生代谢产物种类繁多, 结构迥异, 根据
其化学结构和性质, 一般将其分为三大类: 酚类
(phenols)、萜类(terpenes)和含氮化合物(nitrogen-
containing compounds), 每一类已知化合物都有数
千种甚至数万种(杜丽娜等2005; 孙立影等2009)。
1.1.1 酚类物质 在植物中分布广泛, 主要包括黄
酮类、简单酚类和醌类等, 主要由磷酸烯醇式丙
酮酸到分支酸的生物合成途径而来, 称莽草酸途
径。黄酮类在酚类物质中占主要地位, 其主要是
指基本母核为2-苯基色原酮类化合物, 现在泛指
有酚羟基的苯环(A环与B环)通过中央三碳原子
相互连接构成的一系列化合物。黄酮类的生物前
体为苯氨酸和马龙基辅酶A (malonyl CoA)。传统
上, 黄酮类化合物(flavonoids)主要分为二氢黄酮
(醇)类、黄酮(醇)类、异黄酮类、黄烷类、花青素
类、花色苷类、查尔酮类橙酮类、双黄酮类及黄
酮苷类等; 现代研究发现, 还应包括鱼藤酮类、紫
檀素类、高异黄酮类等(吴立军2011)。简单酚类
是含有一个被羟基取代的苯环化合物。醌类是由
苯系多环烃碳氢化合物(如萘、蒽等)衍生的芳香
二氧化合物, 根据其环系统分为苯醌、萘醌和蒽
醌(杜丽娜等2005)。
1.1.2 萜类化合物 主要由异戊烯链生物合成途径
而来, 称异戊二烯代谢途径。萜类化合物无论是
从它们在植物界分布的广泛程度、含量、结构多
样性, 还是从它们对人类生活的作用来看, 都是一
种重要的植物成分。萜类化合物是由甲戊二羟酸
衍生且分子式符合(C5HX)n通式的化合物及其衍生
物, 也称异戊二烯类化合物(孙立影等2009)。生
物合成的关键前体是甲戊二羟酸。萜类化合物通
常按其组成分子的异戊二烯结构单元分为单萜、
倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和多萜,
每种萜类化合物又可分为直链、单环、双环、
三环、四环和多环, 其含氧衍生物还可分为醇、
醛、酮、酯、酸、醚等, 其中很多化合物具有明
显的生物活性(谭仁祥2000; 高锦明2003)。
1.1.3 含氮化合物 大多数含氮化合物是从普通
氨基酸合成的, 主要有生物碱、胺类、生氰苷、
非蛋白氨基酸和芥子油苷等。其中, 生物碱是植
物中广泛存在的一类含氮次生代谢物, 分子结构
中具有多种含氮杂环, 多为药用植物主要活性成
分。自然界20%左右的维管植物含有生物碱, 其
中大多数是草本双子叶植物, 单子叶植物和裸子
植物很少含生物碱(杜丽娜等2005)。根据生源结
合化学分类方法, 生物碱的来源主要有两个途径:
一是氨基酸途径, 二是甲戊二羟酸途径(吴立军
2011)。胺类通常由氨基酸脱羧或醛转氨而产生。
生氰苷是一类由脱羧氨基酸形成的O2糖甙, 氰基
来自于α-2碳和氨基。生氰苷是植物生氰过程中产
生HCN的前体。
以上三大类代谢物的主要分类、前体物、合
成途径见表1。此外, 除了以上主要三大类外, 植
物还产生多炔类、有机酸等次生代谢物质, 多炔
谷荣辉等: 植物细胞培养生产次生代谢物的途径 871
类是植物体内发现的天然炔类, 有机酸广泛地分
布于植物各个部位。
1.2 植物次生代谢产物的主要功能及应用
植物次生代谢(secondary metabolism), 不仅是
植物对环境的一种适应, 也是植物主要的防御机
制之一。它在调节植物与生态环境的关系中起着
重要作用(张争等2009; Wilson和Roberts 2012)。
次生代谢物对植物生命活动的功能可概括为
以下几点: (1)参与植物生理反应, 如叶绿素、类胡
萝卜素等参与光合作用; (2)作为信号分子, 调节植
物生命活动, 如IAA、NAA、ABA等植物激素以
及小分子酚类物质水杨酸等; (3)参与植物结构组
成, 如组成细胞壁的重要成分木质素、角质、胼
胝质、木栓质等; (4)提高植物的抗性, 如甜菜碱、
脯氨酸、脱落酸、花色素等可提高植物对寒冷、
干旱、高温等不良环境的适应性; 类黄酮、黄酮
醇、类胡萝卜素、树脂物质等可吸收紫外光; (5)
作为毒性物质或化感物质, 植物抗毒素、单宁、
生氰糖苷以及一些生物碱等可增强植物抵抗病害
和抵御天敌侵袭的能力(王春丽和梁宗锁2009)。
我国是应用天然药物年代最为久远也最为广
泛的国家, 而天然药物中的绝大多数活性成分都
是植物次生代谢物(Wilson和Roberts 2012; 张玲华
和郭勇2006), 通过细胞培养已经用于商业化生产
的次生代谢物主要有小檗碱、紫杉醇、鬼臼毒
素、迷迭香酸和莨菪碱等, 具有很好的抗癌、抑
菌消炎活性(张玲华和郭勇2006)。除了药用外, 许
多次生代谢产物还是食品、化工和农业化学的重
要原料, 如用作杀虫剂、染料、调味品和香料等
(Srivastava和Srivastava 2007)。目前研究较多的具
有重要价值的次生代谢(Wilson和Roberts 2012;
Kolewe等2008; Obembe等2010)见表2。总之, 次生
代谢物不仅是植物生命活动不可或缺的物质, 而
且对人类社会的生存发展也起着重要的作用。
2 植物细胞培养生产次生代谢物的研究进展
2.1 植物细胞培养提高次生代谢物的主要培养方法
2.1.1 培养条件的优化 通过对培养条件进行优化
可以提高细胞产量和目标代谢产物的含量, 可优
化的条件包括培养基的种类、生长调节剂的组合
以及培养所处的物理环境等。靳浩淼(2008)分别
用MS、改良White、SJ-1和B5这4种液体培养基
培养西洋参发状根, 研究其总皂苷的积累, 确定改
良White对总皂苷的积累最有效。朱留刚(2012)将
雷公藤愈伤细胞在White、MS及N6培养基上悬浮
培养, 研究了雷公藤甲素的合成情况, 结果三组细
胞培养悬浮液中的雷公藤甲素峰值产量分布规律
为: White (2.81 mg·L-1)>N6 (2.13 mg·L
-1)>MS (1.63
mg·L-1)。生长调节剂不仅对细胞生长起到重要作
用, 而且在调节次生代谢产物的积累方面受到广
泛关注, 如王梦亮等(2006)确定黄芩愈伤组织生长
和黄芩苷积累的优势培养条件; 方强等(2008)指出
IAA、NAA、蔗糖能显著地促进黄芩愈伤细胞黄
芩苷、黄芩素含量的提高等。此外, 培养物理条
件比如光照、温度、通气等的改变对次生代谢物
积累也有影响。虽然通过对培养条件进行特定的
优化可以提高目标代谢产物的含量, 但由于不同
物种的特异性及不同目标代谢物的代谢途径不尽
相同, 所以通过优化培养基来提高不同植物的次
生代谢物含量不具有明显可循的规律, 只能提供
一定的参考作用。通过不同优化条件提高次生代
谢物含量的具体实例见表3。
2.1.2 饲喂前体物 植物细胞产生次生代谢物通常
都需要一定的前体物, 这些前体物在一系列酶的
催化下合成植物次生代谢物, 调节生命活动。因
此, 在植物细胞中添加次生代谢物生物合成的前
体也是调节植物次生代谢物合成和积累的重要途
表1 植物体内酚类、萜类、含氮化合物的主要类别、前体物及合成途径
Table 1 Main classification of phenols, terpenoids, nitrogen and their precursors, and main synthetic ways in plants
次级代谢物 主要前体物 主要合成途径 主要类别
酚类化合物 苯丙酸 苯丙基类生物合成途径 黄酮类
莽草酸途径 简单酚类、醌类
萜类化合物 甲戊二羟酸 异戊二烯生物合成途径 单萜、倍半萜、二萜和多萜
含氮化合物 氨基酸 氨基酸途径 氨基酸来源生物碱、胺类、非蛋白
氨基酸、生氰苷和芥子油苷
甲戊二羟酸 甲戊二羟酸途径 生萜类生物碱和甾类生物碱
植物生理学报872
表2 部分重要次生代谢物的应用
Table 2 The applications of some important secondary
metabolites
用途 次生代谢物 来源
抗癌剂 喜树碱 喜树Camptotheca acuminata
长春碱 长春花Catharanthus roseus
长春新碱 长春花Catharanthus roseus
小檗碱 日本黄连Coptis japonica
亚欧唐松草Thalictrum minus
紫杉醇 红豆杉Taxus spp.
鬼臼毒素 鬼臼属Podophyllum spp.
镇痛剂 吗啡碱 罂粟Papaver somniferum
治疟疾 青蒿素 青蒿Artemisia annua
抗炎药 小檗碱 日本黄连Coptis japonica
亚欧唐松草Thalictrum minus
迷迭香酸 彩叶菜Coleus blumei
杀虫剂 除虫菊酯 艾菊Tanacetum cinerariifolium
印楝素 印楝Azadirachta indica
染料/食用色素 花青素 铁海棠Euphorbia milii
土当归Aralia cordata
甜菜红素 甜菜Beta vulgaris
红花苷 红花Carthamus tinctorius

表3 不同优化条件对次生代谢物积累的影响
Table 3 Influence of different optimization conditions on secondary metabolites accumulation
优化对象 来源 优化条件 次级代谢物 文献
培养基类型 西洋参 改良White 西洋参总皂苷 靳浩淼(2008)
雷公藤 White 雷公藤甲素 朱留刚(2012)
培养基组分 黄芩 MS、氮源浓度60 mmol·L-1 (NH4
+:NO3
-为1:1)、 黄芩苷 王梦亮等(2006)
KH2PO4浓度0.5~1.5 mmol·L
-1、80 g·L-1蔗糖、
0.3 mg·L-1 IAA、2 mg·L-1 6-BA和200 mg·L-1蛋白胨、
40 g·L-1蔗糖、3.0 mg·L-1 NAA
黄芩 3%蔗糖 黄芩素 方强等(2008)
黄芩苷
冬凌草 5%蔗糖 冬凌草甲素 董诚明等(2009)
迷迭香酸
瑞香狼毒 MS+2.0 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 黄酮类 王文星等(2010)
6-BA+30 g·L-1蔗糖
金铁锁 1/2MS+0.5 mg·L-1 NAA、IAA、IBA+30 g·L-1蔗糖 皂苷 田思迪等(2012)
防己 MS+2 mg·L-1 2,4-D、2 mg·L-1 BAP、1.0 mg·L-1 KN 黄连素 Talat等(2008)
水母雪莲 氮源总浓度(包括NH4
+、NO3
-)为30 mmol·L-1、 黄酮类 杨睿(2005)
NH4
+:NO3
-比例为5:25、2%蔗糖和3%葡萄糖组合、
0.5 mg·L-1 GA3和 0.5 mg·L
-1 IBA
物理环境 胀果甘草 干旱胁迫 黄酮类 杨英等(2007)
虎杖 弱光、25 ℃ 白藜芦醇 文涛(2009)
雷公藤 暗光 内酯醇 李琰(2008)
总生物碱
径。目前应用较多的前体物主要有苯丙氨酸、酪
氨酸、肉桂酸等。在次生代谢过程中, 苯丙氨酸
是一个代谢中间体, 它是合成黄酮类化合物、生
物碱、木质素等次生代谢物质的前体, 苯丙氨酸
经苯丙氨酸裂解酶催化生成肉桂酸, 最终催化合
成次生代谢物黄酮类。酪氨酸可以经过酪氨酸代
谢途径转化为对香豆酸, 最终参与黄酮的合成。
前体在次生代谢中可能通过作为底物, 抑或作为
催化代谢途径中某关键酶而发挥作用。不同类型
次生代谢物的代谢途径不同, 因此前体物的添加
应该以目标代谢物为依据。
此外, 植物代谢是一个连续的过程, 次生代谢
物的合成存在时间和空间上的变化, 因此, 前体物
的添加也必将存在一个最适时间和最适浓度的问
题。通常情况下, 前体物在培养开始时加入, 并且
添加浓度与接种细胞的量存在一定比例。近年来,
通过添加前体物调节植物次生代谢物的生物合成
和积累受到学者们的广泛关注。具体实例见表4。
2.1.3 添加诱导子 诱导子(elicitor)是指植物抗病
生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物
过敏反应(hypersensitive reaction, HR, 亦称抗性反
应或自身防御反应)的因子。在活细胞体系中加
入低浓度的诱导子能够诱导或刺激特定化合物的
谷荣辉等: 植物细胞培养生产次生代谢物的途径 873
生物合成(Smetanska 2008; Namdeo 2007; Chandra
和Chandra 2011)。根据其来源可分为生物诱导子
(biotic elicitors)和非生物诱导子(abiotic elicitors)。
生物诱导子主要包括病毒类诱导子、细菌类诱导
子、酵母提取物、真菌类诱导子等。非生物诱
导子主要可分为化学因子和物理因子两大类, 常
用的化学因子主要有水杨酸(salicylic acid, SA)、
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MJ)、茉莉酸(jas-
monate, JA)、稀土元素以及重金属盐类等; 物理因
子一般为高温、高压、电击、紫外线、损伤等一
些能诱导植物产生抗病性的环境因素(Smetanska
2008)。利用诱导子刺激次生代谢物的产生, 不仅
是植物细胞培养生产次生代谢物的重要手段, 而
且对缩短工艺时间、提高容器最大利用率方面的
作用也非常显著(Dornenburg 2004)。利用诱导子
来提高次生代谢产物, 是目前在植物细胞培养中
最常用的方法之一, 在调控植物次生代谢物的合
成与积累方面已取得了较多成果。Cai等(2011a)研
究了诱导子(链霉素、活性炭、乙烯)及高流体静
压(high hydrostatic pressure, HP)对葡萄悬浮培养次
生代谢产物的影响。结果表明, 在HP和化学诱导
子的作用下, 酚类物质在培养基中含量明显增加,
并且当HP和乙烯同时处理时, 胞外酚类和3-O-糖
基-白藜芦醇的水平明显增加。近年国内外研究进
展具体实例见表5和表6。
很多次生代谢物的产生与植物抵御病原体以
及天敌有关, 在物理或化学胁迫下, 细胞代谢偏向
于次生代谢(Pauwels等2009)。诱导子的作用相当
于外界胁迫, 刺激植物细胞内的防御机制, 促进植
物次生代谢物的产生(Chandra和Chandra 2011)。
2.1.4 应用抑制剂和渗透剂 植物的次生代谢由多
途径控制, 是一系列酶促反应的结果。在植物细
胞培养中, 不仅有初生物向次生物的转化, 也存在
次生物之间的相互转化。因此, 寻找如何抑制那
些分支途径中的关键酶活性, 强化生成某一特定
化合物的合成途径, 是提高植物细胞培养生产次
表4 不同前体物对植物次生代谢物生物合成与积累的影响
Table 4 Influence of different precursors on plant secondary metabolites biosynthesis and accumulation
来源 前体物 添加时间 添加浓度 次生代谢物 文献
水母雪莲悬浮细胞系TUIP-8 肉桂酸 接种时 7.14 mg·L-1 黄酮 高丽华等(2007)
乙酸钠 3.57 mg·L-1
苯丙氨酸 3.57 mg·L-1
茅苍术 木糖醇 开始培养 6.0 g·L-1 苍术酮 Chen等(2012)
β-桉油醇
四氢呋喃 0.07 g·L-1 苍术酮
苍术醇
苍术素
高山红景天 苯丙氨酸 培养起始 20 mg·L-1 红景天苷 魏欣方等(2010)
肉桂酸 10 mg·L-1
酪氨酸 10 mg·L-1
人参 提取物II* 继代5 d 0.024 mg·L-1 人参皂苷Rb1 岳才军等(2012)
Rg1
Re
西洋参 Mg(Ac)2 ** 起始培养 0.5 mg·L-1 西洋参皂苷 Mills和Werner (1955)
L-亮氨酸 1.0 mg·L-1
胀果甘草 苯丙氨酸 培养10 d 20 mg·L-1 黄酮 杨英等(2007)
酪氨酸 5.0 mg·L-1
肉桂酸
乙酸钠
虎杖 苯丙氨酸 第3次继代 30 mg·L-1 白藜芦醇 文涛(2009)
肉苁蓉 苯丙氨酸 起始培养 0.330 g·L-1 苯乙醇苷 吕建军(2008)
酪氨酸 0.362 g·L-1 松果菊苷
*达玛树脂中的三萜类化合物有人参皂苷生物合成前体物达玛烯二醇-II及其类似物(赵寿经等2010); **人参皂苷是通过类异戊二烯途径
合成的, 醋酸镁和亮氨酸属于间接前体物(Kosmos等2002)。
植物生理学报874
生代谢物产量的又一重要途径。王逸文等(2012)
利用2-氨基磷酸茚(AIP)的特异性来抑制苯丙氨酸
解氨酶(PAL)的活性, 从而对苯丙氨酸途径碳流进
行调控, 最终达到提高高山红景天组织培养中红
景天苷生物合成的目的。
通过植物细胞培养产生的次生代谢物通常积
累于胞内液泡, 因此, 要达到连续、高产的目的,
就必须想方设法改变细胞渗透性使代谢物释放到
胞外(Cai等2012)。研究表明, 细胞渗透作用取决
细胞膜上形成的一个或多个孔隙, 这些孔隙能调
节某些分子进出植物细胞(Brodelius和Pedersen
1993)。近年来, 有很多方法被用于增加细胞膜的
渗透性, 其中化学方法有: 高离子强度溶液、二甲
基亚硝胺(DMSO)、吐温-20、添加壳聚糖、改变
pH等; 物理方法主要有脉冲电场(PEF)、高流体静
压(HHP)和超声。Gueven和Knorr (2011)在大豆
(Glycine max)细胞培养中, 应用PEF在2.0 kV·cm-1
(5 Hz, 36 s)时诱导可逆的膜透性, 增加异黄酮的浓
度。Cai等(2011b)在葡萄(Vitis vinifera L.)细胞悬浮
培养中, 应用PEF提高酚酸的积累, 并且测得胞外
总酚酸比非处理的高11%。此外, 有研究发现, 在
大豆细胞培养中, 50 Mpa的HHP导致异黄酮生物
合成的提高10%~30%, 但是更高的压力不会引起
进一步的增加(Gueven和Knorr 2011), 也有报道40
Mpa的HHP使葡萄渗出液中的酚酸含量增加9倍
(Cai等2011a)。
改变植物细胞的渗透作用常常会导致其丧失
生命力(Moreno等1995), 推断其原因是液泡膜的破
表5 生物诱导子对植物次生代谢物积累的影响
Table 5 Biological elihhcitors on the influence of plant secondary metabolites accumulation
来源 诱导子 诱导浓度 诱导时间/d 次生代谢物 文献
白桦 拟茎点霉菌(Phomopsis) 40 μg·mL-1 1 三萜 翟俏丽(2011)
虎杖 黑曲霉 100 mg·L-1 6 白藜芦醇 文涛(2009)
东北红豆杉 美丽镰刀菌(Fusarium mairel) 4 mL 2 紫杉醇 李永成和陶文沂(2008)
茅苍术 小克银汉霉属AL4 30 mg·L-1 9 挥发性油 方芳等(2009)
茅苍术 Rhizoctonia SP1 40 mg·L-1 9 苍术素 陶金华等(2011)
灵芝 顶头孢 120 μg·mL-1 7 三萜 高兴喜等(2009)
丹参 酵母提取液 100 mg·mL-1 22 丹参醌 Yan等(2011)
表6 非生物诱导子对植物次生代谢物积累的影响
Table 6 Abiotic elicitors on the influence of plant secondary metabolites accumulation
来源 诱导子 诱导浓度 诱导时间/d 次生代谢物 文献
丹参 SA 6.25 mg·L-1 6 丹酚酸B 刘元柏(2010)
7 咖啡酸
雷公藤 SA 0.1 mg·L-1 8 雷公藤甲素 朱留刚(2012)
Lacl3 20 mg·L
-1 12
水母雪莲 MJ 0.02 mmol·L-1 6 黄酮类化合物 杨睿(2005)
SA 0.03 mmol·L-1 6
MJ+SA 0.02 mmol·L-1+0.03 mmol·L-1 9
红豆杉 SA 0.1% 10 紫杉醇 苗奇志等(2000)
高山红景天 AIP 10 μmol·L-1 12 红景天苷 王逸文等(2012)
MJ 200 μmol·L-1 12
西洋参 MJ 10 μmol·L-1 28 总皂苷 赵寿经等(2010)
喜树 SA 100 μmol·L-1 10 10-羟基喜树碱 Yan等(2011)
UV-B 5 μmol·m-2·s-1 3 喜树碱
对雨生红球藻 花生四烯酸 312.5 mg·L-1 30 虾青素 王丽丽等(2010)
肉苁蓉 苯丙氨酸 0.3 mmol·L-1 9 苯乙醇苷 沈慧慧等(2010)
酪氨酸 0.03 mmol·L-1
丹参 Ca2+ 10 mmol·L-1 6 迷迭香酸 刘连成等(2012)
长春花 Ce4+ 0.5~1.0 mmol·L-1 1 长春质碱 范寰(2006)
谷荣辉等: 植物细胞培养生产次生代谢物的途径 875
坏、区室的丧失以及随后液泡内容物的释放引起
培养基pH的改变从而导致细胞死亡, 也可能是渗
透剂引起代谢物生物合成必需的酶变性, 引起完
整细胞膜发生不可逆的的渗透(Corrales等2008)。
但也存在例外, 如进行甜菜细胞培养时, Trejo-
Tapia等(2007)用0.7 mmol·L-1 Triton X-100处理15
min, 诱导了30%甜菜花青素的释放, 且没有细胞活
力丧失(>70%)。经过这种渗透处理, 培养的甜菜
细胞继续快速生长, 14 d后达到最大生物量, 比非
渗透处理的高48%。
2.2 植物细胞培养提高次生代谢物的主要培养
技术
2.2.1 液体悬浮培养技术 从周围培养基中获得有
价值的代谢物, 最简单有效的方式是选用液体培
养基(Cai等2012)。液体悬浮细胞培养具有操作简
单、易于扩大培养、氧气及养分的供应和传递方
便、次生代谢物易分离等优点, 是目前研究利用
植物细胞培养生产次生代谢产物最常用的培养方
式。Abbott等(2010)和Condori等(2010)指出, 花生
发根培养产生的白藜芦醇大部分在生长培养基上
释放和转移。Almagro等(2011)研究结果表明, 在
长春花细胞悬浮培养中, 大部分的阿马碱出现在
生长培养基中。周丽丽等(2012)建立以生产香豆
素类物质为目的的白蜡属细胞悬浮培养技术, 结
果表明, 施加信号分子SA能不同程度地促进香豆
素及白蜡树精的含量和产量增加, 其中以浓度100
mg·L-1的SA效果最明显, 处理72 h后白蜡树精的
含量及产量均达到最高, 适宜浓度的SA可促进白
蜡属种间杂交子代悬浮细胞中香豆素类物质的积
累。杨英等(2007)建立了稳定的甘草细胞悬浮培
养体系, 用以获得高产黄酮。以上这些研究结果,
充分说明了细胞悬浮培养技术在提高次生代谢物
含量上的优越性。但该技术不适合生产易被氧化
的次生代谢物, 原因在于许多胞外抗氧化剂(主要
是多酚类)和抗氧化酶可以在细胞悬浮培养中连续
生产, 而细胞悬浮培养的细胞是去分化的, 它们缺
少储存组织, 当易氧化产物释放到培养基中时, 容
易被释放到培养基中的酶分解(Wink 1994)。
2.2.2 固定化培养技术 植物细胞固定化是将植物
细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养,
并生产有用代谢物的技术。兴起于1979年(郭敏
亮和隋德新1992) , 具有可重复利用性, 能够更好
地控制操作过程增加植物细胞的代谢稳定性, 刺
激次生代谢物的合成提高产量, 以及促进或改变
产物的释放(Shibasaki等2001)等优点, 应用广泛。
细胞固定化培养技术主要利用包埋方法来固定植
物细胞, 用于包埋植物细胞的支持介质主要是能
成胶的聚多糖如海藻酸、琼脂、K-角叉藻胶等
(Smetanska 2008)。此外, 植物细胞的固定化方法
还有聚氨基甲酸乙酯泡沫自然吸附法、中空纤维
包埋法、自然的自固定化方法以及共价交联法
等。有研究表明, 将欧洲红豆杉(Taxus baccata)细
胞用海藻酸钙固定, 在生物反应器中培养, 16 d后
测得总紫杉醇(细胞内外)含量达到43.43 mg·L-1, 产
率达2.71 mg·L-1·d-1 (Bentebibel等2005)。方从兵等
(2006)利用海藻酸钠固定化处理野葛细胞, 发现
在野葛细胞培养周期中, 固定化细胞胞内黄酮和
培养液黄酮逐渐累积, 培养体系中的总黄酮含量
在16 d达到最大, 约为初始培养时的17.28倍, 提出
可采用野葛细胞固定化培养的方法进行异黄酮化
合物的生产。于荣敏等(2004)以聚胺酯泡沫为固
定材料, 采用银杏细胞固定化培养法生产银杏内
酯。利用固定化培养技术培养植物细胞, 还能简
化下游工艺, 使产物持续释放。
2.2.3 两相培养技术 两相培养技术是指在培养体
系中加入水溶性或脂溶性有机物, 或者是具有吸
附作用的多聚化合物, 从而使培养体系因分配系
数的差异形成上、下两相, 细胞在某一相中生长
与合成次级代谢物, 次级代谢物分泌到胞外并转
移到另一相中(崔堂兵等2001; 李祝等2011)。采用
固-液或不相容的液-液两相培养体系使次生代谢
物发生转移, 能够克服产物的反馈抑制, 同时还能
简化产物回收、促进半连续化, 从而提高培养的
生产效率(Yan等2005)。近年来, 两相培养技术在
提高细胞培养生产次生代谢物方面发挥了非常重
要的作用。如采用水相-有机相两相系统进行南方
红豆杉(Taxus chinensis)悬浮培养, 使用蔗糖饲喂,
使63%的产物释放到培养基中, 并且紫杉醇的产量
提高了6倍(Wang等2001)。Zare等(2010)采用B5液
体培养基-液态石蜡两液相系统, 培养意大利蓝蓟
生产紫草宁和紫草素。固-液两相体系主要是在液
体培养基中加入树脂对产物进行吸附, 有报道指
植物生理学报876
出, 采用非芳香树脂对产物进行吸附, 在葡萄(Vitis
vinifera)培养过程中, 反式白藜芦醇和经过水杨酸
或茉莉酸诱导的同位素标记的反式白藜芦醇产量
显著增加(Yue等2011)。在丹参发根培养伴随半连
续操作过程中, 使用疏水性大孔树脂, 导致丹参酮
的产量比非处理的高7.4倍(Yan等2005)。
利用两相培养技术提高植物细胞次生代谢物
的生产, 不仅能减轻产物本身对细胞代谢的抑制
作用, 而且还保护了产物免受培养基中催化酶或
酸对产物的影响。此外, 产物在固相或疏水相中
的积累易化了下游处理过程, 大幅节省了生产成
本。因此, 该技术具有广泛的应用前景。但由于
分配系数不同, 吸附作用对不同代谢物质也不同,
所以要针对目标代谢物选择合适的有机相或吸
附剂。
2.2.4 两步培养技术 两步培养法技术, 即根据生
长及代谢的需求, 调整培养基组分和培养条件, 使
生长和代谢均能在最适的途径下进行, 以期提高
目的产物的产率。Yang等(2008)以益母草细胞在
液体MS (2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA)连续培
养, 16 d获得最大生物量, 生物碱含量为0.081%,
加入0.03 mg·L-1 L-脯氨酸(L-Pro)后, 含量增加到
2.1%。张建佳(2011)在黄连细胞细胞培养过程中,
首先在含有6,7-V1+1.5 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 KT
培养基中进行细胞的增殖培养, 收获的细胞鲜重
为182.92 g·L-1; 然后在含有6,7-V2+1.5 mg·L-1 2,4-
D+0.2 mg·L-1 KT培养基中进行, 生物碱的含量为
13.8%。两步培养技术很好的解决了细胞生长量
与次生代谢物积累量不协调的矛盾, 丰富了通过
细胞培养生产次生代谢物的途径。
2.2.5 发状根培养技术 发状根是双子叶植物的器
官受到发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)
感染后所产生的病态组织, 发状根培养技术兴起
于20世纪80年代, 在很多双子叶植物中, 基于其遗
传和生化性质的稳定、高生长率以及相对高效合
成天然化合物的能力, 被普遍认为是一种有效的
次生代谢物生产系统(Guillon等2006)。近年来, 通
过利用发状根培养技术来获取次生代谢物成为
国内外研究热点。杨世海等(2012)用发根农杆菌
1025感染罗勒叶片, 建立发根培养体系, 并指出
激动素(KT)为罗勒发根培养的最适外源激素, 茉
莉酸甲酯(MeJA)诱导罗勒发根总黄酮的形成, 水
杨酸(SA)对罗勒发根的多糖和总黄酮的积累有明
显促进作用。Kim等(2008)研究表明, 发根农杆菌
R1601对花生发状根的诱导率(75.8%)、生长量(7.6
g·L-1)以及白藜芦醇的产量积累(1.5 mg·g-1)均有显
著效果, 并指出在花生的发状根培养过程中, 合适
的发根农杆菌株系的使用可以调节白藜芦醇的生
物合成。Lee等通过发根农杆菌R1000分别建立了
藿香(Lee等2008)、荆芥(Lee等2010a)的发根培养
体系, 提高迷迭香酸含量。
发状根在不加外源激素和暗培养的情况下不
仅生长迅速而且分枝多、次生代谢物质含量一般
远高于悬浮培养的细胞, 且含量稳定、容易产生
某些新奇的化合物、易于分离和容易获得再生植
株等优点, 目前被普遍认为是极好的获取次生代
谢产物的原材料。
2.2.6 冠瘿培养技术 冠瘿培养技术主要是利用根
癌农杆菌感染植物产生冠瘿瘤, 然后进行细胞培
养的技术。冠瘿瘤具有植物激素非依赖性生长能
力、冠瘿碱合成能力、其遗传性状稳定、生长
迅速; 冠瘿组织离体培养时也具有激素自主性、
增殖速率较常规细胞培养快等特点, 其次生代谢
产物合成能力与稳定性较强, 该技术在次生代谢
产物的生产中有着良好的开发前景。李达旭等
(2006)建立‘川草二号’老芒麦愈伤组织再生系统
后, 用根癌农杆菌处理液, 共培养时添加一定浓度
的乙酰丁香酮, 降低了培养基中的钙离子浓度和
培养温度(19~23 ℃), 提高了转化率, 同时促进了冠
瘿瘤的发生。
2.3 生物转化及基因工程技术的应用
生物转化(biotransformation), 也称生物催化
(biocatalysis), 是利用生物体系本身所产生的酶对
外源化合物进行酶催化反应。植物细胞生物转化
主要类型有羟基化反应、糖基化反应和氧化还原
反应 , 具有专一性强、反应条件温和以及产物
少、产量高等特点(刘洋洋等2009)。因此, 利用植
物细胞培养生产次生代谢物常常涉及到生物转
化。Surodjo等(2008)在改良的MS培养基中培养了
乳茄(Solanummare mosum)悬浮细胞, 成功的将邻
氨基苯甲酸转化成ο-aminobenzoic acid-7-Ο-β-D-
(β-1,6-Ο-D-glueopyranosyl)-glucopyranosyl, 并且产
谷荣辉等: 植物细胞培养生产次生代谢物的途径 877
率高达31.8%。Yin等(2013)利用异戊烯黄酮化合
物作为生物催化剂, 分别从柘树、桑树细胞培养
中获得了异戊烯基黄酮类化合物(白杨素和金雀异
黄酮、槐角苷、香叶木素)。Swain等(2012)用发
根农杆菌AT4感染蝶豆节间段, 将浸染后的发状根
在MS0上培养, 并辅以头孢抗菌素。通过PCR从发
根中检测到TL-DNA rolB 和rolC ORF, 并且在所有
筛选的转化发状根中都检测到TR-DNA基因编码的
吡喃甘露糖合酶(man2)、农杆碱以及甘露碱的合
成。这些证据表明了生物转化能够生产有用的药
用化合物。
在植物细胞培养中, 也常利用基因工程技术
调控代谢来提高植物次生代谢的合成。例如徐茂
均等(2006)在研究粉葛悬浮细胞中葛根素生物合
成的过程中, 通过使齐墩果酸的合成关键酶(β-香
树酯醇合成酶, β-AS)基因BPY, 白桦酯醇合成关键
酶(羽扇醇合酶, LUS)基因BPW表达量增加, 从而
促进了三萜的积累。DeJong等(2006)将控制紫杉
醇生物合成的关键酶[牻牛儿基二磷酸(GGPP)合
酶和紫杉二烯合成酶(TASY)]基因引入啤酒酵母
(S. cerevisiae)使紫杉烯的产量达1 mg·L-1。也有报
道指出, 在长春花发根培养中, G10H (负责一部分
萜类化合物的产生)和Orca3 [与萜类吲哚生物碱
(TIA)生物合成有关的转录因子]的上调, 导致长春
碱产量提高6.5倍(Wang等2010)。通过调控目标代
谢物合成关键酶基因的表达, 对提高代谢物产量
具有高效性和专一性, 但相对比较复杂。
3 结语
植物的次生代谢产物是众多天然药物(如青
蒿素等)和化工原料(如橡胶等)的重要来源, 对人
类的生存发展具有重要影响和巨大的应用前景。
利用植物细胞培养生产次生代谢物, 已经成为大
量获取这些天然药物和化工原料的有效手段。通
过植物细胞培养生产次生代谢产物的途径有很多,
本文主要从培养方法、培养技术、生物转化及基
因工程应用三个方面, 综述了近年来国内外相关
技术和研究进展。
3.1 植物细胞培养中提高次生代谢物不同途径的
主要作用机理
提高次生代谢产物途径最根本的作用机理表
现在诱导作用、膜渗透作用、产物转移、单个基
因和转录因子调控的代谢工程等方面(Wilson和
Roberts 2012; Cai等2011a, 2012)。本文中所述的
优化培养条件、添加诱导子、饲喂前体、毛状根
培养、冠瘿培养、生物转化均是以改变环境或添
加某种物质刺激而使培养细胞产生次生代谢物,
属于诱导作用机理; 应用渗透剂主要改变细胞渗
透性, 属于渗透作用机理; 液体悬浮培养、固定化
培养、两相培养、两步培养则主要是利用各种途
径使产物转移以解除反馈抑制和产物降解, 属于
产物转移机理; 应用基因工程技术, 调控目标代谢
物基因表达或上调其转录子功能而达到增加目标
代谢产量的目的, 属于基因和转录因子调控的代
谢工程。
3.2 植物细胞培养提高次生代谢物的潜在途径
形成层分生组织细胞(CMC)培养技术。传统
的植物细胞悬浮培养开始于去分化的愈伤组织培
养, 而愈伤组织起源于植物组织特化细胞类型的
混合, 由于这些细胞起源存在差异性, 可能在细胞
悬浮培养过程中表现出不同的功能, 从而使整个
培养体系不稳定(Roberts和Kolewe 2010)。为避免
培养去分化的异质的混合细胞, Naill和Roberts
(2005)从维管形成层分离出细胞, 并在培养液中增
殖。Lee (2010b)等绕开了去分化过程, 从东北红豆
杉、人参以及银杏中分离到未分化的形成层分生
组织细胞(CMCs), 东北红豆杉CMC的生长速率和
紫杉醇的产量均大大提高、细胞团直径减小、并
且在重复继代培养周期中的生长稳定性显著提
高。作为一项应用的生物生产技术, CMCs的性能
远远优于传统细胞培养技术, 基于CMC的培养技
术应该应用于重要经济价值植物细胞培养中以期
获得更多的天然产物。
提高培养细胞的渗出液。通过提取培养细胞
渗出液获取目标物, 是一种生产植物次生代谢物
相对较新的技术(Cai等2011a)。相比于植物组织,
渗出物是一种相对简单的混合物, 能够减少次生
代谢物后续提取生产的成本, 并且因其不破坏植
物细胞而具有连续性, 因此随着培养时间的延长
可以提高植物化合物的产量。
培养不同大小的细胞聚合体。使用不同大小
聚集体进行培养, 是一种用来研究次生代谢物的
产生与积累的新方法(Wilson和Roberts 2012), 它能
植物生理学报878
够综合考虑细胞积累与培养基之间的相关性。
Kolewe等(2011)用红豆杉悬浮细胞组成的小聚合
体进行培养, 发现经过茉莉酸甲酯诱导细胞所产
生的紫杉醇比用大聚合体培养高20倍。这种途径
的作用机理还有待研究。
以上三种较新的细胞培养提高次生代谢物生
产的途径具有较显著的优越性, 相信在不远的未
来会得到完善并广泛应用。
3.3 存在的不足与建议
虽然通过本文所述不同途径对次生代谢物的
生成与积累进行调节, 能够提高目标次生代谢物
的产量, 但是这些调节途径仍然存在一些问题和
不足, 如添加物对细胞生长的抑制作用, 真菌诱导
子的毒性, 固定化体系中植物细胞的培养密度、
氧气、养分的供应与传递, 两相培养时多聚物吸
收培养基中的有效成分, 生物转化及基因工程应
用时面临次生代谢物多途径及关键酶的复杂性等
问题。针对以上问题, 应该根据目标代谢物的性
质选择合适的途径进行培养, 多种方法相结合以
期达到更好的效果。此外, 目前通过植物细胞培
养生产次生代谢物的方法最终应用于实际工业化
生产仍是很有限的, 可能受到如目标化合物产量
低、生物合成途径没有完全清楚以及相关的提取
纯化技术不成熟等多种因素的影响, 但是笔者认
为最主要的原因在于很多与次生代谢物合成相关
的途径、基因及其控制元件的功能仍不清楚。因
此, 必须利用“组学”的方法, 协同功能基因组学与
代谢组学, 形成一种深入研究植物化学机制的系
统生物学方法, 探索次生代谢相关途径及相关功
能基因。
综上所述 , 对植物细胞培养生产次生代谢
物的研究, 仍然是一项意义重大但又十分艰巨的
任务。
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