全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (12): 1821~1832　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0377 1821
收稿 2014-10-10　　修定 2014-10-29
资助 国家自然科学基金项目(31200520)、江苏省自然科学基金项目(BK2012774)、教育部博士点基金项目(20120097120031)、博士后
科学基金项目(2013M541686)和国家大学生创新创业训练计划(201410307030)。
* 通讯作者(E-mail: zhuangjing@njau.edu.cn; Tel: 025-84395182)。
茶树中两个ERF类转录因子的分离及不同茶树中温度胁迫的响应分析
刘志薇1,2, 熊洋洋3, 李彤1, 严雅君1, 韩洪润1, 吴致君1,2, 庄静1,2,*
南京农业大学1园艺学院, 2茶叶科学研究所, 3生命科学学院, 南京210095
摘要: 茶树作为我国重要的经济树种之一, 受温度胁迫的影响较大, ERF转录因子在调控温度胁迫过程中发挥重要的作
用。本研究通过RT-PCR方法从茶树‘迎霜’叶片的cDNA中克隆得到2个ERF类转录因子基因, CsERF-B1和CsERF-B4。序列
分析表明, CsERF-B1和CsERF-B4分别含有长为474和483 bp的开放阅读框, 编码157和160个氨基酸, 均含有AP2/ERF家族转
录因子典型的保守AP2结合域。进化分析显示, 茶树CsERF-B1和CsERF-B4分别属于AP2/ERF家族ERF亚族的B1和B4组。
通过比对发现, 这两个转录因子与其他物种ERF类蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性, 如拟南芥、猕猴桃、杨树等。在
三级结构上, CsERF-B1和CsERF-B4均有典型的1个α-螺旋和3个β-折叠结构。本文选取三种茶树材料‘迎霜’、‘安吉白茶’、
‘云南十里香’进行不同温度胁迫下CsERF-B1和CsERF-B4的响应分析。利用荧光定量PCR方法分析了CsERF-B1和
CsERF-B4基因分别在高温(38 ℃)和低温(4 ℃)处理0.5、1、2、4、8、12、24和48 h的表达情况。结果表明, CsERF-B1和
CsERF-B4基因均受高低温的诱导表达, 不同的茶树材料, CsERF-B1和CsERF-B4基因表达有显著差异。同属ERF类转录因
子的两个成员在三种具有抗寒性差异的茶树品种中的不同响应, 说明ERF转录因子在茶树温度胁迫调控中起重要作用。
关键词: 茶树; 转录因子; ERF; 进化分析; 温度胁迫; 表达分析
Isolation and Expression Profiles Analysis of Two ERF Subfamily Transcription
Factor Genes Under Temperature Stresses in Camellia sinensis
LIU Zhi-Wei1,2, XIONG Yang-Yang3, LI Tong1, YAN Ya-Jun1, HAN Hong-Run1, WU Zhi-Jun1,2, ZHUANG Jing1,2,*
1College of Horticulture, 2Tea Research Institute, 3College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Tea plant [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] is one of important economic tree species in our country.
Throughout life, tea plants are challenged by various abiotic stresses, including temperature stress. In higher
plants, ERF transcription factors provide important and effective signal regulation in defense temperature stress.
In this study, the CsERF-B1 and CsERF-B4 genes, which encoding to the ERF transcription factor, were cloned
by RT-PCR using cDNA as template, from Camellia sinensis cultivar ‘Yingshuang’. Sequence analysis indicated
that the cDNA of CsERF-B1 and CsERF-B4 had a 474 and 483 bp open reading frame, encoding 157 and 160
amino acids, respectively. Both of the CsERF-B1 and CsERF-B4 contained a conserved AP2 domain, which is
conserved in AP2/ERF family transcription factors. Phylogenetic analysis showed that CsERF-B1 and
CsERF-B4 belong to B1 and B4 group of ERF subfamily of AP2/ERF family transcription factors. Based on
sequence comparison, CsERF-B1 and CsERF-B4 had high homology in amino acid conserved regions with
ERFs from other plants, such as Arabidopsis thaliana, Actinidia deliciosa, Populus trichocarpa, and so on. In
the three-dimension structure, CsERF-B1 and CsERF-B4 had the typical structure with one α-helix and three
β-strands. Three tea plant cultivars ‘Yingshuang’, ‘Anjibaicha’, and ‘Yunnanshilixiang’ were selected to analyze
the expression profiles of CsERF-B1 and CsERF-B4 genes under the different temperature stresses. By quanti-
tative real-time PCR, the expression profiles of the CsERF-B1 and CsERF-B4 genes were detected under high
(38 ℃) and low (4 ℃) temperature stresses, at 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 and 48 h treatments, respectively. Under
high or low temperature stresses, the expression levles of CsERF-B1 and CsERF-B4 genes were induced. The
expression profiles showed difference among the three cultivars of tea plant. The different response of two tran-
scription factors in three tea plant cultivars, belonging to ERF subfamily, indicated that ERF transcription factor
植物生理学报1822
may played important roles in regulation of temperature stress in tea plant.
Key words: Camellia sinensis; transcription factor; ERF subfamily; phylogenetic analysis; temperature stress;
expression profile analysis
植物在生长发育和进化的过程中, 逐渐形成
了复杂的信号转导网络。转录因子(transcription
factors, TFs)不仅参与了多种植物体内与生长发育
相关的信号转导途径, 在由外界胁迫刺激等激活
的信号转导途径中也发挥着关键性的作用(刘强等
2000; Liu 等1999; Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki
2006; Zhuang等2014)。转录因子在调控逆境胁迫
过程中有着多重身份, 既像调控基因表达的分子
开关, 也是逆境信号传递的终点, 最终实现调节逆
境应答基因表达的时序性(Deinlein等2014; Licausi
等2013)。其中ERF (ethylene responsive factor)类
转录因子属于AP2/ERF转录因子家族的亚族之一,
所有成员均含有一个60个氨基酸左右的AP2保守
结合域, 此结构域能与基因启动子顺式作用元件
GCC框结合, 也可以与干旱、低温等非生物胁迫
诱导基因表达相关的CRT/DRE序列结合。此外,
根据结构域氨基酸序列的不同可以进一步将ERF
亚族划分为6个组: B1、B2、B3、B4、B5以及B6
组(Sakuma等2002; Zhuang等2008)。ERF转录因子
在植物体内参与多种生理反应和逆境胁迫响应,
受到乙烯(Chen和Chen 2002)、茉莉酮酸和水杨酸
(Gutterson和Reuber 2004)等的调节, 不仅应答病原
物感染、机械伤害等胁迫, 也应答低温、干旱等
非生物胁迫(Liu等1998; Kagaya等1999; Aharoni等
2004), 在苜蓿和拟南芥中, ERF转录因子还参与植
物蜡质代谢(Zhang和Huang 2010; Chinnusamy等
2003; Onate-Sanchez和Singh 2002; Tournier等
2003)。
随着生活质量的提升, 人们对于兼具营养价
值和保健功效的茶的需求量和品质要求也越来越
高。我国虽然作为茶树的起源地, 但在大部分产
茶区, 低温和高温仍然作为主要环境因素影响茶
产业的发展, 也制约着茶树的分布和种植区域。
近年来, 夏季的高温和春季的“倒春寒”对我国茶叶
生产造成了很大的损失。目前, 对于茶树高低温
等非生物胁迫的研究大多是在生理生化角度的探
讨, 对抗逆的功能性基因的了解相对较少(邹中伟
等2008)。在分子生物学不断发展的今天, 通过分
子生物学技术进一步揭示茶树逆境生理的分子机
制已经成为必然趋势, 对在非生物胁迫中起关键
作用的转录因子的研究具有重要的意义。
茶树属于典型亚热带植物, 性喜暖湿气候, 不
同的茶树品种抗寒性有所差异。‘安吉白茶’ (白叶
茶)原产于浙江安吉, 是一种低温敏感型的茶树变
异品种(谢文钢等2011); ‘迎霜’春季发芽早, 秋冬季
休眠迟, 霜降季节茶芽仍能抽发, 具有较强的抗低
温能力(黄海涛等2012); ‘云南十里香’是昆明地区
的地方良种, 生长势强, 抗寒抗旱(沈晓进2004)。
基于本课题组茶树‘迎霜’的转录组数据, 利用RT-
PCR方法从茶树中分离同属于AP2/ERF转录因子
家族ERF亚族的CsERF-B1和CsERF-B4基因, 并对
其进行了较为详尽的分析, 包括序列比对、进化
树、理化性质、亲/疏水性、无序化特性、二级和
三级结构等。为了进一步分析不同茶树中上述2
个同属于一类的ERF转录因子对温度响应的差异,
选取上述3个抗寒性不同的茶树材料‘迎霜’、‘安
吉白茶’、‘云南十里香’, 利用荧光定量PCR对
CsERF-B1和CsERF-B4基因在高温和低温胁迫下
的表达情况进行了分析, 以期为深入了解茶树温
度胁迫响应机制提供借鉴。
材料与方法
1 试材和胁迫处理
以本实验室种植的茶树[Camellia sinensis (L.)
O. Kuntze] ‘迎霜’ (Camellia sinensis cv.‘Yingsh-
uang’)二年生扦插幼苗为试验材料, 种植于自然环
境下。选一无病害植株 , 摘取幼嫩叶片, 提取总
RNA并合成cDNA, 用于茶树中2个ERF类转录因
子基因CsERF-B1和CsERF-B4克隆。
选取正常3个茶树材料‘迎霜’、‘安吉白茶’
(Camellia sinensis cv. ‘Anjibaicha’)、‘云南十里香’
(Camellia sinensis cv. ‘Yunnanshilixiang’)的二年生
植株分别进行低温(4 ℃)和高温(38 ℃) 2种温度胁
迫的处理。处理在光照培养箱里进行, 温度分别
设置为38 ℃和4 ℃ , 湿度为75%。处理时间有
0.5、1、2、4、8、12、24和48 h, 以未处理的植株
刘志薇等: 茶树中两个ERF类转录因子的分离及不同茶树中温度胁迫的响应分析 1823
作为对照。取茶树幼嫩叶片组织提取RNA并反转
录成cDNA, 用于实时荧光定量PCR。
2 总RNA提取及cDNA合成
根据Quick RNA Isolation Kit (北京华越洋公
司)试剂盒说明书提取RNA, 用微量紫外检测仪
NanoDrop测定提取的RNA样品浓度, 用12 g·L-1变
性琼脂糖凝胶电泳检测相关茶树材料提取的RNA
质量。然后利用Prime Script RT Reagent Kit (大
连TaKaRa公司)试剂盒将提取的RNA反转录成
cDNA。
3 茶树CsERF-B1和CsERF-B4基因的克隆
根据本实验室‘迎霜’转录组数据, 结合测序序
列设计了两对引物, ZJR93: 5-ATGAGGCGAGG-
CAGGGCACC-3、ZJR94: 5-CGGCGTCCGGGG-
G TA C C G C C G - 3 和Z J R 9 5 : 5 - AT G G T C T-
CAGCTCTCACTCAAG-3、ZJR96: 5-AAGAAG-
TTGTGCATAGTG AAG-3, 以‘迎霜’叶片cDNA为
模板分别进行PCR扩增。扩增体系为: 11.9 μL
ddH2O, 2 μL 10×Ex Taq Buffer, 1.6 μL dNTP Mix-
ture (2.5 mmol·L-1), 1.2 μL MgCl2 (25 mmol·L
-1),
1 μL上游引物, 1 μL下游引物, 1 μL模板, 0.3 μL Ex
Taq (5 U·μL-1) 。反应条件为: 94 ℃ 5 min; 94 ℃
30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10
min。用12 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,
并根据DNA回收试剂盒将其回收 , 然后连接到
pMD18-T载体上, 转化至大肠杆菌DH5α。质粒
酶切和鉴定之后送至南京金斯瑞公司测序。
4 序列分析
利用NCBI (美国国立生物技术信息中心)网
站相关程序对核苷酸和氨基酸序列进行了BLAST
比较搜索和保守域预测(http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi) (Schaffer等2001)。借助于序列处理
在线工具包(SMS) (http://www.bio-soft.net/sms/)和
ExPASy-ProtParam (http://web.expasy.org/prot-
param/)分析了相似性较高的不同物种ERF转录
因子的氨基酸组成成分和理化性质。通过MEGA5
(Tamura等2011)软件完成了分子系统发育进化树
的构建。借助D N A M A N 6 . 0软件进行了对
CsERF-B1和CsERF-B4基因推导氨基酸的亲/疏水
性分析和与其他物种各ERF转录因子氨基酸序列
的多重比对。无序化特性分析和二级结构预测则
分别利用Fold Index程序(http://bip.weizmann.ac.il/
fldbin/findex) (Prilusky等2005)和SOPMA程序
(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa) (Combet等
2000)完成。利用Swiss-Model (Arnold等2006)软件
建立了蛋白质空间结构模型, 并在Swiss-Pdb Viewer
软件上编辑生成分析图形。采用Origin 6.0软件制
作荧光定量PCR的数据分析图表。
5 温度胁迫表达分析
按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒(大连TaKa-
Ra公司)操作说明进行实时定量PCR (quantitative
real time RT-PCR)。利用iQ™5 software和 iQ™5
Real- time PCR System完成了RT-PCR。分析各个
样品CT值的相对定量参照基因的ΔΔCT法, 表达差
异等于2–ΔΔCT, ΔCT=CT目标基因 – CT GAPDH, ∆∆CT=(CT目标基因 –
CT GAPDH)处理组 – (CT目标基因 – CT GAPDH)对照组 (Livak和
Schmittgen 2001)。茶树GAPDH基因作为内参基
因, 与目标基因CsERF-B1和CsERF-B4一起扩增,
扩增程序为95℃ 5 min; 95℃ 5 s, 55℃ 30 s, 65℃
10 s, 40个循环。每个样品设3次重复。它们的表
达检测引物分别为ZJR41: 5′-TTGGCATCGTT-
GAGGGTCT-3′、ZJR42: 3′-CAGTGGGAACACG-
GAAAGC-5′, ZJR222: 5′-GAGGAGTGAGAAA-
GAGACCGTGGG-3′、ZJR223: 5′-TCTGGTGG-
T T T T G G A G AT G AT G AT T- 3 ′和 Z J R 2 4 4 :
5′-AACCAATCTCAACCCAGTCAA-3′、ZJR245:
5′-TAAGCAAGTGCTGCTCCTTCA-3′。
实验结果
1 茶树CsERF-B1和CsERF-B4基因的克隆
以‘迎霜’叶片的cDNA为模板 , 以ZJR93、
ZJR94和ZJR95、ZJR96两对引物经PCR扩增分
别得到2个约500 bp的片段。序列测定与分析表
明, 来源于茶树‘迎霜’的CsERF-B1和CsERF-B4基
因分别含有474和483 bp的开放阅读框, 编码157和
160个氨基酸(图1)。将CsERF-B1和CsERF-B4基因
序列提交到GenBank, 获得登录号分别为KM872100
和KM872101。
2 茶树CsERF-B1和CsERF-B4转录因子的进化分析
将本文克隆得到的2个茶树ERF类转录因子,
即CsERF-B1和CsERF-B4, 同时与拟南芥AP2/ERF
家族转录因子进行同源性比对, 绘制进化树。结
植物生理学报1824
果表明, CsERF-B1和CsERF-B4在进化关系上分别
属于AP2/ERF家族转录因子中的ERF亚族中的B1
和B4组(图2)。
3 茶树CsERF-B1和CsERF-B4转录因子氨基酸序
列比对及理化性质分析
利用BLAST-Conserved Domains Search对
茶树CsERF-B1和CsERF-B4转录因子分别进行保
守域预测, 结果如图3-A所示。茶树CsERF-B1在
30~60氨基酸位点之间含有AP2保守结合域 , 而
CsERF-B4的AP2保守域在55~85氨基酸位点之间,
均具有AP2/ERF家族转录因子中ERF亚族的典型
特征。为进一步分析茶树CsERF-B1和CsERF-B4
转录因子的保守结合域, 将其推导的氨基酸序列
与拟南芥ERFB1和ERFB4的部分转录因子AtER-
FB1-ERF3 (AT1G50640.1)、AtERFB1-ERF7
(AT3G20310 .1 )、AtERFB1-ERF9 (AT5G-
44210.1)、AtERFB1-ERF10 (AT1G03800.1)、
AtERFB1-ERF12 (AT1G28360.1)、AtERFB4-
ERF113 (AT5G13330.1)、AtERFB4-ERF114
(AT5G61890 .1)、AtERFB4-ERF115 (AT5-
G07310.1)、AtERFB4-RAP2.6 (AT1G43160.1), 以
及与茶树CsERF-B1和CsERF-B4转录因子高度相
似的多个物种的ERF的氨基酸序列进行多重比
对。从图3-B中可以看出, 它们的AP2结合域很相
似, 不仅在N-端都具有保守的YRG和WLG元件,
一些与DNA相互作用有关的关键二级结构区域也
相当保守, 如α-螺旋、β-转角、β-折叠等。其中3
个反向平行的β-折叠位于N-端, 由18个氨基酸残
基组成的核心序列形成的α-螺旋则在C-末端。此
外, 在AP2结合域的第14位和第19位分别是保守
的丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)。
对上述植物ERF转录因子推导的氨基酸进行
了组成成分和理化性质分析(表1)。 由表1可见, 各
个植物氨基酸残基数在157~263之间不等, 相对分
子质量为(1.7~2.9)×104 Da。理论等电点(pI)差异较
大, 其中茶树CsERF-B1的pI值最大为11.55, 大豆的
图1 茶树CsERF-B1 (A)和CsERF-B4 (B)基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Fig.1 Full-length sequences of CsERF-B1 (A) and CsERF-B4 (B) cDNA and
its deduced amino acid sequences from Camellia sinensis
图中下划线标注的氨基酸序列为AP2结构域。
刘志薇等: 茶树中两个ERF类转录因子的分离及不同茶树中温度胁迫的响应分析 1825
pI值最小为5.37。碱性氨基酸和酸性氨基酸的含
量分别在15%和12%左右, 差异不大。芳香族氨基
酸和脂肪族氨基酸的含量分别在8%和13%左右,
后者明显多于前者。蛋白质可溶性预测中主要平
均疏水特性(GRAVY)在–0.461~–1.110之间。
4 茶树CsERF-B1和CsERF-B4转录因子推导的氨
基酸亲/疏水性和无序化分析
利用DNAMAN6.0软件对茶树CsERF-B1和
CsERF-B4转录因子推导的氨基酸序列进行了疏
水性/亲水性分析, 为预测其组成蛋白的稳定性提
供依据。结果如图4所示, 茶树CsERF-B1和CsERF-
B4转录因子亲水性最强的位点分别是第35位的缬
氨酸(Val)和第73位的脯氨酸(Pro), 疏水性最强的
位点分别是第58位的亮氨酸(Leu)和第2位的缬氨
酸(Val)。总体来说, 这两个转录因子的氨基酸大
部分均属于亲水性氨基酸。
此外 , 氨基酸序列折叠的无序化分析显示
(图5): CsERF-B1和CsERF-B4的氨基酸序列中均
有3个无序化区域, 分别含146和113个氨基酸, 无序
化比例分别为92.99%和70.63%。显然, 二者无序
化程度均比较明显。
5 茶树CsERF-B1和CsERF-B4蛋白的二级和三
级结构预测与分析
利用SOPMA程序对茶树CsERF-B1和CsERF-B4
图2 茶树CsERF-B1和CsERF-B4转录因子的进化分析
Fig.2 Phylogenetic analysis of the CsERF-B1 and CsERF-B4 transcription factors from tea plant
植物生理学报1826
转录因子全序列的二级结构进行了预测 , 发现
CsERF-B1和CsERF-B4蛋白分别由15.29%和
28.12%的α-螺旋 (α-helix), 10.83%和6.88%的β-折
叠(β-extended strand), 3.18%和3.75%的β-转角
(β-turn)以及70.70%和61.25%的随机卷曲(random
coil)组成。其中随机卷曲结构是CsERF-B1和
CsERF-B4蛋白的主要组成部分, 而α-螺旋和β-折
叠则散布于蛋白序列中。
本文克隆的茶树 CsERF-B1和CsERF-B4转录
因子均与拟南芥AP2/ERF家族中的AtERF1转录因
子的DNA结合域相似度最高。在结合域的α-螺旋
和β-折叠部位, CsERF-B1与AtERF1的差异位点有
6个, 其中4个位点在α-螺旋, 2个位点在β-折叠;
CsERF-B4与AtERF1的差异位点有4个, 其中3个位
点在α-螺旋, 1个位点在β-折叠(图6)。以AtERF1
(PDB ID:3gcc)为模型 , 分别对CsERF-B1和
CsERF-B4进行蛋白质三级结构建模分析, 由图6可
知, AtERF1、CsERF-B1和CsERF-B4的三级结构
非常相似, 均有1个α螺旋、3个β折叠(β1~β3)和
WLG结构单元, 上述氨基酸位点的差异对其空间
结构的影响不大。
6 茶树CsERF-B1和CsERF-B4基因在高低温胁迫
下的表达情况
利用实时定量PCR检测了在高温(38 ℃)、
低温(4 ℃) 2种处理下, 茶树CsERF-B1和CsERF-B4
基因分别在‘迎霜’、‘安吉白茶’、‘云南十里香’ 3
个品种中的表达情况。如图7所示, CsERF-B1和
CsERF-B4基因在茶树高低温处理下均有响应, 但
在不同品种间有所差异。
在‘迎霜’中, 38 ℃处理下时茶树CsERF-B1和
图3 茶树CsERF-B1和CsERF-B4转录因子基因保守域(A)及与其他物种氨基酸序列的多重比对(B)
Fig.3 The conserver domain of CsERF-B1 and CsERF-B4 transcription factors (A) and alignment of amino acid sequences from
tea plant and other different plants (B)
刘志薇等: 茶树中两个ERF类转录因子的分离及不同茶树中温度胁迫的响应分析 1827
CsERF-B4基因变化不太明显, 大多时段表达受抑
制, 均在48 h时段达到最大值, 分别为对照的1.8
和14倍; 4 ℃处理下, CsERF-B1和CsERF-B4基因
分别在1和4 h时段表达量最高, 为0 h的4.9和29.8
倍(图7-A和B)。对于‘安吉白茶’来说, 当受到高
温胁迫时, CsERF-B4基因的表达量激增, 在24 h
达到了对照的106倍, 而CsERF-B1基因的表达量
只有在24 h时高于对照, 为对照的57.8倍; 当低温
胁迫时, CsERF-B1和CsERF-B4基因在大多数时段
表达量显著增加, 且CsERF-B4基因的表达量的增
加程度明显大于CsERF-B1基因(图7-C和D)。当
‘云南十里香’处于38 ℃高温处理下, CsERF-B1基
因的表达完全被抑制, CsERF-B4基因在24 h时表
达量高于对照 , 为0 h的21倍 ; 在4 ℃处理下 ,
CsERF-B1基因在处理0.5和12 h时表达量显著高于
对照, 分别为对照的1.8和3.2倍, CsERF-B4基因在
处理2和4 h时表达量显著高于对照, 分别为对照的
3.9和1.9倍(图7-E和F)。
讨　　论
茶树生存在自然界的开放体系, 极易受到低
温、高温等恶劣环境的伤害, 进而直接影响茶叶
表1 不同植物中ERF家族转录因子的氨基酸理化性质分析
Table 1 Analysis of physical and chemical characterization of amino acid sequences of ERF transcription factors among the differ-
ent plants
来源植物 氨基酸名称 登录号 氨基酸数目 相对分子量/Da 理论等电点(PI)
茶树(Camellia sinensis) ERF-B1 KM872100 157 17 369.4 11.55
茶树(Camellia sinensis) ERF-B4 KM872101 160 18 104.4 9.92
拟南芥(Arabidopsis thaliana) ERF3 AT1G50640.1 225 25 216.1 9.23
拟南芥(Arabidopsis thaliana) ERF115 AT5G07310.1 263 29 405.7 6.52
烟草(Nicotiana tabacum) ERF6B BAJ72666.1 242 26 096.5 9.17
柿子(Diospyros kaki) ERF7 AFH56414.1 219 24 084.7 7.26
猕猴桃(Actinidia deliciosa) ERF9 ADJ67438.1 210 23 053.8 8.72
番茄(Solanum lycopersicum) ERF NP_001239044.1 240 26 357.2 7.73
矮牵牛(Petunia × hybrida) ERF8 ADP37423.1 217 23 975.7 8.30
马铃薯(Solanum tuberosum) ERF4 AEM63545.1 223 24 603.4 8.78
大豆(Glycine max) ERF5 AEX25891.1 211 23 173.6 5.37
棉花(Gossypium hirsutum) ERF AAZ83347.1 225 25 076.7 8.53
杨树(Populus trichocarpa) AP2/ERF XP_002304640.1 234 26 119.6 5.93
苹果(Malus domestica) AP2/ERF ADE41119.1 245 27 054.6 6.32
苜蓿(Medicago truncatula) RAP2.6 XP_003602747.1 261 29 671.3 6.00

来源植物
碱性氨基酸 酸性氨基酸 芳香族氨基 脂肪族氨基
总平均疏水性
比例/% 比例/% 酸比例/% 酸比例%
茶树(Camellia sinensis) 18 7 8 11 –0.893
茶树(Camellia sinensis) 16 8 9 16 –0.823
拟南芥(Arabidopsis thaliana) 16 12 8 14 –0.783
拟南芥(Arabidopsis thaliana) 11 10 12 9 –1.110
烟草(Nicotiana tabacum) 14 10 7 16 –0.461
柿子(Diospyros kaki) 16 13 8 12 –0.757
猕猴桃(Actinidia deliciosa) 17 13 8 13 –0.671
番茄(Solanum lycopersicum) 16 12 8 13 –0.753
矮牵牛(Petunia × hybrida) 14 12 7 15 –0.725
马铃薯(Solanum tuberosum) 15 12 8 14 –0.723
大豆(Glycine max) 14 15 8 14 –0.722
棉花(Gossypium hirsutum) 18 15 8 11 –0.904
杨树(Populus trichocarpa) 11 11 10 11 –0.924
苹果(Malus domestica) 12 11 8 11 –0.877
苜蓿(Medicago truncatula) 13 12 9 11 –1.033
植物生理学报1828
的产量和品质(童启庆2007)。植物体内的转录因
子参与调控低温、高温等非生物胁迫, 有助于降
低逆境胁迫伤害, 增强植株的抗逆性(张计育等
2012; Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki 2006)。因
此, 通过揭示茶树转录因子的结构和功能, 转录因
子之间及其与DNA之间相互作用的机制, 调控转
录因子基因的表达, 控制受转录因子调节的一系
列功能基因, 深入解析茶树逆境调控机制, 对于实
现综合改良茶树抗寒抗热性深具意义。
本研究通过RT-PCR方法从‘迎霜’叶片cDNA
中克隆出来的CsERF-B1和CsERF-B4基因, 都有一
个包含保守元件YRG和WLG的典型AP2结合域。
在它们的AP2结合域均含有14A (丙氨酸)和19D
(天冬氨酸), 而这两个氨基酸决定了转录因子结合
不同的顺式作用元件(Sakuma等2002)。N-端部分
有3个反向平行的β-折叠结构, 在识别顺式作用元
件时具有重要作用; C-末端的由18个氨基酸残基
组成的核心序列形成的双亲α-螺旋, 可能参与同
其他转录因子或DNA的相互作用(Allen等1998)。
这两个转录因子的AP2结合域的三维结构均与
AtERF1的相似度最高。CsERF-B1和CsERF-B4的
氨基酸序列无序化比例分别为92.99%和70.63%,
图4 茶树CsERF-B1和CsERF-B4氨基酸序列疏水(A)、亲水(B)性质分析
Fig.4 Analysis of hydrophilicity (A) and hydrophobicity (B) of CsERF-B1 and CsERF-B4
实线代表CsERF-B1; 虚线代表CsERF-B4。
刘志薇等: 茶树中两个ERF类转录因子的分离及不同茶树中温度胁迫的响应分析 1829
前者无序化程度明显大于后者。由于蛋白固有无
序化是反映蛋白质功能的一个重要指标, 在植物
体内起着重要的生理作用(Goldgur等2007)。这可
能也是造成这两个转录因子在生理功能、胁迫响
应上差异的原因之一。
为了进一步明确茶树CsERF-B1和CsERF-B4
转录因子基因在高低温胁迫下的响应, 选取了‘迎
霜’、‘安吉白茶’和‘云南十里香’等3个不同茶树品
种通过荧光定量PCR方法进行了分析 (沈晓进
2004; 谢文钢等2011; 黄海涛等2012)。结果表明,
图5 茶树CsERF-B1 (A)和CsERF-B4 (B)折叠状态的分析
Fig.5 Analysis of the folding state of CsERF-B1(A) and CsERF-B4 (B)
数值正负分别表示蛋白的有序和无序状态; 下划线标注的为有序状态氨基酸, 无下划线标注的为无序状态氨基酸。
图6 茶树CsERF-B1和CsERF-B4蛋白的三维结构预测
Fig.6 The three-dimension structures of CsERF-B1 and CsERF-B4 transcription factors from tea plant
植物生理学报1830
图7 不同品种茶树CsERF-B1和CsERF-B4基因在高低温处理下的表达情况
Fig.7 Expression profiles analysis of the CsERF-B1 and CsERF-B4 genes under high and low temperature treatments in three tea
plant cultivars
A和B: ‘迎霜’, C和D: ‘安吉白茶’, E和F: ‘云南十里香’; A、C和E为CsERF-B1基因, B、D和F为CsERF-B4基因; 不同小写字母表示在
0.05水平上差异显著性。
刘志薇等: 茶树中两个ERF类转录因子的分离及不同茶树中温度胁迫的响应分析 1831
CsERF-B1和CsERF-B4基因的表达均受高低温的
影响, 总体来看, 在4 ℃处理下, CsERF-B1和CsERF-B4
基因大都表现为上调, 趋势的变化为先升后降, 在
‘迎霜’中表达量上调的程度明显大于‘安吉白茶’和
‘云南十里香’, 这与‘迎霜’耐低温性能较强相吻合
(黄海涛等2012)。在38 ℃处理下, CsERF-B1基因
的表达基本被抑制, 而CsERF-B4基因的表达量相
对来说较高些, 尤其在‘安吉白茶’中, CsERF-B4基
因相比于对照的表达量要高出许多, 说明CsERF-B4
基因在高温胁迫下可能比CsERF-B1基因起到更大
的作用。
已有研究证实 , 甘蓝型油菜中部分同属于
AP2/ERF家族中DREB亚族的转录因子可以被分
为两组, 在非生物胁迫时, 两组转录因子成员存在
相互调控的关系来响应胁迫信号(Zhao等2006)。
目前, 已从不同的植物种类中克隆了许多ERF转录
因子基因, 大都与生物/非生物胁迫相关, 本文克隆
出来的茶树两个ERF转录因子基因也参与茶树的
抗高温、低温胁迫过程, 这与陈林波等(2011)的研
究结果相似。此外, 吴致君等(2014)从茶树体内克
隆出ERF-B3转录因子基因, 并证明其参与调节高
低温等非生物胁迫。本研究通过荧光定量PCR发
现, 在不同的温度胁迫下, 不同组的ERF蛋白基因
表达量差异明显, 同时与品种抗寒性密切相关。
鉴于ERF转录因子在茶树体内的重要性和功能的
复杂性, 对其机制的研究在内容和技术手段上都
需要进一步深入。
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